专利名称：细胞凋亡的特异性量化检测的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞凋亡的特异性量化检测技术。
背景技术：
细胞凋亡是一个受到严密调控的通路，其目的在于当机体处于一系列包括肿瘤压力的生物学过程时，清除机体不需要的细胞。因此，当机体的正常细胞凋亡途径出现紊乱时，凋亡异常调控就成为了肿瘤发生的一个主要机理。更重要的是，细胞凋亡的水平已经不仅成为了检测癌症治疗效果的强有力标记，也成为了预测临床治疗预后的重要标记。因此， 更精确的细胞凋亡检测技术的开发就成为了肿瘤生物标记物发现中一个关键的必要环节。原位末端转移酶标记技术(TUNEL)是用于检测凋亡细胞中的原位DNA降解的常用方法，其原理在于核染色质的断裂是细胞凋亡晚期的标志之一，会导致DNA双链产生大量 3'-羟基末端，因此可以利用这个性质来鉴定凋亡细胞。具体做法是通过荧光标记的脱氧鸟苷酸(F-dUTP)对DNA断裂处进行标记来鉴定的。脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)可以利用DNA链上暴露的3'-羟基末端催化不依赖模板的脱氧核苷酸到双链DNA或者单链DNA 的3'-羟基末端从而生成双链DNA。另外，脱氧胸腺嘧啶核苷类似物5-溴代-2'-脱氧鸟苷5 ‘-三磷酸(BrdUTP)也适用于TdT反应来标记断裂位点。BrdU —结合到DNA中，就可以通过一种抗BrdU抗体通过免疫组化技术进行检测。非凋亡细胞就没有结合大量F-dUTP 的能力，因为这类细胞缺少暴露的DNA 3'-羟基末端。然而，近年来随着细胞凋亡技术的发展，对TUNEL技术的精确性出现了越来越多的争论，主要原因在于这项技术会错误地将坏死细胞也标记为凋亡细胞，例如原位末端转移酶标记技术不能区分细胞凋亡、细胞坏死和细胞自溶。近年来已经有一些改善原位末端转移酶标记技术的敏感性和非特异性的研究进展。例如，细胞经过微波辐照预处理紧随着蛋白酶K进行消化处理后，检测结果显示可以大大改善检测的敏感性和特异性。然而，这些改善仅在正在培养的细胞中起作用，而对检测细胞凋亡、细胞坏死和组织切片等引起的非特异性DNA断裂不起任何作用。利用形态学分析方法去辨认凋亡细胞确实可以帮助改善特异性，但是这使得整个过程费时又费力。而且， 细胞凋亡形态的评定是一个主观性的鉴定过程。所以，迫切需要一种可以特异性地检测和测量由于凋亡特异性的DNA片段碎裂而不是由坏死或者非特异性断裂引起的DNA片段碎裂的技术方法。在肿瘤活组织检查中，由肿瘤治疗诱导的DNA片段碎裂已经成为一种重要的预测肿瘤临床反应的标志。因此，可以准确和可重复性地检测凋亡特异性的DNA碎片的方法具有至关重要的作用。不幸的是，商业上可用的原位末端转移酶标记技术(TUNEL)不仅会检测出由于细胞凋亡导致的DNA碎片，还会检测出由组织切片引起的非特异性DNA断裂产生的DNA片段碎裂，因此研发特异检测细胞凋亡的技术具有十分重要的意义。本发明正基于以上的思路而来。
发明内容
基于上述问题的迫切性，本发明提供了一种新的凋亡检测技木，该技术可以准确 并可重复地检测凋亡特异性的DNA碎片断裂。利用这种技术在肿瘤活组织检测中可以提高 細胞凋亡检测的准确性，从而可以预测治疗效率和治疗结果，它也将在临床检查和基础实 验研究中提高检测细胞凋亡的特异性。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是
ー种用于检测細胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述细胞预孵育试剂盒
用于DNA的3'末端标记的末端转移酶(Terminal transferase, TdT)； 未进行标记的双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)，用于 細胞膜通透后断裂的DNA片段3'末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对(ddNTP)或三磷酸 脱氧核糖核苷对(dNTP)中的碱基而得到预先标记。
