专利名称：鉴定猪流感病毒的引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定猪流感病毒的引物及其应用。
背景技术：
猪流感(Swine Influenza, Si)是由A型流感病毒引起的一种急性传染性猪的呼吸道疾病，其特征为突发、咳嗽、发热、呼吸困难、衰竭，还可导致怀孕母流产等猪繁殖障碍。 虽然SI的死亡率不高，但其影响猪的发育，延缓猪的生长及出栏时间；SI还是一种免疫抑制性疾病，可以破坏猪的免疫系统而引起免疫抑制，导致其他疫病并发或继发感染，加剧病情，给养猪业造成重大的经济损失。自1918年临床上发现经典型Hmi亚型SI以来，不断有新亚型、基因型毒株的出现，对养猪业造成的经济损失不可估量；又由于“猪”在流感病毒传播中的混合器的特殊角色，在人类流感的流行中SI发挥了重要的作用，严重危害人类的健康。目前我国在猪群中发现的猪流感病毒谱系及亚型有经典Hmi亚型猪流感病毒、北美三元重排Hl亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hmi亚型猪流感病毒、2009年甲型Hmi猪流感病毒、类人H3亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒、也见有在猪群中发现了 H5亚型流感病毒的报道。近年来猪流感病毒在我猪群中的发现和流行，严重危害养猪业的健康发展，并威胁着人类健康。目前鉴定猪流感病毒的方法主要有以下几种方法传统的方法是将病料接种鸡胚或MDCK细胞，盲传后通过HA和HI试验进行鉴定；1991年S. Takimoto等建立了免疫荧光和 ELISA检测流感病毒NP蛋白的方法；1990年A. Bressoud等建立了检测Hl亚型流感病毒的 RT-PCR诊断方法；1994年E. khorr等建立了检测Hl亚型猪流感病毒的RT-PCR方法；2002 年Y. K. Choi等建立了检测Hmi和H1N2及Hmi和H3N2亚型猪流感病毒的双重RT-PCR检测方法；2008年C. S. Lee等根据韩国流行的猪流感病毒建立了诊断H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒的多重RT-PCR检测方法。但目前尚没有针对猪流感病毒的不同谱系、不同亚型而建立的诊断方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测猪流感病毒的引物。本发明提供的引物，由引物组A-引物组E组成所述弓丨物组A由引物1和引物2组成；所述弓丨物组B由引物3和引物4组成，所述弓丨物组C由引物5和引物6组成，所述弓丨物组D由引物7和引物8组成，所述引物组E由引物9和引物10组成，所述引物1-弓丨物10的核苷酸序列分别依次为序列表中序列1-序列10。所述引物组A-引物组E均为独立包装。在上述引物中，所述猪流感病毒为如下1)或2):
1)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒；2)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒的至少一种。本发明的另一个目的是提供一种检测猪流感病毒的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，由试剂A-试剂E组成；所述试剂A由所述引物组A和PCR缓冲液组成；所述试剂B由所述引物组B和PCR缓冲液组成；所述试剂C由所述引物组C和PCR缓冲液组成；
所述试剂D由所述引物组D和PCR缓冲液组成；所述试剂E由所述引物组E和PCR缓冲液组成。在上述PCR试剂中，所述试剂A-试剂E均为独立包装；在上述PCR试剂中，上述引物1-引物10在其对应的试剂中的终浓度均为 0. 4-4pmol/y 1 ；在本发明的实施例中终浓度均为0. 4pmol/y 1 ；在上述PCR试剂中，所述PCR缓冲液均购自北京全式金生物技术有限公司。在上述PCR试剂中，所述猪流感病毒为如下1)或2)1)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒；2)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的至少一种。本发明的第三个目的是提供一种检测猪流感病毒的试剂盒。本发明提供的试剂盒，由试剂盒A-试剂盒E组成；
