专利名称：山羊痘疫苗株表达载体的制作方法
技术领域：
本发明提供一种用于在重组山羊痘病毒中表达外源蛋白的表达载 体，属于生物技术领域。
背景技术：
现代分子生物学的发展，使人们能够操纵各种生物的基因，掌握了在 细菌质粒中克隆、重组DNA的技术，从而大大扩展了人们制作疫苗的方 法，研究出了多种基因疫苗来防治动物疫病，病毒载体活疫苗就是其中之
很早以前，人们在同天花斗争的过程中，就对于痘病毒具有坚强免疫 保护的能力有了深刻的认识。了解到痘病毒是动物病毒中最大的病毒，在 光学显微镜下即可看见。在电子显微镜下，病毒呈砖形外观。病毒基因组 由单分子双链DNA组成，G+C含量的32o/^4"/。。基因组长度为B0-380kb。
病毒最主要的成分是蛋白质，脱氧核糖核算酸和类脂，聚丙烯酰胺凝胶电 泳分析病毒粒子显示有100多种包括结构蛋白、翻译mRNA的酶及RNA合 成、DNA复制等相关酶在内的病毒相关蛋白。现在人们进一步发现痘病 毒在复制过程中存在着同源序列重组现象，而且在痘病毒的基因组中存在 着许多病毒复制非必需区域，所以人们可以首先将病毒复制的非必需区克 隆到细菌质粒中，再把启动外源基因的启动子(由于痘病毒利用自己的 RNA聚合酶在感染宿主细胞的细胞浆中复制，因此必须用痘病毒的启动
子)插入非必需区，构建成重组表达载体，然后把要表达的外源基因插入 到已经在病毒复制非必需区中的启动子下游，得到重组表达质粒，利用此 质粒与病毒亲本在细胞内复制时发生同源重组，即可获得表达外源基因的 重组病毒。将此重组病毒免疫动物时，病毒在动物体内复制过程中则可表 达携带的外源基因，刺激动物机体产生对外源蛋白的特异性免疫反应，因 此可作为重组活载体疫苗用于人和动物的疾病防治。目前，痘苗病毒(Vaccinia vims VV)的基因组序列已经明确，因此作为承载外源基因的载 体，它是最早应用也是应用最多的病毒载体。欧洲国家于80年代后期研制 的以痘苗病毒为载体的狂犬病重组疫苗在野外的成功应用，已经使这些 地区的野生动物狂犬病得到了有效的控制。
目前为止，已经有多种类型的具有生物活性的蛋白质在重组w中得 到表达，而由此获得的表达各种病原的重组vv成为预防与治疗人与动物 多种传染性疾病乃至肿瘤的重组活载体疫苗。但由于vv感染广泛的宿主 范围和个别个体接种VV后产生的副反应，尤其是免疫缺陷个体接种VV后 产生病毒血症而有扩散病毒的危险。所以，以VV为载体的重组疫苗的安 全性引起了人们越来越多的担忧。因此逐渐开始转用宿主特异性更强的其 他痘病毒作为活疫苗的载体。例如痘病毒科禽痘病毒属中只感染禽类的鸡 痘病毒、金丝雀病毒等。
FPV虽然仅对对哺乳动物细胞产生流产性感染，而能表达提呈外源抗 原，作为替代痘苗病毒(VV)的哺乳动物非复制型表达载体来应用具有 较大潜力，但对于实际用于牛羊等反刍动物疫苗载体的可能性和应用效果 上需做更多的工作。
和痘苗病毒一样，羊痘病毒基因组较大，有表达多个外来基因的潜 力，且将外来基因插在羊痘病毒的非编码区，既不影响其复制也不会影响 其抗原性。同时羊痘病毒自然条件下只感染牛羊等反刍动物类(这种意义 上的感染指能产生感染性病毒粒子的感染)，而对人和其它哺乳动物无传 染性。弱毒疫苗的实践证明，病毒释放到环境中也不传播给其他动物。因 此作为用于牛、羊等重大传染病重组疫苗的载体，比痘苗病毒更安全性和 其他无与伦比的优点。又由于培育这些疫苗株具有很好的免疫原性。也使 得他们成为构建重组疫苗的理想载体。故引起了预防兽医学领域的重视。
羊痘病毒基因组结构与复制特性与W有着许多相似之处，故可以用 构建VV载体的策略构建CPV载体。Taylor等构建的LSDV表达载体已经重 组表达了狂犬病毒糖蛋白基因和血凝素基因，分别能保护哺乳动物免受相 应病原的攻击。
目前从绵羊、山羊和牛中分离的羊痘病毒都有一个相同的主要中和位点，感染某一株病毒的康复动物对其他病毒的感染具有抗性，绵羊和山羊 以一株痘苗病毒免疫后，可以抵抗所有田间毒株的感染，不论感染毒株来 源于亚洲或非洲。随着羊痘疫苗特别是弱毒疫苗在我国的应用，大部分 地区的羊痘得到了有效的控制。但是为了预防羊痘的发生，该地区每年要 对羊群至少进行一次羊痘活疫苗的免疫，加上其他疫病的免疫，羊的防疫 要花更多的时间和更高的成本。研制以羊痘病毒弱毒疫苗株为载体的如口 蹄疫、蓝舌病等其他严重威胁养羊业的重大疫病或者其他外来疫病的羊痘 病毒二价或多价活疫苗，这样在不增加防疫成本的情况下，达到一次免疫 预防两种或多种疫病的目的，这不仅对于当地的畜牧业生产，而且对于提 高疫区动物抵御外来疫病的综合能力，确保国家生物安全方面也具有重要 意义。
发明内容
本发明旨在构建山羊痘病毒(GTPV)疫苗株G14-TSV44-55表达载
体，开发以山羊痘病毒为活载体的各种病毒，细菌和寄生虫的重组疫苗， 从而能够使GTPV表达其他病原的抗原蛋白，构建山羊痘病毒二价或多价
活疫苗，达到打一针防两病或多病的目的，降低畜牧业的生产成本，减轻 劳动强度，提高经济效益。
本发明的方案是这样实现的
一种用于在重组山羊痘病毒中表达外源蛋白的表达载体，其特征在 于，在表达载体中的VVIlL启动子如序列表中的〈21O10或VVPll启动子 如序列表中的<210>11下游，插入外源基因，通过与山羊痘病毒亲本株同 源重组获得12个表达外源蛋白的重组羊痘病毒。