优选的，所述细胞预孵育试剂盒以其组分的反应终浓度计为
包括:
IO-IOOmM ； I-IOOmM ；
I-IOOmM ； 0.I-IOmM ； 1-500U ； IO-IOOOUM ； 0.Ol-IOOnM0
优选的，所述细胞预孵育试剂盒以其组分的反应终浓度计为
KCl
Tris-HCl MgCl2
DTT, pH 7. 9 TdT
未标记的dCTP 荧光标记的dUTP
优选的，所述细胞预孵育试剂盒以其组分的反应终浓度计为
KCl
Tris-HCl MgCl2
DTT, pH 7. 9 TdT
未标记的ddCTP 荧光标记的dUTPIO-IOOmM ； I-IOOmM ； I-IOOmM ； 0.I-IOmM ； 1-500U ； I-IOOnM ； 0. Ol-IOOnM0
KClTris-HCl50mM ； 20mM ；IOmM ； ImM ； 50U ；
IO-IOOOUM ； 0. OHOOnM。
优选的，所述双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)选自ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP的一 种，且ddNTP的反应终浓度为500 U M ；所述三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)选自dATP、dGTP、 dCTP、dTTP的ー种；且dNTP的反应终浓度为10nM。
MgCl2
DTT, pH 7. 9 TdT
未标记的ddCTP 荧光标记的dUTP
本发明的另一目的在于提供一种利用所述的细胞预孵育试剂盒进行检测细胞凋亡的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)将待检测细胞在具有所述的细胞预孵育试剂盒的条件下在离体培养液中进行预孵育，预孵育的温度为37°C，孵育时间为1小时，在进行孵育的同时对待检测细胞进行细胞膜通透化处理；(2)在孵育后的待检测细胞离体培养液中加入荧光标记的dUTP进行末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL试验)，dUTP终浓度为IOnM ；(3)检测孵育后的待检测细胞中荧光标记信号强度；通过检测得到的荧光标记信号强度和确定待检测细胞中细胞凋亡状况。优选的，所述方法中待检测细胞为HT-29细胞，所述荧光标记信号强度通过激光扫描细胞流式仪(LSC)来测定。优选的，所述方法步骤⑴中采用的细胞膜通透化处理的试剂为DNaseI和Triton X-100 ；先用5 20 μ g/ml的DNase I进行待检测细胞的孵育后，用0. 1 1 % Triton X-100 对细胞膜脂质进行溶解处理，处理时间为10分钟，处理温度为37°C。优选的，所述方法步骤(2)中荧光标记的dUTP为Cy5_dUTP或FITC_dUTP。本发明的又一目的在于提供一种所述的细胞预孵育试剂盒在检测细胞凋亡方面的应用。优选的，本发明中所述细胞预孵育试剂盒的反应缓冲液部分可以通过 IXNEBuffer 4进行调配。优选的，所述末端转移酶的反应终浓度为50U(单位)。优选的， 所述试剂盒中双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)的反应终浓度为500 μ M ；或者所述试剂盒中三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)的反应终浓度为ΙΟηΜ。
Tris-HCl MgCl2
DTT, pH 7. 9 TdT ddCTP Cy5-dUTP
本发明优选的细胞预孵育试剂盒为以下组份和含量 KClIO-IOOnM ；
I-IOOmM ； I-IOOmM ； 0.I-IOmM ； 1-500U ； ΙΟ-ΙΟΟΟμΜ ； 0.Ol-lOOnM。