所述试剂盒A为含有所述试剂中的试剂A ；所述试剂盒B为含有所述试剂中的试剂B ；所述试剂盒C为含有所述试剂中的试剂C ；所述试剂盒D为含有所述试剂中的试剂D ；所述试剂盒E为含有所述试剂中的试剂E。在上述试剂盒中，所述试剂盒A-试剂盒E均为独立包装；在上述试剂盒中，所述猪流感病毒为如下1)或2):1)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒；2)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的至少一种。上述引物或上述试剂或上述试剂盒在制备检测猪流感病毒产品中的应用也是本发明保护的范围； 或上述引物或上述试剂或上述试剂盒在检测猪流感病毒中的应用也是本发明保护的范围；在上述的应用中，所述猪流感病毒具体为如下1)或2):1)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒；2)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的至少一种。本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测猪流感病毒的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用上述引物或上述试剂或上述试剂盒的引物组A-E共同对待测猪进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物；检测扩增产物，若扩增产物为195bp、278bp、382bp、518bp和684bp中的至少一种或两种或全部， 则所述待测猪为或候选为类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl 亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的至少一种或两种或全部感染；若扩增产物不为195bp、278bp、382bp、518bp和684bp中的任——种，则所述待测猪不为或候选不为类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的任意一种；具体为若扩增产物为684bp的片段，则所述待测猪为或候选为H5亚型流感病毒感染；反之，则所述待测猪不为或候选不为H5亚型流感病毒感染；若扩增产物为I^bp的片段，则所述待测猪为或为含有H3亚型猪流感病毒感染； 反之，则所述待测猪不为或候选不为H3亚型猪流感病毒感染；若扩增产物为518bp的片段，则所述待测猪为或候选为H9亚型猪流感病毒感染； 反之，则所述待测猪不为或候选不为H9亚型猪流感病毒感染；若扩增产物为382bp的片段，则所述待测猪为或候选为经典Hl亚型猪流感病毒感染；反之，则所述待测猪不为或候选不为经典Hl亚型猪流感病毒感染；若扩增产物为278bp的片段，则所述待测猪为或候选为欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒感染；反之，则所述待测猪不为或候选不为欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒感染。若扩增产物为278bp和195bp的片段，则所述待测猪为或候选为欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒和H3亚型猪流感病毒感染；反之，则所述待测猪不为或候选不为欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒和H3亚型猪流感病毒感染。若扩增产物为382bp和195bp的片段，则所述待测猪为或候选为经典Hl亚型猪流感病毒和H3亚型猪流感病毒感染；反之，则所述待测猪不为或候选不为经典Hl亚型猪流感病毒和H3亚型猪流感病毒感染；若扩增产物为195bp、278bp、382bp、518bp和684bp的大小，则所述待测猪含有或
候选含有类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、 H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒；若扩增产物不含有l%bp、27m3p、38^p、518bp和684bp的大小，则所述待测猪不含有或候选不含有类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒；在上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为50°C ；在上述方法中，所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
由于猪在流感病毒的传播过程中具有混合器的作用，因此在临床中往往不能马上区分疑似病例是哪个亚型、谱系猪流感病毒的感染。本发明的实验证明，本发明提供的引物组，可以通过提取样品RNA，反转录合成 cDNA,再一次性同时对可能存在的经典HI、欧洲类禽H1、H3、H9、H5基因进行扩增，一次性鉴定出猪流感病毒的亚型及谱系。本发明较经典病毒分离鉴定及血清学分型试验快速、准确。
图1为猪流感病毒分型、鉴定特异性引物特异性鉴定结果图2为检测引物对类人H3亚型猪流感病毒灵敏度鉴定结果图3为检测引物对欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒灵敏度检测结果图4为检测引物对经典Hl亚型猪流感病毒灵敏度检测结果图5为检测引物对H9亚型猪流感病毒毒灵敏度检测结果图6为检测引物对H5亚型猪流感病毒灵敏度检测结果图7为检测引物对H3亚型、欧洲类禽Hl亚型、经典Hl亚型、H9亚型、H5亚型猪流
