专利名称：一种用于提取核酸和质谱点样的自动化仪器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于提取核酸和点样芯片的自动化仪器，通过利用磁珠法提取体液中核酸、并实现质谱芯片点样的自动化仪器，可用来制备生物芯片，因此属于核酸检测领域。
背景技术：
核酸研究是现代生物学、医学研究中的重要课题。核酸作为遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，除了在生物体正常的生长、发育、和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用外，它与生命的异常情况，如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系，在已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关，如人类镰刀形红血细胞贫血症是由于患者的血红蛋白分子中一个氨基酸的遗传密码发生了改变，白化病患者则是DNA分子上缺乏产生促黑色素生成的酷氨酸酶的基因所致；而且肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。70年代以来兴起的遗传工程，使人们可用人工方法改组DNA，从而有可能创造出新型的生物品种。核酸的发现已有100多年的历史，但人们对它真正有所认识不过近60年的事。 1868年，瑞士科学家米歇尔采用胃蛋白酶对细胞的成分进行研究，他发现细胞中有不被胃蛋白酶溶解的物质——非蛋白质，他称之为“核素”；1888年，英国科学家曼特尔发现核素是一种弱酸性非蛋白物质并命名为“核酸”；1953年，美国科学家沃森、克里克共同证实核酸是一种双螺旋结构，有自我复制能力，能传递信息。脱氧核糖核酸(DNA )具有遗传功能，核糖核酸(RNA )具有蛋白的重组合能力；1992年联合国特别组织了“人体阿波罗计划”委员会，以协调国际间的研究，提出对人体10万个基因，30亿信息定位，从而勾划出揭开人类生命蓝图奥秘的目标。这项研究由中、美、英、日等六国参与；2003年4月15日六国领导人宣布人类基因组序列图完成，这意味着对人类生老病死(特别是非传染性疾病) 等产生巨大影响的全部遗传信息已被破译，人类找到了打开生命大门的钥匙。因此，国际遗传学大会指出“不论是器质性疾病还是功能性疾病，都有必要在基因水平上去探讨病因”， “人类正常的衰老和死亡，也是受到基因的调控”。这就为发展和利用核酸为人类健康与长寿服务提供了科学依据。因此核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。随着分子生物学技术广泛应用于生物学，医学以及相关领域，核酸的检测和分析在遗传性疾病，肿瘤和传染病等领域的运用日益广泛，由此带来了疾病诊断模式和治疗策略的不断更新，并揭示了基因结构或表达异常相关的疾病的发病机制。各种新方法、经完善后的传统经典方法以及商品试剂方法的不断出现，为核酸的检测和分析提供了可靠的技术保障。近年来，在核酸的检测和分析中，出现了各种新型技术，例如核酸杂交技术、PCR扩增技术以及以PCR为基础的衍生技术、荧光标记技术、纳米检测技术、生物芯片技术、生物质谱技术等等。核酸杂交技术是建立最早、最基本核酸检测技术，核酸分子杂交是指具有一定互补序列的核酸(RNA或DNA )单链在液相或固相体系中按碱基配对原则缔合成异质双链的过程，应用该技术可对特定DNA或RNA分子进行定性或定量的检测。核酸杂交技术常用的方法有=DNA斑点杂交/RNA狭线杂交，微孔板杂交，southern印迹杂交，northern印迹杂交，原为杂交组织(细胞)化学。该技术的关键工具是探针，即人工制备的与待测核酸分子互补、标有不同标记物的单链DNA或RNA。核酸探针按其来源不同可分为通过克隆技术从基因文库中筛选的基因组探针、从RNA逆转录获得的cDNA探针和人工合成的寡核苷酸探针。