这些载体中，能与山羊痘病毒亲本株发生同源重组的侧翼序列是山羊 痘病毒G1^STV"4^55疫苗株，含TK基因序列如序列表中的《101,含 IFNR- Y基因序列如序列表中的<210>7或含肌小亚基基因序列如序列表中 的<210>4。
这些载体中，用于调控外源基因的启动子是人工合成的。 用于这些载体中表达的外源基因可以是病毒、细菌和寄生虫的抗原基 因、致病基因，肿瘤相关抗原基因，人、畜、禽免疫调节基因以及其它动物的免疫基因。
本发明的优点和积极效果为
1、 痘疫苗株TK基因为侧翼序列的表达载体不但可以与本株亲本发生
同源重组，而且可以与其他山羊痘毒株发生同源重组，可根据需要构建具
有不同生物学特性的重组CTPV毒株。
2、 通过含有GPT报告基因的的表达载体构建的重组病毒，可以通过
在霉酚酸存在的条件下，收获病变细胞，传代纯化，即可筛选出重组病 毒，同时用PCR方法检测。
利用这些表达载体可以根据不同的目的，构建表达不同外源蛋白的重 组山羊痘病毒，这些重组病毒既可以作为重组活载体疫苗，用于不同疾病 的防治，也可以作为研究不同生物活性蛋白质的表达、加工、结构与功能 的关系研究工具。
图1所示的为报告基因GPT及VV7.5启动子的克隆过程。具体方法是用 Xhol和Notl同时消化质粒PLSEG ，回收小片段并将其连接到PBS-T载体 上，通过核苷酸序列测定鉴定丫￥7.5启动子的方向。
图2所示的是TK基因，RR小亚基基因,Y-IFN受体基因的克隆过程。 具体方法是用PCR方法在病毒基因组上扩增以上三个基因及侧翼序列，琼 脂糖凝胶电泳回收目的片段，并将其连接到PGM-T载体上，通过核苷酸序
列测定鉴定其正确性。
图3所示的是将启动子与报告基因串联成报告基因启动子复合DNA片
段的克隆过程。具体是用包含VVI1L或VVP11启动子的搭接引物，用搭 接PCR的方法从质粒PBS-7.5-GPT上PCR扩增而获得四个报告基因启动子 复合DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，并将其连接到PGM-T载体
上，通过核苷酸序列测定鉴定其正确性。
图4所示的是将启动子报告基因复合DNA片段插入TK基因的过程。具 体是用Acc65I消化质粒PGM-TK,回收后用KlenowF,en琳平末端，并 用碱性磷酸酶去磷酸化。用ECORI消化含有四个复合DNA片段的质粒， 回收小片段补平处理后，与PGM-TK相连。图5所示的是将启动子报告基因复合体插入RR基因的过程。具体是用 Bgl n消化质粒PGM-RR，回收后用KknowFragment补平末端，并用碱性磷 酸酶去磷酸化。用ECORI消化含有四个复合DNA片段的质粒，回收小片 段补平处理后，与PGM-RR相连。
图6所示的是将启动子报告基因复合体插入Y-IFN受体基因的过程。 具体是用PmeI消化质粒PGM-Y-IFNR，回收用碱性磷酸酶去磷酸化。用 ECORI消化含有四个复合DNA片段的质粒，回收小片段后用Klenow Fragment^卜平末端，与PGM-TK相连。
本发明中的TK基因是指胸腺嘧啶核苷激酶基因，由534bp构成，山羊 痘病毒疫苗株的TK基因位于其基因组的中央保守区，其核苷酸序列如序 列表中的<210>1中的<222>(936)~(1469)所示。
本发明中的RR基因是指核糖核酸还原酶基因，包括966bp，山羊痘病 毒疫苗株的RR基因位于其基因组的末端区域，其核苷酸序列如序列表中 的<210>4中的<222>(932)~(1897)所示。
本发明中的Y -IFNR基因是指Y -干扰素受体基因基因，含有828 bp， 中国山羊痘病毒疫苗株的Y-IFNR基因位于其基因组的末端区域，其核苷 酸序列如序列表中的<210>7中的<222>(833)~(1670)所示。
本发明中的VVI1L和WP11启动子是国外鉴定发表的，有上海生物工 程公司合成的，其核苷酸序列分别如序列表中的<210>10和<210>11。 7.5启 动子是指痘苗病毒7.5早晚期启动子。
本发明中的GPT报告基因是指大肠杆菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基 转移酶基因。 具体鄉方式s
实施例；
下面通过表达载体的构建与应用方法叙述本发明的实例 (一)DNA重组基本方法
1.大肠杆菌感受肽细胞的准备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备，采用氯化钙制备法，具体方法参照萨姆 布鲁克J,拉塞尔DW.著黄培堂,王嘉玺，朱厚础等译，〈〈分子克隆实验指南〉〉.第3版译，北京:科学出版社，2002: 96-98。采用O.l mol/L mgcl2和0. lmoi/LCaC12。按4:1混合清洗。感受态细胞的转化方法，参照上述参考文 献进行。
2. 质粒的小量制备(除有特殊说明外，试剂配置均参照《分子克隆实 验指南》.第3版译，北京:科学出版社，2002)