感病毒、H5亚型猪流感病毒毒灵敏度检测结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、引物的设计1、引物的设计根据Genbank登录的已发表的HA基因属于经典Hl亚型猪流感病毒毒株(Genbank 登录号 GU086009、EU502885、GU086041、GU086033、GU086081、EF556199、GQl 17044、 ADT79242)、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒(Genbank登录号FJ536762、FJ536810)、类人H3亚型猪流感病毒(Genbank登录号GU086089、EU655695、GU086097、EU65569》、H9亚型猪流感病毒(Genbank 登录号 DQ981586、DQ981M6)、H5 亚型流感病毒(Genbank 登录号 DQ100557、 DQ997392、DQ997076、AY747609、DQ432037、DQ997262, AY646424)的高度保守序列，设计 5 对特异性引物(SH3-420F、SH3-614R ；SEAH1-218F、SEA-H1-415R ；SCH1-153F、SCH1-534R ； SH9-643F、SH9-1160R ；SH5-379F、SH5-1063R)。预期扩增的片段大小分别为 H3A :195bp ； SEA-HlA :278bp ；SC-HlA :382bp ；S-H9A :518bp ；S-H5A :684bp。SH3-420F :5，-TCAGGCACTCTGGAGTTTAT-3，(引物 1，序列 1)SH3-614R 5' -AATGTATAGTTTGTCAGAGTTGTC-3‘(引物 2，序列 1)SEAH1-218F :5，-TGGGAAGATCCCCTTACAAC-3，(引物 3，序列 3)SEA-H 1-415R :5，-GGGAGCATGCAACTGTGGT-3，(引物 4，序列 4)SCH1-153F :5，-GTAACAGTAACACACTCTGTffAACC-3‘(引物 5，序列 5)SCH1-534R 5' -GCCATATTAAATTTYTGTAGAAG-3‘(引物 6，序列 6)SH9-643F :5，-ACAAGGACTGACACAACAACAAG-3，(引物 7，序列 7)SH9 :1160R 5' -CTATCTGCTGCCATACCAACC-3，(引物 8，序列 8)SH5-379F 5，-GAAACACCTATTGAGCAGAATA-3，(引物 9，序列 9)
SH5-1063R :5，-CTTTTTCTTMYTCTCTCTCTTTG-3，(引物 10，序列 10)2、引物特异性检测(1)、病毒RNA的提取按照Trizol说明书说明书分别提取灭活的经典Hl亚型猪流感病毒(Bi Y,Fu G， Chen J,Peng J,Sun Y,Wang J,Pu J,Zhang Y,Gao H,Ma G, Tian F,Brown IH,Liu J. Novel swine influenza virus reassortants in pigs, China. Emrging Infectious Diseases, 2010,16(7) :1162-1164.公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得)、类人H3亚型猪流感病毒(Bi Y, Fu G, Chen J, Peng J, Sun Y, Wang J, Pu J, Zhang Y, Gao H, Ma G, Tian F, Brown IH, Liu J. Novel swine influenza virus reassortants in pigs, China. Emrging Infectious Diseases, 2010,16(7) :1162-1164.公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得)、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒(Liu J，Bi Y, Qin K, Fu G，Yang J, Peng J, Ma G, Liu Q, Pu J, Tian F. Emergence of European avian influenza virus-like HlNl swine influenza A viruses in China. Journal of Clinical Microbiology,2009,47(8) 2643-2646.公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得)、H9亚型猪流感病毒(Cong YL,Wang CF,Yan CM,Peng JS,Jiang ZL,Liu JH. Swine infection with H9N2 influenza viruses in China in 2004. Virus Genes. 