PCR扩增技术是利用聚合酶链反应，模拟DNA体内复制过程、将目的基因在体外扩增的技术。聚合酶链的反应(PCR)方法可使一种特异DNA扩增几百万倍，并已成为分子克隆和诊断的十分有用的工具。而PCR技术在近20年的不断发展创新中，最受瞩目当属荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量PCR技术真正实现了 PCR从定性到定量的飞跃，通过对PCR过程的实时监控，专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用荧光标记技术是指利用一些发射荧光的物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记是分析生物大分子及药物检测的重要方法，其检测的灵敏度很大程度上取决于标记物的发光强度和稳定性。随着现代医学，分子生物学和各种先进荧光检测仪器及技术的运用，荧光标记作为一种非放射性的标记技术已应用于生命科学的各个研究领域，并取得了迅速的发展。
纳米检测技术是指将纳米粒子作为标记物，与核酸分子进行杂交，将杂交信号转化为电或电化学信号，通过检测电信号确定检测对象的信息。纳米粒子和核酸的偶联主要有两种方法，一种是对核酸的末端进行化学基团的修饰，以便与纳米粒子结合，如金纳米粒子就是这种情况；而对于不易结合的纳米粒子，解决的策略是在这种纳米粒子上包裹一层膜或进行修饰，硅纳米粒子和量子点即是如此。纳米技术应用于核酸检测，成本低、时间短、 具有与PCR类似的敏感性，不需要复杂、大型、昂贵的仪器，使得核酸检测可以走出专业的实验室，在野外、家庭中得以进行。
生物芯片技术就是通过微加工工艺将大量生物识别分子如核酸片段、多肽分子， 甚至组织切片、细胞等按照预先设置的排列方式固定在厘米见方的芯片片基(基质或载体)上，利用生物分子之间的特异性亲和反应，实现对基因、配体、抗原等生物活性物质的检测分析.由于生物芯片采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概念，因此可同时并行分析成千上万种生物分子，具有高通量、高灵敏度和并行检测的特点。.其中，20世纪90 年代初出现的生物芯片技术是近年来核酸科学与微电子学等学科相互交叉的一门高新技术。生物芯片技术是通过微加工工艺，同时将大量的探针分子固定到固相支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取核酸样品分子的数量和序列信息并进行高效的解读和分析。
生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。生物芯片上高度集成的成千上万密集排列的分子微阵列，能够在很短时间内分析大量的生物分子，使人们能够快速准确地获取样品中的生物信息，检测效率是传统检测手段的成百上千倍。生物芯片将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。基因芯片是生物芯片技术中发展最成熟和最先实现商品化的产品。基因芯片是基于核酸探针互补杂交技术原理而研制的。所谓核酸探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接上一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。基因芯片，又称DNA芯片，DNA 微阵列，和我们日常所说的计算机芯片非常相似，只不过高度集成的不是半导体管，而是成千上万的网格状密集排列的基因探针，通过已知碱基顺序的DNA片段，来结合碱基互补序列的单链DNA，从而确定相应的序列，通过这种方式来识别异常基因或其产物等。目前，比较成熟的产品有检测基因突变的基因芯片和检测细胞基因表达水平的基因表达谱芯片。生物芯片技术主要包括四个基本技术环节芯片微阵列制备、样品制备、生物分子反应和信号的检测及分析。生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上， 所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blotting和Northern Blotting等)技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序(Sequencing by hybridization, SBH)等，为〃后基因组计划〃时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具，将会使新基因的发现、基因诊断、药物筛选、给药个性化等方面取得重大突破，为整个人类社会带来深刻广泛的变革。该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。质谱分析法主要是通过对样品的离子的JML比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。