参照黄培堂等译《分子克隆实验指南》.第3版译，北京:科学出版社, 2002.27-32。采用碱裂解法制备，用PEG沉淀法纯化。具体操作方法如 下离心收获经质粒转化，培养的菌体后，加入200UL的溶解液I悬浮沉 淀。加入2倍体积的溶液II裂解轻轻振摇，加入1.5倍体积的溶液IH振摇混 匀，冰上静置5min，离心5min后取上清于另以离心管中，用等体积的饱合
酚或酚氯仿，抽提一次，吸取上层液于另一离心管中，然后用2倍体积 的无水乙醇1200转/min5min沉淀DNA，再用70%乙醇洗涤沉淀一次，凉 干，最后溶于TE或去离子水(pH8.0)中备用。
3. 质粒的限制性内切酶消化与DNA片段的回收
质粒的限制性内切酶消化均采用下列反应条件进行每微克质粒 DNA用5单位的限制性内切酶消化，加1/10体积的限制性内切酶缓冲液，
用无菌双蒸水补足反应所需的体积，按所用的限制性内切酶生产厂商推荐 的反应温度水浴作用2-3小时。消化后的质粒采用琼脂糖电泳分开，然后 用DEAE-纤维素膜离心主法回收。具体方法参照黄培堂等译《分子克隆实 验指南》.第3版译，北京:科学出版社^002
4. 线形质粒的末端补平、去磷酸化和DNA片段连接 酶切后线形质粒的粘性末端补平采用幻enow Fragment酶补平，具体操
作参照黄培堂等译《分子克隆实验指南》.第3版译，北京:科学出版社， 2002.。或按照酶生产商推荐的方法进行。经KLENOWFRAGMENT酶补平 后，线形质粒的平末端的去磷酸化，釆用小牛碱性磷酸酶(CIP)，具体 操作参照黄培堂等译《分子克隆实验指南》.第3版译，北京:科学出版社, 2002.。去磷酸化反应后，CIP的灭活采用5mmol/LEDTA (PH8.0)存在 下，75OC加热10mk。然后用酚氯仿抽提除去CIP，乙醇沉淀去磷酸化 后的线形质粒，溶于灭菌双蒸水中，用于连接反应。本发明中也采用将JII切产物直接按酶供应商推荐的方法补平末端，去磷酸化后，立即做琼脂糖
凝胶电泳，用DEAE-纤维素膜离心柱法回收目的片段，用于连接，也取得 了较好的效果。
线形质粒与目的DNA片段的连接反应按PROMEGA公司提供的T4DNA 连接酶推荐的条件进行。粘性末端的连接按质粒载体目的DNA片段的 摩尔比-l: 2-10，酶的量为5单位/微克DNA， 160C连接124"16小时。平末 端的连接采用质粒载体目的DNA片段1: 2-10的比例，酶的量为粘性末 端的3倍，160C，连接20-24小时，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细 胞。
5.重组质粒的筛选与鉴定
将连接反应产物转化感受态细胞，涂与含抗生素的平板上过夜培养， 挑选单个菌落，接种10mlLB培养基中，振摇培养10-12小时，然后参照黄 培堂等译《分子克隆实验指南》.第3版译，北京:科学出版社，(2002.)第 27-32介绍的碱裂解法小量制备质粒，用PCR法或酶切法鉴定重组结果，进
一步测序鉴定连接的方向。
(二) CTPV表达载体构建方法
实验所涉及的药品限制性内切酶购自Promega公司和上海Sangon公 司，Taq酶购自北京Tangen公司，T4DNA连接酶购自北京Promega公司； 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京百泰克公司；IPTG、 X-gal试剂及抗 生素、购自上海Sangon公司。具体实验操作依据[美J.萨姆布鲁克D.W.拉
塞尔的《分子克隆实验指南》和实例一所述的操作方法。
1. GTPV的全基因组的获得
取山羊痘冻干苗一瓶，加入10mLDMEM液配成l: 10的悬液，按培养 液1/10的量接种单层绵羊睾丸细胞，振摇混匀后置37'C， 5y。的C02培养箱 中培养。2 8d内出现细胞病变收集毒毒液，-20°(:/371:反复冻融三次， 提取病毒基因组。具体按照北京百泰克生物技术有限公司的病毒基因组提 取试剂盒推荐的提取方法，提取病毒基因组。
2、 三个非必需区基因及侧翼序列的获得
参考GenBank上发表的GTPV与SPPV的序列，设计引物，PCR扩增目的基因。它们是-
1^基因及其侧翼序列如序列表中的<210>1,扩增引物如序列表中的< 210>2和<210>3;
肌小亚基基因及其侧翼序列如序列表中的<210>4，扩增引物如序列 表中的<210>5和<210>6;
Y-11^受体基因及其侧翼序列如序列表中的<210>7，扩增引物如序列 表中的<210>8和<210>9;
引物由上海生工生物工程有限公司合成。
3、 三个非必需区基因及侧翼序列.的克隆测序
三个非必需区基因及侧翼序列经PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶电 泳，用DEAE^纤维素膜离心主法回收。用北京天根生物有限公司生产的克 隆载体PGEM-T载体，PROMEGA公司的T4-DNA连接酶(10U/ 1)，将PCR扩 增片段与克隆载体PGEM-Tvector进行连接。转化、摇菌后，经酶切鉴定 的阳性重组克隆进行测序鉴定。得PGM-TK; PGM-RR; PGM-IFN三个克 隆.