2008 Jun ；36 (3) :461-469 公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得)、H5亚型流感病毒(Liu J，Xiao H，Lei F，Zhu Q，Qin K，Zhang Xff, Zhang XL, Zhao D, Wang G, Feng Y, Ma J, Liu W,Wang J,Gao GF. Highly pathogenic H5N 1 influenza virus infection in migratory birds.公众可从山东省云力物疫病预防与控制中心获得)的5种病毒的RNA。将5种灭活的混合病毒(欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、 类人H3亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒、H5亚型流感病毒)以每种为IO4TCID5tl病毒含量剂量混合，得到5种混合病毒，提取5种混合病毒的RNA，得到混合RNA。具体操作如下1)250 μ 1病毒加入750ml Trizol液后，剧烈震荡，室温(25°C )放置5 10分钟；2)加入250 μ 1氯仿，剧烈震荡，室温防治5分钟；3) 12000 X g 离心 15 分钟；4)吸取上清，加入等倍体积异丙醇，混勻，室温放置10分钟；5) 12000 Xg离心15分钟，弃上清，用75%酒精(无RNA酶水配置)，缓慢加入混勻；6) 12000 Xg离心5分钟，完全去除酒精，于常温、超净台中干燥5分钟，用10 μ 1无 RNA酶水溶解，分别得欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒RNAJSW Hl亚型猪流感病毒RNA、类人 Η3亚型猪流感病毒RNA、Η9亚型猪流感病毒RNA、Η5亚型流感病毒RNA和其混合RNA。(2)、病毒RNA的反转录(RT)A 液RNA:5μ 1反转录引物iAGCAAAAGCAGG^M^^lOpmol/μ 1) :1μ 1总体积6μ170 °C水浴5分钟后，冰浴5分钟；
B 反转录(RT)5 X AMV Buffer dNIPs (各 2. 5mM)RNasin (40U/μ L)AMV (5U/ μ L)
4μ 1 4μ 1 1 μ 1 1 μ 1无RNA 酶水A液总体积
4μ 1 6 μ 1 20 μ 1混勻后，42°C 1小时，70°C 5分钟，分别反转录得到5种病毒的cDNA 欧洲类禽Hl 亚型猪流感病毒cDNA、经典Hl亚型猪流感病毒cDNA、类人H3亚型猪流感病毒cDNA、H9亚型猪流感病毒cDNA、H5亚型流感病毒cDNA和其混合cDNA。(3)、多重 PCR 鉴定下述PCR体系中的cDNA分别为欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒cDNA、经典Hl亚型猪流感病毒cDNA、类人H3亚型猪流感病毒cDNA、H9亚型猪流感病毒cDNA、H5亚型流感病毒 cDNA和混合cDNA。2XTaq Mix (含2. 5mM dNTPsU. 5mM Mg2+,北京全式金生物技术有限公司) 12. 5μ 1cDNA 2. 5μ 15对引物(每条引物在体系的终浓度为0.4ρπιΟ1/μ 1) 10 μ 1总体积25 μ 1扩增条件94°C预变性3分钟；94°C预变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸40秒， 共35个循环；72°C延伸10分钟。同时设立以水为模版的阴性对照。取ΙΟμΙ PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，以DL2000或DL5000作为 Marker,以lOV/cm电场强度，电泳20分钟后，紫外线下利用凝胶成相系统PCR结果。结果见图1所示，1. H5亚型猪流感病毒检测结果；2. H9亚型猪流感病毒检测结果； 3.经典Hl亚型猪流感病毒检测结果；4.欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒检测结果；5.类人H3 亚型猪流感病毒检测结果；6.特异性引物对组合对5种混合病毒的检测结果；7. DNAMarker DL5000 (从上至下依次为 5000bp、2500bp、2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp)； 8. PRRSV (王美君，陈静，孙圣福，马慧玲2，田夫林，姜世金.PRRSV持续性感染猪群抗体动态观察及对猪瘟疫苗免疫的影响中国兽医学报，2011,31 (5) =630-632.公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得)检测结果；9.PCV-2(田夫林，吴巧玲，王金宝，陈静，马慧玲， 孙圣福，陈书民，倪娇，姜秀云.山东猪圆环病毒病的流行病学调查.中国兽医杂志2007， 43(4) :30-31.