在早期凋亡细胞中，其细胞膜仍然保持完整，但在溶胞作用下细胞在被裂解前就被巨噬细胞或者周围细胞迅速吞噬。然而，细胞坏死是另一种细胞死亡过程，是典型的非半胱天冬酶依赖性过程，具有细胞膜通透性增加、细胞和细胞器增大的典型特征。凋亡细胞与坏死细胞不一样，凋亡细胞保持了细胞膜的完整性，因此未标记的ddCTP和TdT与细胞进行预孵育可以让坏死细胞的DNA缺口得到预先标记，随后进行的荧光标记的dUTP和TdT将只会在凋亡细胞中检测到DNA断裂而不会在坏死细胞中检测到。本发明细胞凋亡检测方法特异性高，它可以检测凋亡诱导的DNA片段碎裂(而不是坏死或者组织切片导致的DNA碎片)。该检测方法将不仅大大改善在研究中准确检测细胞凋亡的发生，而且可以对肿瘤个性化治疗提供更为可靠的指导原则。本发明的目的是开发一种更精确的细胞凋亡检测技术本发明充分利用坏死细胞
6的膜缺陷特点，来达到特异性鉴定凋亡细胞的目的。未标记的ddCTP(2' 3'-双脱氧胞苷)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的预处理可以使得坏死细胞中的DNA断裂处被标记， 而对凋亡细胞和正常细胞则没有标记，因为这些细胞的细胞膜对那两种分子都是不可透过的。这样，预保温步骤保证了细胞凋亡诱导的DNA片段碎裂被特异标记，而细胞坏死或者非特异性组织切片引起的DNA碎片则不被标记。本发明利用未标记的ddCTP对细胞进行预孵育是区分非特异性DNA断裂和细胞凋亡诱导的DNA断裂的必要手段本发明对未标记的ddCTP进行预孵育能够阻断对预先形成的DNA断裂进行检测，可以先进行末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dUTP切口末端标记实验 (TUNEL)，然后再进行LSC分析；测量了 DNA断裂的程度并与一个体外细胞系统进行了比较。本发明以HT-29细胞为例，预孵育未标记的ddCTP (500 μ M)和TdT大大地降低了预先形成的DNA断裂的检出率。此定量观察表明在预孵育未标记的ddCTP (500 μ Μ)和 TdT的细胞中，与FITC相关的信号平均强度相对没有进行预孵育的细胞下降了 73%。尽管 FITC-dUTP被广泛的用于组织培养和活组织检查，但是组织中的高自发荧光，尤其是FIFC 发射的波谱，使得判别信号和背景异常困难。为了克服这一难题，本发明优选使用Cy5-dUTP 作为TdT底物的首选，因为Cy5发射的近红外区在肿瘤活检中只产生很浅的背景。如图3 所示，与对未标记的ddCTP和TdT没有进行预孵育的细胞相比，在对未标记的ddCTP和TdT 进行预孵育的细胞中，Cy5相关联的信号下降了 55%。本发明还使用了 LSC(激光扫描细胞流式仪)来测定每个中心活组织检查中肿瘤细胞处于细胞凋亡时期的百分比。为了便于分析，每个载玻片都放置在由电脑控制的自动化平台上。被扫描的目的区域可以通过装置上的显微镜进行视觉定位，肿瘤的区域可以通过Wincyte软件进行绘制。载玻片扫描和细胞核波状轮廓的构建是通过氩激光器和红色探测器(溴化丙啶)扫描完成的。FITC/Cy5阳性细胞是通过氩激光器和绿色探测器检测到的。与流式细胞仪计数(荧光活化细胞分选系统)相似，荧光强度相对水平被记录在四象限散布图中。一个阴性对照的载玻片用来测定每个样品的分析门。用再定位在视觉上确定 FITC或Cy5阳性细胞。一旦门被设定，数据文件将自动进行处理从而测定FITC或Cy5阳性细胞在中心活组织检查中的百分率。如图3B所示，通过使用Cy5-dUTP和FITC-dUTP的末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记实验，分别导致了 6648和6877的阳性计数。然而，ddCTP的预孵育紧接着成功的消除了非特异性DNA断裂。总之，这些数据明确地表明，预孵育未标记的ddCTP和TdT能够阻断通过随后的荧光标记的ddCTP和TdT对预先存在的DNA断裂荧光标记。因此，预孵育对于降低坏死细胞中由于膜破裂导致的DNA切口形成的信号是极为重要的。为了区别Cy5_dUTP和FITC-dUTP的特异性在量化细胞凋亡诱导的DNA断裂中的作用，本发明还进行Cy5-dUTP、FITC-dUTP对肿瘤活组织检查DNA断裂特异性比较试验。本发明通过上述检测方法来比较使用Cy5-dUTP和FITC-dUTP测定在肿瘤活组织检查中DNA 断裂信号的强度。