4、 调空外源基因的启动子的选择与获得
因为痘病毒有其自己的RNA聚合酶，所以必须在自身的启动子控制下 才能表达蛋白，但目前尚无GTPV自身的启动子，实验证明其同一科的痘 苗病毒(VV)启动子在基因转录，调空机制上与GTPV的相似性，故本发 明中调空外源基因启动子采用文献报道的，国外已经鉴定发表的VVI1L启 动子如序列表中的〈10M0和WP11启动子如序列表中的《1011，具体获
得过程是生物公司合成。
5、 VV7.5启动子调控的报告基因GPT如序列表中的《1018的克隆与
测序
用XhoI和NOtI消化PLSEG,琼脂糖凝胶电泳回收其中的小片段，然后 将其插入质粒PBS-T的XhoI位点与NOtI位点之间，然后转入感受态细胞， 挑取单菌落摇菌提取质粒，酶切鉴定正确后，做LB固体培养基穿刺管， 送上海Sangon公司测序。
6、 WI1L和WP11启动子与报告基因的连接采用搭接PCR的方法将启动子分别与报告基因GPT的W7.5启动子方 向相反连接起来。PCR引物的设计是将VVI1L和VVPU的反向互补序列的 5'端加上外源基因的插入位点Xho1,与7.5K"GPT片段的上游引物或下游引 物连接作为搭接PCR的上游引物如序列表中的《1012和〈10〗3，或下游 引物如序列表中的<210>15和<210>16，用公用的下游引物如序列表中的< 210〉14，或上游引物如序列表中的<210>17。具体操作是以质粒PBS 7.5K-GPT为摸板，用含有VVI1L或VVP11启动子的上游引物或下游引物与公用 的下游引物或上游引物做搭接PCR,得到1仏-7.5-0打，Pll-7.5-GPT以及7. 5-GPT-IlL， 7.5-GPT-Pll。
7、 四个复合DNA片段的克隆测序。
经PCR扩增得到的IlL-7.5-GPT， Pll-7.5-GPT和7.5"GPT-IlL, 7.5^GPT-Pll四个复合DNA片段经琼脂糖凝胶电泳，用DEAE"纤维素膜离心主法回 收。用北京天根生物有限公司的克隆载体PGEM-T, PR0MEGA公司的T4-DNA连接酶(10U/ 1)，将PCR扩增片段与克隆载体PGEM-T vector进行连
接。转化、摇菌后，经酶切鉴定的阳性重组克隆进行测序鉴定。得到了质 粒PGM-IlL-7.5-GPT， PGM-Pll-7.5-GPT和PGM國7,5誦GPT-IlL， PGM-7.5-GPT -Pll。
8、 将启动子，报告基因复合DNA片段插入非必需区TK基因中。 用Acc65I消化质粒PGM-TK,回收后用幻enowFragment补平末端，并
用碱性磷酸酶去磷酸化。用EcoRI消化质粒PGM-IlL-7.5^GPT， PGM-P11-7. 5-GPT和PGM-7.5"GPT-IlL, PGM-7.5<}PT -P11回收小片段做补平处理后， 用PROMEGA公司的T4-DNA连接酶(10U/ 1),与PGM-TK相连，得到PGM-TK-LlL-7.5-GPT， PGM-TK-P11-7,5^GFI^PGM-TK-7.5"GPT-I1L , PGM-TK -7.5-GPT-Pll。
9、 将启动子，报告基因复合体片段插入非必需区RR基因中。 用Bgin消化质粒PGM-RR，回收后用Kl幼owFragment补平末端，并用
碱性磷酸酶去磷酸化。用EcoRI消化质粒PGM-IlL-GPT， PGM-P11^GPT和 PGM-7.5-GPT-I1L ， PGM-7.5-GPT -P11回收小片段做补平处理后，用 PROMEGA公司的T4-DNA连接酶(10U/ 1)，与PGM-RR相连，得到质粒PGM-RR-I1L-7.5-GPT, PGM-RR-Pll-7.5-GPT和PGM-RR-7.5-GPT-IlL ， PGM-RR-7.5"GPT-P11。
IO.将启动子，报告基因复合体片段插入非必需区Y-IFN受体基因中。
用PmeI消化质粒PGM-Y-IFNR，回收用碱性磷酸酶去磷酸化。用 EcoR I消化质粒PGM-IlL-7.5-GPT,PGM-Pl l-7.5石PT和PGM-7.5"GPT-I1L ， PGM-7.5-GPT-P11,回收小片段后用幻enowFragment补平末端后，用 PROMEGA公司的T4-DNA连接酶(10U/ 1)与PGM-IFN相连。得到PGM-INF-11L-7.5-GPT， PGM-INF-Pll-7.5-GPT和PGM-IFN-7.5-GPT-IlL, PGM-IFN-7.5-GPT-Pll。
(三) 这些表达载体的特点
1、 以中国山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55的TK基因，y-IFNR基因 和RR基因为侧翼序列构建的表达载体不但可以与中国山羊痘病毒疫苗株 亲本GTPV发生同源重组，而且可以与其它CTPV毒株发生同源重组，可 根据需要构建具有不同生物学特性的重组GTPV毒株。
2、 构建的载体选用大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因为报 告基因，在重组病毒时，可以在霉酚酸等筛选试剂的作用下，较容易且快 速的筛选出阳性的重组病毒。
3、 选用了VVI1L和VVP11两个强启动子调空外源基因的转录，大大增
强载体表达的外源蛋白的能力。
利用这些表达载体可根据不同的目的，构建表达不同外源蛋白的重组 山羊痘病毒，这些重组山羊痘病毒即可作为重组活疫苗载体，用于不同疾 病的防治，也可以作为研究不同生物活性蛋白质的表达、加工、结构与功 能关系等的研究工具。
(四) 重组病毒的构建和筛选方法
利用这些表达载体构建表达外源基因的重组病毒的方法如下 首先在这些表达载体的下游，按正确的方法插入欲表达的结构基因， 构建重组表达质粒，然后将这些重组表达质粒转染已经被GTPV亲本毒株 感染的能使GTPV在其中复制的合适细胞(如绵羊羔羊睾丸细胞，胎羊成纤维细胞或胎羊肾细胞等)，通过重组表达质粒与GTPV亲本株在同源序 列处发生重组的方法，利用报告基因将重组病毒筛选出来。但这些载体中 表达的外源基因序列必须是编码序列，不能含有内含子，等非编码序列， 而且要带有起始密码子ATG,且启动子下游的第一个ATG须是要表达的外
源基因的起始密码子。而且早期启动子下游的外源基因的内部不能含有 TTTTTNT序列，其中N为四种脱氧核苷酸中的任何一种。
(五)重组病毒的构建
1、 细胞与病毒的培养(除本发明介绍的羔羊睾丸细胞外，还可用其 他GTPV可以在其中复制的细胞)