公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得)检测结果；10. CSFV(叶丙鑫，兰邹然，田夫林，单虎，曾巧英.山东省猪瘟流行毒株E2基因主要抗原编码区序列差异分析.甘肃农业大学学报.2001,1 :20-24，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得) 检测结果；11.阴性对照(水)。可以看出，H5亚型流感病毒得到684bp (Genbank登录号AY6464M的第 379bp-1063bp位)的PCR产物、H9亚型猪流感病毒得到518bp (Genbank登录号CY0750M 的第643bp-l 160bp位)的PCR产物、经典Hl亚型猪流感病毒得到382bp (Genbank登录号⑶086009的第153bp-534bp位)的pcr产物、欧洲类禽hl亚型猪流感病毒得到 27^ρ (genbank登录号fj536762的第218bp_415bp位)的pcr产物、类人h3亚型猪流感病毒得到195bp (genbank登录号eu655695的第420bp_614bp位)的pcr产物，5种混合病毒得到 l%bp、27^dp、3^bp、5wbp、684bp(分别为 genbank 登录号 eu655695 的第 420bp-614bp 位、genbank 登录号 fj536762 的第 218bp_415bp 位、genbank 登录号 gu086009 的第 15;3bp-5;34bp 位、genbank 登录号 cy0750m 的第 643bp_1160bp 位、genbank 登录号 ay646424的第379bp_1063bp位)的pcr产物，而泳道8_9均无片段扩增，说明引物具有高的特异性。3、敏感性试验分别将欧洲类禽hl亚型猪流感病毒cdna、经典hl亚型猪流感病毒cdna、类人h3 亚型猪流感病毒cdna、h9亚型猪流感病毒cdna、h5亚型流感病毒cdna每种病毒均稀释为io4uo3uo2uo1tcid5q [稀释液为pbs缓冲液(ο.οιμ, ρη7· 3)，上海百赛生物技术有限公司]，同时分别将每种病毒的每种稀释浓度混合，并按照上述2的(1)-(4)步骤分别进行 rna提取、反转录、pcr、pcr产物检测鉴定。结果如图2-图7所示，其中，图2为检测引物对类人h3亚型猪流感病毒灵敏度鉴定结果；图3为检测引物对欧洲类禽hl亚型猪流感病毒灵敏度检测结果；图4为检测引物对经典hl亚型猪流感病毒灵敏度检测结果；图5为检测引物对h9亚型猪流感病毒毒灵敏度检测结果；图6为检测引物对h5亚型猪流感病毒灵敏度检测结果；图7为检测引物对h3 亚型、欧洲类禽hl亚型、经典hl亚型、h9亚型和h5亚型猪流感病毒混合样品的灵敏度检测结果；且每图中的泳道1-4分别为104、io3uo2uo1tcid5q病毒含量，泳道5为dna marker dl5000(从上至下依次为 5000bp、2500bp、2000bp、iooobp、750bp、500bp、250bp、ioobp)或 dna marker dl2000 (从上倒下依次为 2000b ρ、1000bp、750b p、500bp、250bp、ioobp)，从图中可以看出，无论单独的病毒还是混合的病毒，均可以检测到io2tcid5tl病毒，说明引物的灵敏度高。实施例2、引物的应用1、待检病料的处理将编号为1-7的疑似发病猪(来源于广东省等散养殖户)的鼻试纸用灭菌水重悬，提取rna，方法同实施例1的2的步骤(1)，得到编号为1-7的猪的 rna。2、多重pcr检测将上述编号为1-7的猪的rna反转录得到cdna，方法同实施例1的2的步骤⑵， 分别得到编号为1-7的猪的cdna。分别以上述编号为1-7的猪的cdna作为模板，以5对引物作为引物，进行pcr扩增，扩增体系和扩增条件同实施例1的2的步骤(3)。若扩增产物为684bp的片段，则所述待测猪为或候选为h5亚型流感病毒感染；反之，则所述待测猪不为或候选不为h5亚型流感病毒感染；若扩增产物为518bp的片段，则所述待测猪为或候选为h9亚型猪流感病毒感染； 反之，则所述待测猪不为或候选不为h9亚型猪流感病毒感染；若扩增产物为382bp的片段，则所述待测猪为或候选为经典hl亚型猪流感病毒感染；反之，则所述待测猪不为或候选不为经典hl亚型猪流感病毒感染；
若扩增产物为278bp的片段，则所述待测猪为或候选为欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒感染；反之，则所述待测猪不为或候选不为欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒感染。若扩增产物为I^bp的片段，则所述待测猪为或为含有H3亚型猪流感病毒感染； 反之，则所述待测猪不为或候选不为H3亚型猪流感病毒感染；若扩增产物为278bp和195bp的片段，则所述待测猪为或候选为欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒和H3亚型猪流感病毒感染；反之，则所述待测猪不为或候选不为欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒和H3亚型猪流感病毒感染。