LSC(激光扫描细胞仪)可用来检测Cy5-(或FITC-)阳性事件和中等荧光强度(MFI)的比率。中等荧光强度代表组织中荧光探针的总强度的均值。因此，阳性荧光事件和中等荧光强度之间的比率表明了测量的信噪比。如前所述，此项目标的原理，即在末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记实验中通用FITC-dUTP，在肿瘤活组织检查产生自发荧光，并且由于对光漂白作用的敏感性从而会有相对不稳定性。同时，Cy5是一个更加稳定和低背景荧光探针，可以增强本发明检测细胞凋亡相关DNA断裂的特异性。因此Cy5-dUTP(图4)在检测方法中的信噪比显著高于FITC-dUTP细胞凋亡试剂盒，这表明该细胞凋亡检测方法提供了一个更具特异性的细胞凋亡检测途径。本发明使用的DNase I，即Deoxyribonuclease I，中文名称为脱氧核糖核酸酶I， 是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5‘端为磷酸基团，3'-端为羟基。DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。DNase I不含RNase (RNase free)，可以用于各种RNA样品的处理。提供了用于 DNase I失活所需的EDTA。DNase I用于制备不含DNA的RNA样品；RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染；体外T7，T3，SP6等RNA Polymerases催化的RNA 转录后去除DNA模板；DNase I footprinting研究DNA-蛋白质相互作用；缺口平移(nick translatioin)；产生DNA随机片断文库；细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照。DNase I来源于牛胰腺，经从牛胰腺纯化得到。如需对酶进行稀释，可以用酶储存液(50mM Tris-acetate(pH 7. 5), IOmM CaCl2, 50% (v/v) glycerol)进行稀释。Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂)。分子量为646. 86 (C34H62O11)。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。免疫细胞化学中Triton X-100常用浓度为和0. 3%，其中的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0. 3%的Triton X-100则常用于稀释血清，0. 的Triton X-100常用于LAMP (环介导等温扩增)，配制BSA等。但通常是先配制成30%的Triton X_100储备液，临用时稀释至所需浓度。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为本发明试剂盒检测细胞凋亡的DNA断裂的方法和TUNEL方法的流程比较；图2为不同浓度ddCTP预孵育(预先在DNA断裂出进行block处理)对HT-29细胞中平均荧光强度(MFI)的影响；图3为未进行ddCTP预孵育和采用ddCTP预孵育对HT-29细胞中荧光标记dUTP 的影响；图4为利用Cy5_dUTP通过采用本发明的方法与传统TUNEL方法检测人肿瘤活组织中DNA的断裂情况的微观照片；绿色为细胞核，红色为DNA片段；图5为利用Cy5_dUTP通过采用本发明的方法与传统TUNEL方法检测人肿瘤活组织中细胞核和DNA的断裂情况比较；绿色为细胞核，红色为DNA片段；图6为采用不同荧光标记的dUTP对本发明的方法以及传统TUNEL方法检测人肿瘤活组织中DNA的断裂情况的影响；其中上面一组为Cy5-dUTP ；下面一组为FITC-dUTP ；图7为采用不同荧光标记的dUTP对本发明的方法以及传统TUNEL方法检测人肿瘤活组织中DNA的断裂情况的不同微观照片；包括Cy5-dUTP、FITC-dUTP ；图8为本发明试剂盒检测细胞凋亡的DNA断裂的方法和TUNEL方法的具体流程比