利用l-5月龄的绵羊羔羊睾丸细胞，参照殷震、刘景华主编《动物病 毒学》第二版，科学出版社(1997)，介绍的方法制备睾丸原代细胞，采 用10%的小牛血清的DMEM培养液，37 OC5%C02条件下培养。
2、 病毒PFU的测定
制备绵羊睾丸单层细胞，以106cell/ml继代于12孔细胞培养板，每孔 3ml，培养至细胞长成单层，吸去培养液，以PBS液洗细胞2次，将GTPV 病毒液以PBS液作KM 10"5递进1唯稀释，然后每孔接病毒稀释液3001， 设一孔作细胞对照，37-C吸附l 1.5h。加入含2。/。犊牛血清的MEM培养液 培养72 96h,吸去培养液，用PBS洗两次，然后每孔覆盖lml福尔马林结 晶紫染液(配制方法每50ml中加入10ml5y。结晶紫，37.5ml0.85%NaCl， lml甲醛，1.5mlH20)室温染色30min,吸去染液，以馏水漂洗两次，计 算蚀斑数和病毒原液的PFU。
3、 重组表达质粒的构建
用限制性内切酶XhoI消化表达载体，然后将消化成线形的载体先进
行粘性末端的补平，再对平末端去磷酸化处理，再与目的基因连接，筛选 鉴定表达质粒，然后提取纯化质粒DNA。
4、 细胞转染方法(除本发明介绍的转染方法外，还可以用其他将 DNA将细胞转染进入细胞的方法)
制备羊睾丸细胞单层，以lXl05cell/ml继代于12孔细胞培养板中，每 孔lml，在37'C，5。/nC02的培养箱中培养，待细胞长至70~80%融合单层时，吸去培养液，GTPV疫苗株的细胞培养液按0.2PFU/cdl接种羊睾丸细 胞，37。C吸附14.5h，吸弃病毒液，加入含2M牛血清的DMEM培养基，在 37°C, 5% C02的培养箱中培养4^6小时，使用Invetrogen公司lepofectamine 2000脂质体将质粒载体转染羊睾丸细胞，具体方法是
吸弃12孔中的培养基，加新鲜的不含有抗生素和血清的DMEM培养基 洗涤细胞3次，或用PBS。先制备100ulA液(不含有抗生素和血清的DMEM 培养基、4ul脂质体)，再制备100ulB液(用不含有抗生素和血清的DMEM 培养基稀释1.6ug要转染的目的质粒)，将A液室温放置5min后，逐滴将A液 加入B液，将混合液温和混匀，室温放置30min以上，逐滴接种细胞，在37 t:，5a/。C02的培养箱中培养2小时，吸弃上清，加入含2M牛血清DMEM培 养基，在37C/。C02的培养箱中培养。逐日用显微镜观察转染的细胞， 待出现明显CPE后，吸取细胞培养物，反复冻融3次，离心去掉细胞碎 片，保存上清作为重组病毒的原液。用于重组病毒的筛选。并测定PFU。
5、 重组病毒的筛选方法
(1) 筛选液的制备取一定量的DMEM加入2，/。的小牛血清，100U/ ml的双抗(青霉素，链霉素)，20-30 ug/ml的霉酚酸(MPA) ， 230-280ug /ml的黄嘌呤，10，20ug/ml的次黄嘌呤，l-3ug/ml的氨基喋呤和l-3ug/ml的胸
(2) 在12孔细胞培养板中制备筛选表达GPT的重组GTPVD的LT细胞 单层将培养好的LT细胞用0.25。/。的胰酶消化，离心得到的细胞用筛选液 悬起，大约以lxl05cell/ml的细胞量加入12孔细胞培养板中，每孔lml。然 后置于37'C， 5% C02的培养箱中培养培养16"24小时，细胞长满70-80%。
(3) 将以GPT为报告基因的载体与GTPV疫苗株共转染细胞后收获的 病毒以每孔30(K500PFU接种绵羊睾丸细胞，或接入筛选液体积的1/10的毒 量。混匀后于37'C5MC02的培养箱中培养，每天观察一次，连续观察14 天，出现细胞病变的收集培养液，离心除去细胞碎片，继续按同法做进一 步筛选。
6、 重组病毒表达蛋白的鉴定
将筛选、纯化的重组病毒，以5PFU/CELL接种羊睾丸细胞单层，感染 后5-14天收获病毒，将收获的重组病毒用细胞裂解液(10mol/ml TrisflCl,PH7.4-8.0,lmmol/lMgCi2，0.5%NP-40,20ug/mlDnaseI)裂解后，加等量的2x SDSbadingBuffer混合，100 。C水浴煮沸3min，做SDS-PAGE电泳后转移到 硝酸纤维膜上。用封闭液(用TBS配制3n/。BSA, 0.05Tween-20)室温封闭l -2小时，然后用TBS (10mol/mlTris-Ha,PH7.5，150mmol/lNaC12)液漂洗两 次，再用抗目的蛋白的抗体室温感做2小时，用TBS液漂洗三次，每次两 分钟。然后用碱性磷酸酶标记的第二抗体，(1: 500)室温感做两小 时，，再用TBS液漂洗三次，最后用碱性磷酸酶缓冲液配制的NBT和BCIP
显色液显色，适时终止显色反应。序列 表
<110>石河子大学
<120>山羊痘疫苗株表达载体
<160>18
<210>1
<211>2404
<212>DNA
<2B>山羊痘病毒(C apripoxvirus) <220>
<221>5',
<222>(1)…卿
<220>
<221>CDS
<222>(936卜.(1469)
<220>
<221>3, UTP
<222>(1469>..(2404)
<400>1
1caagccacta ca^aaccag ttagattaaa tgactttatt ggcctgtttg attgtgtaaa 61gaaaaatata ccactaacaa atattccaat tatggaataa aatatc磁ca gttaaatgga 121 gaaaaataac tcaaaaaaca tttattttac tcctgtattt atagaaccta ctataaa2u^ 181 加ccttttg caatcttaca aatatacata tatcataata tttgaaatta taacagtgat 241 ggtattatta tttttatttt ttaagtcaga aatcaagatg ttgtttaattttaaacaaca 301 aaaagttatc agtccgatag ataaattttc aaaaaccact ttatactgta aagaaaataa 361 gctttttatt agtgggttac ctaatactat gtactcaaag gaagcactat cattaaatag 421 acaaccgata ac磁ataaat attgtaatga tcttttacaa tcaataaatg gatcac^ca 481 agtatctatt aacgatattc ttagaaaacg atgactcctt ttttaaat^ ttatcagaac 541 aagatgatga aacagctatg tctgatatcg aaaccattgt aacatattta aattttttat<formula>formula see original document page 17</formula>2341 ttctgagcaa gttacaaaga catggaatat tggatggatg cacaatagta tatgttggat 2401 cagg