若扩增产物为382bp和195bp的片段，则所述待测猪为或候选为经典Hl亚型猪流感病毒和H3亚型猪流感病毒感染；反之，则所述待测猪不为或候选不为经典Hl亚型猪流感病毒和H3亚型猪流感病毒感染。若扩增产物不含有l%bp、27m3p、38^p、518bp和684bp的大小，则所述待测猪不含有或候选不含有类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的任意一种；结果如下编号为1的猪得到518bp的片段，即为H9亚型猪流感病毒感染；编号为2的猪得到I^bp的片段，即为H3亚型猪流感病毒感染；编号为3的猪得到382bp的片段，即为经典Hl亚型猪流感病毒感染；编号为4的猪得到278bp的片段，即为欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒感染；编号为5的猪得到278bp和195p的片段，即为欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒和H3 亚型猪流感病毒感染；编号为6的猪得到382bp和195p的片段，即为经典Hl亚型猪流感病毒和H3亚型
猪流感病毒感染；编号为7的猪未得到l%bp、27m3p、38^p、518bp和684bp的大小片段中的任意一种，即不感染欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、类人H3亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒。分别将上述的PCR产物克隆入pMD-18T载体(大连宝生物公司)进行测序。测序由北京华大基因研究中心完成，结果如下518bp 为 Genbank 登录号 DQ981586 的片段，为 A/swine/Henan/2/2004 (H9N2)病毒的HA基因；195bp 为 Genbank 登录号 GU086089 的片段，为 A/swine/Guangdong/7/06 (H3N2)病毒的HA基因；382bp 为 Genbank 登录号 GU086009 的片段，为 A/swine/Guangdong/33/06 (HlNl) 病毒的HA基因；278bp 为 Genbank 登录号 FJ536762 的片段，为 A/swine/Beijing/21/2008 (HlNl) 病毒的HA基因；编号为1-7的样本的检测结果与本发明的方法一致，说明本发明的方法正确。从上述可以看出，本发明利用5对特异性引物，通过约3小时，采用优化的多重 RT-PCR反应系统，成功地扩增出经典!11、欧洲类禽!11、!13、!15、!19不同谱系及亚型的每种病毒的特异性 HA 基因片。GD/7/06 (H3)为 195bp、BJ/21/08 (Hl)为 278bp、GD/33/06 (HI)为382bp、ΗΝ/2/04为518bp、QH/05 (Η5)为684bp ；该引物反应系统特异性良好，各谱系和亚型间无交叉干扰，同时猪常见病毒PRSSV、PCV-2、CFSV亦无非特异性扩增；该引物反应系统敏感性良好，能最低检测出IO2TCID5tl的病毒含量。
权利要求
1.一种检测猪流感病毒的引物，由引物组A-引物组E组成 所述引物组A由引物1和引物2组成；所述引物组B由引物3和引物4组成， 所述引物组C由引物5和引物6组成， 所述引物组D由引物7和引物8组成， 所述引物组E由引物9和引物10组成，所述引物1-引物10的核苷酸序列分别依次为序列表中序列1-序列10。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于 所述引物组A-引物组E均为独立包装。
3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于 所述猪流感病毒为如下1)或2):1)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、 H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒；2)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、 H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的至少一种。