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明 。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例1细胞凋亡中断裂的DNA片段选择性标记试验在早期凋亡细胞中，其细胞膜仍然保持完整，但在溶胞作用下细胞在被裂解前就被巨噬细胞或者周围细胞迅速吞噬。然而，细胞坏死是另一种细胞死亡过程，是典型的非半胱天冬酶依赖性过程，具有细胞膜通透性增加、细胞和细胞器增大的典型特征。因此，本实施例充分利用坏死细胞的膜缺陷特点，来达到特异鉴定凋亡细胞的目的。具体做法是将5X103/孔的HT-29细胞在37°C下用H2O2处理一小时，诱导细胞坏死；然后用PBS清洗，并在含10%FCS(胎牛血清)的培养基中进行孵育。活的5X103/孔的 HT-29细胞然后加入到H2O2诱导的坏死细胞组中，接着用5Gy的、辐射或者IOOnM紫杉醇处理来诱导细胞凋亡。没有经任何处理的细胞被作为阴性对照组。HT-29细胞在细胞预孵育试剂盒的条件下(具体做法是将未荧光标记的500 μ M ddCTP和5U TdT中加到细胞上)， 置于离体培养液中，37°C预孵育lh。未标记的ddCTP(2' 3'-双脱氧胞苷)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的预处理可以使得坏死细胞中的DNA断裂处被标记，而对凋亡细胞和正常细胞则没有标记，因为这些细胞的细胞膜对ddCTP分子是不可透过的(图1)。然后， 再将5 μ M Cy5-dUTP和TdT加到细胞中，于37°C孵育30分钟。这样，由于坏死细胞已经被 ddCTP标记，Cy5-dUTP将只对凋亡细胞进行标记。因此，预孵育的步骤保证了细胞凋亡诱导的DNA片段碎裂被特异荧光标记，而细胞坏死或者非特异性组织切片引起的DNA碎片则不被特异荧光标记。如图1所示，本发明方法检测了细胞凋亡的DNA断裂，但不检测来自坏死细胞的 DNA断裂。正常细胞(N)在细胞核中没有DNA断裂，而坏死细胞(Nec)、凋亡细胞(Apo)有 DNA断裂。凋亡细胞和坏死细胞在各自的细胞核内都含有DNA断裂。在坏死细胞中未标记的dUTP和TdT预孵育标记DNA断裂。在细胞膜透化处理后，荧光探针偶联(或称标记)的 dUTP和TdT在细胞核中标记DNA断裂。使用多种检测系统，都表明本发明方法只检测凋亡细胞的DNA断裂。而TUNEL试验检测凋亡细胞和坏死细胞的DNA断裂。实施例2检测HT-29细胞中细胞凋亡情况用未标记的ddCTP对细胞进行预孵育是区分非特异性DNA断裂和细胞凋亡诱导的 DNA断裂的必要手段。为了验证本发明的假设即对未标记的ddCTP进行预孵育能够阻断对预先形成的 DNA断裂进行检测，可以先进行末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dUTP切口末端标记实验 (TUNEL)。也就是说，用DNase I处理细胞后(本发明采用了 HT-29细胞)，可以在细胞内产生DNA断裂，用常规TUNEL细胞凋亡检测技术将会检测出这种非细胞凋亡导致的DNA断裂。 但是，经过与ddCTP预孵育后，这种假阳性率显著降低。具体操作如下HT-29细胞置于4孔载玻片(10000细胞/孔)中，先用10 μ g/L
CN 102382893 A
说明书6/9页较图。
9的DNase I于37°C孵育30分钟后，用0. 2% Triton X-100对细胞在37°C条件下处理10分钟，从而就可以产生通透的细胞膜和非特异性DNA片段。接下来，HT-29细胞在细胞预孵育试剂盒的条件下(将未荧光标记的500 μ M ddCTP和5U TdT中加到细胞上)，置于离体培养液中，37°C预孵育lh。未标记的ddCTP(2' 3'-双脱氧胞苷)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的预处理可以使得坏死细胞中的DNA断裂处被标记，而对凋亡细胞和正常细胞则没有标记。