<210> 2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
Caagccacta caagaaccag ttag
<210> 3 <211>24 <212〉DNA <213>人工序列
<400>3
Ctgatecaac atatactatt gtgc
<210>4
<211>26邻
<212>DNA
<213>山羊痘病毒(Capripoxvirus) <220>
<221>5'UTP
<222>(1)…(931)
<220>
<221>CDS
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<220><221>3， UTP
<222>(鹏)...(2969)
<400>4
1cctacctaca taacgattat ccaatggtaa taacaacaaa tactttgttt tatgatacat 61aaaaatgtga ctcttgttta cttttaactt ttgattgcac ataagtagtt tgcactacaa 121 aaagtacttt atactatgaa ggatgtataa aaatagtcaa aaaaaataaa tatttttatc 181 taaataaatt aatatattat ttaaggttaa aaaaacaaaa aaaaaaaata aactaagtta 241 tacgttattg atagtaagta aagaaaatgg ataaaaaaat ttattgtggt atagtatttg 301 gctacaaatt attaaaaaaa agtctaaaag aaaatgctat taaatgtgtt agttttataa 361 ggaaaagcaa tatgaaaaaa gcaatatcta ttgaacgtgt tacattgtta gatggcgatg 421 gtgctaatga tagtgatagt gatagtaata ccgttagtag tgatgataat gatactaaat 481 ataattataa ctacaagtat aaatttacaa aaagaaagac acctcataaa gtaatgtatt 541 acataaatta taacgacagt gtttcaaatg atgatgtatt tctataaaaa ataaaaaaaa 601 aaatataaat tttacaatag tggtagcaat ttcatcagac taattttaca acagcaatga 661 ctaacaacgc ctttagcata ggaaccgtaa tatttttgat ggttttaata attgttatcg 721 taataagtct ttatctgcta tttcaact堪tcaacttctt ttacttatta aaattgttta 781 ataaaataaa agtaaaaatg atgaacataa ccacaaaaat atcctttgat gaattggaaa 841 atgcttatta tatcgatgat acgtatatgt gtgtgggtgt caatgttgac aaataaaata 901 atgaaatatt atttttatag tataaaataa aatggagcca attcttaaag aaacatcttc 961 aagatttgta gt加ccta tattatataa agaaatatgg gtaatgtata aaaaagccgt 1021 cgctagtttt tggacagttg atgaagt堪a tctttctaag gatttagccg attggaaaaa 1081 actcaacaat gaagagcaat actttattaa aaacatattg gcattttttg cagctagtga 1141 tggtattgtt aatgaaaact tggcagaaag attttactcg gaggtacaat ggtcagaagc 1201 tagatgtttt tatggttttc agatagctat ggaaaacata cactctgaaa tgtatagctt 1261 acttattgat acatacattt caagtactaa agagaa^aa cattta加a atgcaatcga 1321 aacaatggat tttattaaaa aaaaatctga atgggct堪a aaatggMat caaacaaaaa 1381 agcatcgttt ggagaacgac taatagcgtt tgctgcagtt gagggaatat tcttttccgg 1441 atcattcgct gcaatatttt ggttaaaaaa acgaggattg atgccaggat taacattttc 1501 aaacgaactt attagtagag atgagggcct tcattgtgat tttgcgtgtt taatttttaa1561 acatctaaaa tatcctcctt ctaatgacat tattacgatt attataaacg aggctgtgtc
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1861 agacgataat gttttttcat tagatg(tga tttttagttt ttattaaata ttataaagtt
1921 gaataaataa caacttttgt taattatctt gaataaccaa tatgacttta aaaaggtata
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2341 aatcttatat gtatggttgt tacgatttgt acgatgttgc agataaatat attaaaaaaa