基本原理是将样品转化为运动的带电气态离子，于磁场中按质荷比(m/ ζ)大小分离并记录。质谱法是应用最为广泛的分析方法，它可以提供包括样品元素组成，无机、有机及生物分析的结构，复杂混合物的定量分析，固体表面结构和组成分析，样品中原子的同位素比。最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，随着离子光学理论的发展，质谱仪不断改进，其应用范围也在不断扩大，到20世纪50年代后期已广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测定。现今，质谱分析的足迹已遍布各个学科的技术领域，在固体物理、冶金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命科学领域的应用，更为质谱的发展注入了新的活力，形成了独特的生物质谱技术。近年来，以电喷雾质谱技术(eleetrosprayionization，ESI)和基质辅助激光解吸附质谱技术(matrix assisted laserdesortion/onizatio, MALDI)为基础的生物质谱技术，它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使准确分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，从而使大量合成寡核昔酸的快速分析成为现实。电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项轨电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol (10-12)甚至fmol (10-15) 的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，并得到迅速的发展。电喷雾质谱技术(ESI)是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大， 最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比(m/z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液一质联用(LC - MS)是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。
基质辅助激光解吸附质谱技术(MALDI-T0F)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。 MALDI产生的离子常用飞行时间检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-T0F质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。
现代质谱技术自诞生以来在多肽及蛋白质的研究中获得了极大的成功，于是人们开始偿试着特质谱技术用于核酸的研究工作，近年来合成寡核苷酸及其类似物作为反义治疗剂在病毒感染和一些癌症的治疗方面有着良好的前景，寡核苷酸作为药物其结构特征必须进行确证。常规的色谱或电泳技术只能对其浓度和纯度进行分析，而对其碱基组成、序列等结构信息却无能为力。
ESI和MALDI质谱技术的出现为寡核苷酸及其类似物的结构和序列分析提供了强有力的方法，它是将被测寡核苷酸样品先用外切酶从3’或5’端进行部分降解，在不同时间内分别取样进行质谱分析，获得寡核苷酸部分降解的分子离子峰信号，通过对相邻两个碎片分子质量进行比较，可以计算出被切割的核苷酸单体分子质量，将其与四个脱氧苷酸的标准分子量进行对照，就可以读出寡核苷酸的序列。由于MALDI技术分辨率的问题，使得其更适合于减基数较少的短链核酸的分析。
由于在核酸结构与功能的研究中(例如基因工程领域、蛋白质工程领域中的研究)，涉及核酸样品的分离纯化、核酸样品的处理、核酸样品的理化性质分析以及核酸样品的生物功能研究，这些研究分属不同的领域(例如无机和/有机化学、生物化学、生物物理、 生命科学)，涉及各种不同的技术(例如无机和/有机分离纯化技术、基因克隆技术、生物芯片技术、自动化操作技术)，因此上述各个研究环节需要各种不同的生物仪器，例如离心机、 PCR仪、核酸提取仪、核酸分离纯化仪、分液器、移液器、芯片点样仪、质谱仪。也就是说各种不同的生物仪器的使用特点和要求决定了在核酸结构与功能的研究中无法实现快速、直接、连续的实验操作。