然后，再将5μ M Cy5-dUTP和TdT加到细胞中，于37°C孵育30分钟。这样，由于坏死细胞已经被ddCTP标记，Cy5-dUTP将只对凋亡细胞进行标记。从图2和图3上的数据可以看出，通过Cy5-dUTP和TdT来检测HT-29细胞中DNA的断裂情况。预孵育未标记的 ddCTP (500 μ Μ)和TdT大大地降低了预先形成的DNA断裂的检出率。此LSC定量观察表明在预孵育未标记的ddCTP (500 μ Μ)和TdT的细胞中，与FITC相关的信号平均强度相对没有进行预孵育的细胞下降了 73%。实施例3检测肿瘤细胞中细胞凋亡情况为了证明在肿瘤活检中此项技术同样能够用来检测特异性DNA断裂，将肿瘤组织切片包埋在载玻片上(这其中包括坏死的细胞)，对于组织切片，先进行如下处理1、脱蜡二甲苯脱蜡2次，每次5-10分钟；乙醇水合(将脱蜡好的的切片依次放入 100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各2分钟)2、把切片浸入PBS漂洗3次，每次5分钟。3、横放切片，在组织块上加入蛋白酶K工作液，21-37°C作用15-30分钟。(蛋白酶 K工作液的配制2 μ L 50X蛋白酶K+98yL PBS)4、把蛋白酶K处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5分钟。5、把切片浸入封闭液中，室温(15_25°C )封闭10分钟。(封闭液的配制3% H2O2 溶于甲醇)6、把切片浸入PBS漂洗2次，每次5分钟。紧接着将组织切片在未标记的ddCTP和TdT中37°C预孵育lh，然后用Cy5_dUTP和 TdT进行温育。免疫荧光显微镜使用的是装配有窄通频带感光滤光片架的落射荧光显微镜， 这种荧光显微镜能够通过滚轮来选择红色荧光和绿色荧光。图像是使用低温CCD相机来获取的。如图4所示，坏死的细胞被Cy5-dUTP末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记深度染色，同时ddCTP能够阻断由非特异性DNA断裂产生的信号。对经γ射线治疗的患者的颈肿瘤活组织用于DNA断裂的检测时，如图4所示，其中Green = Nuc 1 ei细胞核，Red = DNA fragmentation DNA片段。包埋肿瘤组织脱蜡并固定。通过HeNe射线和红外检测器进行 LSC 分析，接着用 Cy5-dUTP 和 TdT (Cy5_dUTP (+TdT)) 37°C 孵育 Ih。用单独的 Cy5_dUTP 孵育作为阴性对照。LSC分析结果上一组采用的Cy5-dUTP(博生吉医药科技(苏州)有限公司)，方法条件是=PMT = 25，Thresh. = 2500 ；下一组采用的FITC-dUTP (Promega公司)，方法条件是PMT = 13，Thresh. = 1500。本发明还使用了 LSC(激光扫描细胞流式仪)来测定每个中心活组织检查中肿瘤细胞处于细胞凋亡时期的百分比。每个载玻片都放置在由电脑控制的自动化平台上。被扫描的目的区域可以通过装置上的显微镜进行视觉定位，肿瘤的区域可以通过Wincyte软件进行绘制。载玻片扫描和细胞核波状轮廓的构建是通过氩激光器和红色探测器(溴化丙啶)扫描完成的。FITC/Cy5阳性细胞是通过氩激光器和绿色探测器检测到的。与流式细胞仪计数(荧光活化细胞分选系统)相似，荧光强度相对水平被记录在四象限散布图中。一个阴性对照的载玻片用来测定每个样品的分析门。用再定位在视觉上确定FITC或Cy5阳性细胞。一旦门被设定，数据文件将自动进行处理从而测定FITC或Cy5阳性细胞在中心活组织检查中的百分率。如图5所示，通过Cy5-dUTP和TdT来检测人肿瘤活组织中DNA的断裂情况。通过使用Cy5-dUTP和FITC-dUTP的末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记实验，分别导致了 6648和6877的阳性计数。然而，ddCTP的预孵育紧接着成功的消除了非特异性DNA断裂。