2401 ggtttatgta tataagcaac gatttaatta aattaagagt taatgaatta aggcccatat
2461 taaaaagtag tgatttagtt gttgatactg aagattttgt tcttaatttt ataattaagt
2521 ^ggaactgt taaaaaaact aata路ctta atacgatgaa gttagtaaat gacgctgtaa
2581 ggttoacctt tttaacagaa caaggaaaaa aaaggttact ggcgtggteg tocagattta
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
Cctacctaca taacgattat cc
<210>6 <211>23<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
Catcgtggtg ttatgtgttt atc
<210>7
<211〉2627
<212>DNA
<213>山羊痘病毒(Capripoxvirus) <220>
<221>5'UTP
<222>(1)…(832)
<220>
<221>CDS
<222>(833)'..(1670)
<220>
<221>3, UTP
<222>(1671)."(2627)
<400>7
1cgtattccct tecttgtgtt gttgggttta taactgta敏acatatacta atagcgttgt 61acga(^atta tcttgccgca ^g^tgata atataacata tcaagtttat gaatat磁at 121 aaaaatgaag朋朋3朋aat aaatttaaaa tctttactaa gttataacat ttctttttta 181 tcaatgaaaa aaaggtaaat ttttttataa ataaagtttt tatcftttca aattatgatt 241 acacaaagta tgacataacg aaaattgtat taaaaaattc aaataaattt acgtttacta 301 tgataaaagt tatatcagaa tatgtactta atgaaaatga ttataaa^gttata^aat 361 taaaaattga t鹏aatact atgcttattt ttatccattt atazaatcta aj|gttttaaa 421 catatcaatt ctatgaaaaa aagta^ttt ttaatgatat gattgaaaat tatttta^ 481 tacgaaaaat gaaaaataca aaaa^ataa gcaaaatata cactaagttt ttaacatatg 541 atgatatgac tttaattatt acagcgttga ctatattaat aaaataatat caaaattgcg601 tttaagtaaa acaaacacat tactgttttt cactttatga aaataatata attgatataa 661 cMcaataaa atgta培ata ggtttaatat caataattto ttcaa^ggt aagtatccaa 721 gtttttttac atattcttaa cgaaata^t tattttaMa gaaaagaatt tgaaaaaata 781 tatctgtaac agatttccat aaaaatataa a^磁aatta aacacttact aaatggacgc 841 agtagtattt tttgcttttt tgctttttaa actatgttat tctttttcta aagatataaa 901 adaacatct aatgatttaa ttotaatatt ggatgggatt a^;gatgaca atagtagtaa 961 ctataaagta atgattatga cgtat敏ag cgg堪aatgg acgcaagcat gtaattatac taataatcaa tattgtaacg tttcgccttt tataaa培at aatactgatt atttttgg磁 aaaatttatt tcaattgaca ataaggaatc aaatgttttt apgtttaaac caatttgcga a^tgttgtt attactacgc catctgtatt tattaaacgg ca%atgtta atactgtact aacaattaat cacccactag cca^gataat咖aaaaat tcto;tatat ataataacga taagtattgt aatattgtgt ttaaatatat tttaagtatt鉱gtttggtg attcaaalac aattaaaaat gaagttgatg aacagttttg tgataaaaaa堪atgtatta ttgaatttgg gtctca^aa aaagtttgtg ttacagtttt tggaaattac gaaactgatt attatcaaat a鄉acaaat gaaacaaata aagaatgtat taacgaattg acgcct鄉a aagttgatac atttttttgt aaaacaaaaa acagatttaa atttgcttaa acggcg城cggaaagtta ctaaaaataa attcaaagga gaaaaatcat ttaataaaat tgt鄉aatt tacaatcttg tgttatcact ttttgagtat atcgtoaafg aattgaatta acataaacta ctatttttat aaaaaaaaat attaaataca aataatattt taaagatgga aacgattagt gatggtataa taaaagtaaa aacctttaat gatgattatt ttaataacgt taagaaaata attatggaca tgattaaata caaaaacata atctgggaag agtctaaagt atttgatcat gaaaaaggtg taga^ttat taatacta^: gaaagacaat gtaawagta tata^aaga ggtttagatg atatttttaa agttataaga aaaaaactgt