由于目前国内主要采用的是半自动，甚至手工方法提取核酸，手工方法不仅耗时， 繁琐，而且核酸的提取效率低，并且无法有效的进行大规模，大批量的核酸提取与纯化分析工作。随着基因分型，DNA测序，基因诊断与治疗，基因扩增和目标DNA的定量分析等在科学研究以及临床诊断上的日益广泛的运用，目前急需一种能够实现核酸提取纯化分析的自动化仪器，以为研究工作以及疾病的快速诊断提供有力支撑。
发明内容
本发明的原理在于利用自动化机械臂完成核酸提取动作，然后通过自动导轨分别将提取的核酸通过分液器分装到样品板上、以及通过移液器将样品板转移到芯片点样仪上，通过点样仪制备基因芯片，通过质谱仪的激光采样，得到核酸的质谱图以及相关信息。因此，出于实现快速、直接、连续的核酸分析的研究目的，综合了磁珠法提取分离核酸、DNA芯片的优点，本发明第一个目的是提供一种用于生物质谱分析核酸样品的提取核酸和质谱点样芯片的连续操作过程的自动化仪器，包括
(1)核酸提取纯化装置1，包括三维步进电机11、磁棒121、磁棒套升降架131、磁棒套 122、磁棒套升降架132、用于纵向移动核酸样品板以接受磁棒121处理的纵向推进架141、 用于将提取纯化后的样品板横向移动到核酸移液分配装置的横向推进架142，其中磁棒 121和升降架131设置在磁棒套122及其升降架132的竖直上方，通过升降架131、132使得磁棒121能够竖直插入磁棒套122 ；三维步进电机11设置在磁棒/磁棒套及其升降架设置在的上方，使得磁棒套122能够前后左右上下运动并准确插入样品孔，以避免磁棒被样品污染和便于随时抽出磁棒121，从而实现磁珠瞬间吸附和脱离磁棒套122 ；
(2)核酸移液分配装置2，包括用于移动来自滑动平台20的样品板的导轨211、用于移动分配样品后多孔板的螺旋导轨212、自动移液器22、移液吸头盒(右)231及试剂盒(左) 232、吸头回收台24、移液分配前的多孔板251、移液分配后的多孔板252、用于控制移液器 22运动方向的三维运动部件26、移液分配前的多孔板载台28、移液分配后的多孔板磁力架载台29，其中自动移液器22设置在三维运动部件26的下方，可分别移动至移液吸头盒 231、试剂盒232、移液分配前的多孔板251、移液分配后的多孔板252、吸头回收台24的竖直上方，从而顺序完成装配吸头、吸取试剂、吸取且混合样品、转移分配样品、弃去吸头的自动化操作；
(3)质谱芯片点样装置3，包括点样针31、用于清洗和干燥点样针的处理槽32、用于控制点样针运动方向的三维运动部件33、图像采集器34、芯片及载台35，样品平板台36，其中点样针31设置在三维运动部件33的下方，可分别移动至处理槽32、点样样品平板台36、芯片载台35的竖直上方，从而顺序完成点样针的清洗和干燥、取样、点样的自动化操作。在一个实施方案中，在提取纯化装置1中，多孔样品板的深度应当与磁棒121相配，以配合磁棒插入孔中进行处理。在一个具体实施方案中，横向推进架142的下方设置平板加热器15，而纵向推进架141的下方设置平板振荡器16，可产生样品裂解和吸附所需的温度和振荡条件。在另一个具体实施方案中，在横向推进架142的下方起始位置可设置垂直升降机18，用于将样品板从存储空间中垂直升降到横向推进架142上。在另一个实施方案中，在所述分配装置2中，导轨211上有多个(优选4个)平板载台，用于承载并固定由核酸提取纯化装置上传送过来的承载有样品的多孔板251。在每个载台外周安装有四个挡板，用于固定多孔板。在一个具体实施方案中，导轨211上的前方还包括用于接纳并保藏样品板的冷藏容器27，因此导轨211既可将样品板直接移送到自动移液器22水平位置的下方，也可将样品多孔板移送到冷藏容器27进行保藏，以备保持样品稳定，直至需要时再从容器27中移出样品多孔板。当样品板停在自动液压器22下方时，三维运动部件26驱动自动移液器水平移动，直至多孔板竖直上方，而后驱动移液器22垂直向下吸取核酸样品。在另一个具体实施方案中，样品板优选96孔样品板，移液器22优选96通道加样器，多孔容器板251优选384孔微孔板。还在一个具体实施方案中，所述螺旋导轨212 既可将多孔容器板252直接运输到质谱芯片点样装置中的样品平板台36，螺旋导轨212将多孔容器板252也可运送到PCR仪，待完成PCR之后再运送到质谱芯片点样装置中。