图6中Cy5荧光探针具有低背景特征，人类宫颈癌病检标本制备成石蜡切片后，经过脱蜡和固定处理，分别与Cy5-dUTP和Cy5-dUTP+TdT，在37°C孵育1小时。可以看到在TdT作用下Cy5-dUTP标记上肿瘤细胞，而没有TdT的存在时，Cy5表现出了极低的背景。实施例4检测细胞凋亡情况时荧光标记的优化条件尽管FITC-dUTP被广泛的用于组织培养和活组织检查，但是组织中的高自发荧光，尤其是FIFC发射的波谱，使得判别信号和背景异常困难。为了克服这一难题，本实施例提供了比FITC-dUTP更高的肿瘤活组织检查DNA断裂特异性的Cy5_dUTP。Cy5_dUTP作为 TdT底物的优越性是因为Cy5发射的近红外区在肿瘤活检中只产生很浅的背景。通过本实施例的方法来比较使用Cy5-dUTP和FITC-dUTP测定在肿瘤活组织检查中DNA断裂信号的强度。LSC (激光扫描细胞仪)可用来检测Cy5-(或FITC-)阳性事件和中等荧光强度(MFI) 的比率。中等荧光强度代表组织中荧光探针的总强度的均值。因此，阳性荧光事件和中等荧光强度之间的比率表明了测量的信噪比。如前所述，此项目标的原理，即在末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记实验中通用FITC-dUTP，在肿瘤活组织检查产生自发荧光，并且由于对光漂白作用的敏感性从而会有相对不稳定性。同时，Cy5是一个更加稳定和低背景荧光探针，可以增强本发明的方法检测细胞凋亡相关DNA断裂的特异性(图7)。在具体实施时，参照实施例2和实施例3，唯一不同之处是将Cy5-dUTP用FTIC_dUTP来代替。图8为本发明方法的具体流程图；其中使用本发明的方法检测凋亡诱导的而非坏死诱导的DNA断裂，以此来检测此试验设计的可行性。细胞在本发明方法或TUNEL试验处理后将用5Gy辐射剂量的、-射线(IR)，IOOnM的紫杉醇或H2O2处理。对于混合试验，部分细胞用IR或紫杉醇处理后，部分细胞用H2O2处理，再与活细胞共孵育。正常细胞在细胞核中没有DNA断裂(蓝色)；凋亡细胞和坏死细胞在细胞核内都含有DNA断裂(灰色)。在坏死细胞中未标记的dUTP和TdT预孵育标记DNA断裂(绿色)。在细胞膜透化处理后，荧光探针偶联(或称标记)的dUTP和TdT在细胞核中标记DNA断裂(红色)。本发明方法进行的细胞凋亡试验将只检测凋亡细胞的DNA断裂。相反，TUNEL试验检测凋亡细胞和坏死细胞的DNA断裂。总之，通过与坏死细胞不一样，凋亡细胞保持了细胞膜的完整性这一特点，本发明假设未标记的ddCTP和TdT与细胞进行预孵育可以让坏死细胞的DNA缺口得到预先标记， 随后进行的荧光标记的dUTP和TdT将只会在凋亡细胞中检测到DNA断裂而不会在坏死细胞中检测到。基于这种假设，本发明研制了一种高特异性的分析技术，它可以检测凋亡诱导的DNA片段碎裂(而不是坏死或者组织切片导致的DNA碎片)(图8)。本发明方法应用于凋亡检测技术，将不仅大大改善在研究中准确检测细胞凋亡的发生，而且可以对肿瘤个性化治疗提供更为可靠的指导原则。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述细胞预孵育试剂盒包括用于DNA的3’末端标记的末端转移酶(Terminal transferase, TdT)； 未进行标记的双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)，用于细胞膜通透后断裂的DNA片段3’末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷对(dNTP)中的碱基而得到预先标记。
2.根据权利要求1所述的用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述细胞预孵育试剂盒以其组分的反应终浓度计为KCl 10-100 mM ； Tris-HCl 1-100 mM ； MgCl2 1-100 mM ； DTT, pH 7. 9 0. 1-10 mM ； TdT 1-500U ；未标记的 ddCTP 10-1000 μ M ； 荧光标记的dUTP 0. Ol-lOOnM。