tattatcttt tgaatttcca caaaaaatta gtgatattat attagataac acaattacgc ttats^ta cgaaa￡0gga g敏ttt加a a(^aacacag塔attttata cattttaaat caaaaaactg ttattgttat catttagtac tgtatttaaa taatacg缚c aaaggaggta ataca^tat acatataaaa tccaatgata tattttctac taaaaacgat gtcctatttg ataaaacatt aaatcacagt totgatatta taactgatgg ￡^aaaaaaat atagcattaa taaatgt^t tataaaatat aattc^aata atgacgaaac aatatttaaa ttaccctatt tat鄉aaaa taattatata aacttttacg2341 aagatgaagg aaataggaag ttttgttact gtctcgttac tgtaaataat tattccacag
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
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<212>DNA
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<400>10
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<400>12
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<210>14
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ctatatggcc t^gtcc敏t aacta
<210>15 <211>21 <212>DNA<formula>formula see original document page 25</formula>301 acgcggacte atgtgaaata ctggttttta gtgcgccaga tctctataat ctcgcgcaac
361 ctattttccc ctcgaacact ttttaagccg tagataaaca ggct鹏aca c加acatga
421 gcgaaaaata catcgtcacc tgggacatgt tgcagatcca tgcacgtaaa ctcgcaagcc
481 gactgatgcc ttctgaacaa tggaaaggca ttattgccgt鄉ccgtggc ggtctggtac
541 cgggtgcgtt actggcgcgt gaactgggta ttcgtcatgt cgataccgtt tgtatttcca
601 gctacgatca cgacaaccag cgcgagctta aagtgctgaa acgcgcagaa ggcgatggcg
661 a^gcttcat cgttattgat gacctggtgg ataccggtgg ta;tgcggtt gcgattcgtg
721 aaatgtatcc aaaagcgcac tttgtcacca tc加gcaaa accggct敏cgtccgdgg
781 ttgatgacta tgttgttgat磁cccgcaag atacctggat tgaacagccg tgggatatgg
841 gcgtegtatt cgtcccgcca atctccggtc gctaatcttt tcaacgcctg gcadgccgg
901 gcgttgttct ttttaacttc鄉cgggtta caatagtttc cagtaagtat tctgg鄉ct
961 gcatccatga cacaggcaaa cctgagcgaa accctgttea aaccccgctt taaac磁c^
1021 gaaacctcga cgctagtccg ccgctttaat cacggcgcac aaccgcctgt gcagtcggcc
1081 cttgaiggta aaaccatccc toactggtat cgcatgatta ac敏ctgat gtggatctgg
1141 cgcggcattg acccacgcga aatcctcgac gtctacgtag tt助ccggac cgggccatat
1201 aggcc
权利要求
1、一种用于在重组山羊痘病毒中表达外源蛋白的表达载体，其特征在于，在表达载体中的VV I1L启动子如序列表中的<210>10或VV P11启动子如序列表中的<210>11下游，插入外源基因，通过与山羊痘病毒亲本株同源重组获得12个表达外源蛋白的重组羊痘病毒。
2、 根据权利要求l所述的表达载体，其特征在于:这些载体中，能与山 羊痘病毒亲本株发生同源重组的侧翼序列是羊痘病毒G14-STV44"55疫苗株含TK基因的序列如序列表中的〈2101，含IFNR-y基因序列如序列表中 的<210>7或含収小亚基基因序列如序列表中的<210>4。
3、 根据权利要求l所述的表达载体，其特征在于这些载体中用于调控 外源基因的启动子是人工合成的。
4、 根据权利要求l所述的表达载体，其特征在于:用于这些载体中表 达的外源基因可以是病毒、细菌和寄生虫的抗原基因、致病基因，肿瘤相 关抗原基因，人、畜、禽免疫调节基因以及其它动物的免疫基因。
全文摘要
本发明提供用于在重组山羊痘病毒中表达外源蛋白的表达载体，在表达载体中的VV I1L启动子或VV P11启动子下游，插入外源基因，通过与山羊痘病毒亲本株同源重组获得12个表达外源蛋白的重组羊痘病毒，载体中能与山羊痘病毒亲本株发生同源重组的侧翼序列是羊痘病毒G14-STV-44-55疫苗株，含TK基因或IFNR-γ基因或RR小亚基基因，利用这些表达载体可以用不同的方法，构建表达不同外源蛋白的重组山羊痘病毒，这些重组病毒即可以作为重组活载体疫苗，用于疾病的防治、研究不同生物活性蛋白质的表达、加工、结构与功能的关系。
文档编号C12N15/863GK101418314SQ20071018000
公开日2009年4月29日 申请日期2007年10月24日 优先权日2007年10月24日
发明者李有文, 郭志儒, 陈创夫, 风 魏 申请人:石河子大学