还在一个实施方案中，在质谱芯片点样装置3是电脑主机与触摸屏构成的控制系统，发送指令到运行系统。该控制系统集成所有运行系统的控制端，由电脑主机与各个系统进行直接通信，主要包括点样针31、用于清洗和干燥点样针的处理槽32、用于控制点样针运动方向的三维运动部件33、图像采集器34、芯片载台35。其中所述点样针31优选为M 针金属式滴液头，所述处理槽32包括酒精瓶321、用于容纳酒精的超声波清洗槽322、超纯水清洗槽323、废液槽324、干燥槽325，所述三维运动部件33主要包括分别控制X、Y、Z轴方向运动的螺旋导轨331、332、333。在一个具体实施方案中，处理槽还包括位于处理槽内部下方的压力泵(图中未显示)，用于将超纯水输送到处理槽，并对残留有样品的针头进行清洗、干燥。本发明第二个目的是提供使用上述自动化仪器，完成自动化提取核酸、移液分配以及质谱检测的方法，步骤包括(1)核酸提取纯化将样品加到样品板的裂解液孔中，并将磁棒121插入磁棒套122 中，然而一起插入裂解液孔中搅动样品液，随后加入磁珠以结合核酸，收集磁珠后，经过盐洗、三次洗涤、洗脱后，获得纯化的核酸样品；(2)核酸移液分配自动移液器22从移液吸头盒(右)231和试剂盒(左)吸取吸头和试剂后，再水平移动到多孔容器板251中吸取核酸溶液，而后水平转移至多孔容器板252中， 同时将吸头置于吸头回收台M进行回收。最后通过螺旋导轨212将移液分配后的多孔容器板252移出核酸移液分配装置；(3)质谱芯片点样将点样针31进行清洗和干燥后，吸取点样样品平板台36上的样品液滴，而后在芯片载台35上进行点样，并进行质谱检测。
在一个实施方案中，在所述提取纯化装步骤中，所述样品板优选96孔样品板，所述磁棒为96式磁棒、磁棒套为96式磁棒套。在一个具体实施方案中，所述96孔样品板依次密封容纳裂解液、磁珠、盐洗液、连续3次洗涤液、洗脱液，使得该装置可在封闭条件下完成核酸样品的裂解、磁珠吸附、盐洗磁珠、三次洗涤磁珠、从磁珠洗脱核酸、回收磁珠的过程。 在另一个具体实施方案中，通过横向推进架142的下方设置的垂直升降机18，将样品板从存储空间中垂直升降到横向推进架142上。
在另一实施方案中，核酸移液分配步骤中，移液器22优选96通道加样器，多孔容器板251优选384孔微孔板。在另一个实施方案中，导轨211上的前方还包括用于接纳并保藏样品板的冷藏容器27，因此导轨211既可将样品板直接移送到自动移液器22水平位置的下方，也可将样品多孔板移送到冷藏容器27进行保藏，以备保持样品稳定，直至需要时再从容器27中移出样品多孔板。当样品板停在自动液压器22下方时，三维运动部件沈驱动自动移液器水平移动，直至多孔板竖直上方，而后驱动移液器22垂直向下吸取核酸样品。在另一个具体实施方案中，通过自动移液器22将试剂盒232中的试剂以及核酸样品分配到多孔容器板252中，然后通过螺旋导轨212既可将多孔容器板252直接到质谱芯片点样装置的样品平板台36，也可运送到PCR仪，待完成PCR之后再运送到质谱芯片点样装置中。
还在另一个实施方案中，在质谱芯片点样步骤中，点样针预先依次在装有酒精的超声波清洗槽322、超纯水清洗槽323中清洗残留样品，并在干燥槽325中干燥，进入预点样状态，废液注入废液槽324中通过出水阀排出。然后移液分配后的多孔板磁力架载台29 带着多孔板252，通过下方设有纵向螺旋导轨212运输到质谱芯片点样装置的样品平板台 36。通过X轴导轨331、Y轴导轨332、Z轴导轨333控制点样针移动到样品台36上的样品板252的上方，吸取样品，并转移到芯片35并与基质均勻混合以进行点样。在一个具体实施方案中，所述样品板252是384微孔板，所述芯片35是384芯片，芯片台35后面还可设置有清洗系统用于移液管的清洗与干燥。。在另一个具体实施方案中，酒精槽321中依次将 100%,50%酒精注入超声波清洗槽322，以完成两次清洗过程。
图1 仪器整体立体图2 核酸提取纯化装置机械放大图3 磁棒、磁棒套及其升降架与样品板的实践操作图4 磁棒和磁珠系统提取纯化核酸流程图5 纯化后的样品板横向移动到核酸移液分配装置的导轨过程图6 核酸移液分配装置机械放大图7 质谱芯片点样装置机械放大图8 质谱芯片点样装置中处理槽的机械放大图9:质谱芯片点样针安装图10:质谱检测结果图。图例说明
1-核酸提取系统
11:步进电机 121:磁棒122:磁棒套；131:磁棒升降架；132 磁棒套升降架 141:纵向推进架；142:横向推进架；15:平板加热器；16:平板振荡器 17 升降电机(未显示)，18 垂直升降机
2-核酸分配系统