3.根据权利要求1所述的用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述细胞预孵育试剂盒以其组分的反应终浓度计为KCl 10-100 mM ； Tris-HCl 1-100 mM ； MgCl2 1-100 mM ； DTT, pH 7. 9 0. 1-10 mM ； TdT 1-500U ；未标记的dCTP I-IOOnM ； 荧光标记的dUTP 0. Ol-lOOnM。
4.根据权利要求1所述的用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述细胞预孵育试剂盒以其组分的反应终浓度计为KCl 50 mM;Tris-HCl 20 mM ;MgCl2 10 mM ；DTT, pH 7. 9 ImM ；TdT 50U ；未标记的 ddCTP 10-1000 μ M ；荧光标记的 dUTP 0.Ol-lOOnM。
5.根据权利要求1所述的用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)选自ddATP、ddGTP ,ddCTP,ddTTP的一种，且ddNTP的反应终浓度为500 μ M ；所述三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP的一种；且 dNTP的反应终浓度为10nM。
6.一种利用权利要求1 5任意一项所述的细胞预孵育试剂盒进行检测细胞凋亡的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)将待检测细胞在具有权利要求广5任意一项所述的细胞预孵育试剂盒的条件下在离体培养液中进行预孵育，预孵育的温度为37°C，孵育时间为1小时，在进行孵育的同时对待检测细胞进行细胞膜通透化处理；(2)在孵育后的待检测细胞离体培养液中加入荧光标记的dUTP进行末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL试验)，dUTP终浓度为IOnM ；(3)检测孵育后的待检测细胞中荧光标记信号强度；通过检测得到的荧光标记信号强度和确定待检测细胞中细胞凋亡状况。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中待检测细胞为HT-29细胞，所述荧光标记信号强度通过激光扫描细胞流式仪(LSC)来测定。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法步骤(1)中采用的细胞膜通透化处理的试剂为DNase I和Triton X-100 ；先用5 20 μ g/ml的DNase I进行待检测细胞的孵育后，用0. Γ % Triton X_100对细胞膜脂质进行溶解处理，处理时间为10分钟，处理温度为37°C。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法步骤(2)中荧光标记的dUTP为 Cy5-dUTP 或 FITC-dUTP。
10.一种权利要求广5任意一项所述的细胞预孵育试剂盒在检测细胞凋亡方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述细胞预孵育试剂盒包括用于DNA的3'末端标记的末端转移酶(Terminaltransferase，TdT)；未进行标记的双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)，用于细胞膜通透后断裂的DNA片段3'末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷对(dNTP)中的碱基而得到预先标记。该方法提供了一个更具特异性的细胞凋亡检测途径。
文档编号C12Q1/68GK102382893SQ20111037447
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者杨林 申请人:博生吉医药科技(苏州)有限公司, 西安交通大学苏州研究院