4.一种检测猪流感病毒的PCR试剂，由试剂A-试剂E组成； 所述试剂A由所述引物组A和PCR缓冲液组成；所述试剂B由所述引物组B和PCR缓冲液组成； 所述试剂C由所述引物组C和PCR缓冲液组成； 所述试剂D由所述引物组D和PCR缓冲液组成； 所述试剂E由所述引物组E和PCR缓冲液组成。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于 所述试剂A-试剂E均为独立包装；所述引物1-10在其对应的试剂中的终浓度均为0. 4ρπι01/μ 1-4ρπι01/μ 1，所述引物 1-10在其对应的试剂中的终浓度均具体为0. 4pmol/y 1 ； 所述猪流感病毒为如下1)或2):1)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、 H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒；2)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、 H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的至少一种。
6.一种检测猪流感病毒的试剂盒，由试剂盒A-试剂盒E组成； 所述试剂盒A为含有权利要求4或5所述试剂中的试剂A ； 所述试剂盒B为含有权利要求4或5所述试剂中的试剂B ； 所述试剂盒C为含有权利要求4或5所述试剂中的试剂C ； 所述试剂盒D为含有权利要求4或5所述试剂中的试剂D ； 所述试剂盒E为含有权利要求4或5所述试剂中的试剂E。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于 所述试剂盒A-试剂盒E均为独立包装；所述猪流感病毒为如下1)或2):1)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、 H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒；2)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、 H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的至少一种。
8.权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或5所述试剂或权利要求6或7所述试剂盒在制备检测猪流感病毒产品中的应用；或权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或5所述试剂或权利要求6或7所述试剂盒在检测猪流感病毒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特性在在于所述猪流感病毒为如下1)或2):1)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、 H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒；2)类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、 H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的至少一种。
10.一种检测或辅助检测猪流感病毒的方法，包括如下步骤用权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或5所述试剂或权利要求6或7所述试剂盒的所述引物组A-E共同对待测猪进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测扩增产物，若扩增产物为195bp、278bp、382bp、518bp和684bp中的至少一种或两种或全部，则所述待测猪为或候选为类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的至少一种或两种或全部感染；若扩增产物不为l%bp、278bp、382bp、518bp和684bp中的任——种，则所述待测猪不为或候选不为类人H3亚型猪流感病毒、欧洲类禽Hl亚型猪流感病毒、经典Hl亚型猪流感病毒、H9亚型猪流感病毒和H5亚型流感病毒中的任意一种；所述PCR扩增的退火温度为50°C ；所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定猪流感病毒的引物及其应用。本发明提供的检测猪流感病毒的引物。本发明提供的引物，由引物组A-引物组E组成所述引物组A由引物1和引物2组成；所述引物组B由引物3和引物4组成，所述引物组C由引物5和引物6组成，所述引物组D由引物7和引物8组成，所述引物组E由引物9和引物10组成，所述引物1-引物10的核苷酸序列分别为序列表中序列1-序列10。本发明的实验证明，本发明提供的引物组，可以通过提取样品RNA，反转录合成cDNA，再一次性同时对可能存在的H1、H3、H9、H5基因进行扩增，一次性鉴定出猪流感病毒的亚型及谱系。本发明较经典病毒分离鉴定及血清学分型试验快速、准确。
文档编号C12Q1/68GK102399906SQ20111037305
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月22日 优先权日2011年11月22日
发明者兰邹然, 刘金华, 张进林, 李云岗, 毕玉海, 田夫林, 陈静 申请人:山东省动物疫病预防与控制中心