20 滑动平台，211 导轨，212 螺旋导轨，22 自动移液器，231 移液吸头盒(右)， 232 试剂盒(左)，24 吸头回收台，251 移液分配前的多孔板，252 移液分配后的多孔板， 26 三维运动部件，27 冷藏室，28 移液分配前的多孔板载台，29 移液分配后的多孔板磁力架载台
3-核酸质谱点样系统
31 点样针，32 处理槽(包括321 酒精瓶，322 超声波清洗槽，323 超纯水清洗槽， 324 废液槽，325 干燥池)，33 三维运动部件(包括331 :X轴导轨，332 :y轴导轨，333 :Z轴导轨)，34:图像采集器，35:芯片载台35，36:点样样品平板台 4一防护罩。技术效果
1、仪器中的核酸提取纯化装置是在封闭环境中，通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脱液洗脱即得到纯净的DNA。该装置能减少核酸的感染和污染机率，降低耗材的浪费，提高效率，减少人工操作，提高提纯度，准确完成核酸提取，杜绝人为操作可能引起的污染，防止人员受到样品感染。
2、仪器中的核酸提取装置，可通过外部电脑主机的指令，在预设程序的控制下，对核酸进行加热、磁珠转移、清洗，洗脱等操作，可得到纯净的DNA样品溶液且一次性处理大量样本大大提高了工作效率。
3、仪器中的核酸提取装置，在提取核酸的过程中每层96深孔板都有盖子覆盖且工作完全在玻璃罩中，这样防止了药品的交叉污染。运动装置完全采用螺线定位机制定位准确，是仪器的微小定量运动成为可能。
4、仪器中的移液分配装置，既能及时准确定量转移和分配核酸样品，还可自动化冷藏，极大克服了实验过程对于时间和材料新鲜的苛刻要求，因此减少了操作人员的疲劳程度。
5、仪器中的质谱点样装置，能够实现高精度控制点液体积，高净度控制点液质量， 高效完成大批量的样品点样需求；同时，通过在电脑程序控制下完成样品的均勻分配，避免手工操作引起的体积误差和可能的外来污染，同时提高了点样的速度和效率。
6、本仪器通过合理的工程设计，将核酸提取纯化、样品分配和点样质谱三个独立实验过程巧妙地整合到一个操纵仪器中，实现无交叉感染，无菌的操作过程，整合后的仪器大大减轻了操作人员的劳动强度，减少了人工操作过程中的失误和感染，增强了生物芯片制备过程的安全性，有效性，加快了合适检测与分析的自动化进程，为分子生物学的研究提供了一种现代化的工具。
7、另外，整合后的仪器，各个装置安置合理，空间利用率高，且所有操作过程由软件控制，智能化设计，自动完成核酸的提取纯化过程，节省了实验人员的时间和精力，使核酸提取和质谱检测工作变得轻松、简便。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。但以下所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。实施例一体液中核酸样品的提取分离(参见图3-5) 1加试剂和样品在观块96式深孔板中，依次加入裂解液、磁珠、盐洗液、洗涤液、洗涤液、洗涤液、洗脱液，并用封口膜将96式深孔板封好，并置于适度的环境中。其中所述裂解液、磁珠、盐洗液、 洗涤液、洗脱液均可使用已知的磁珠DNA提取试剂盒中的试剂，例如上海工硕生物技术有限公司的96孔磁珠组织DNA提取试剂盒(产品目录号M6229-00 )，上海亿欣生物科技有限公司的磁珠血液DNA提取试剂盒(产品目录号M6221-01)。
将已经添加了对应试剂的7块96式深孔板，按照裂解液-磁珠-盐洗液-洗涤液-洗涤液-洗涤液-洗脱液的顺序，依次分为4层，叠放在垂直升降机上18。
3设置方法和参数利用外置的电脑，设置包括裂解时间、盐洗时间和位置等磁棒121和磁珠的运动路径， 洗涤时间，洗脱时间。4自动提取与纯化
设置完毕所有参数，开始提取。此时磁棒升降架131、磁棒套升降架132将开始上下移动并配合水平移动装置，使得磁棒联合磁棒套在磁珠孔中吸取磁珠后至裂解液孔中，移开磁棒，使磁珠与核酸充分结合后，收集磁珠。将磁棒连同磁棒套移至盐洗孔，移开磁棒。样品充分盐洗之后，再次插入磁棒，连同磁棒套移至洗涤孔中。在洗涤孔中，经过3次洗涤后， 将磁珠晾干并移至洗脱孔中。抽出磁棒，充分洗脱后，回收磁珠，并归位仪器。所有样品的裂解、结合、洗涤、释放等过程，均可通过平板加热器15和平板振荡器16进行处理。最后提取的核酸都移动到了横向推进装置142上方的96深孔板里。这样就完成了第一层平板的核酸样品的提取。待提取完后前6个96式深孔板会通过纵向推进装置141推到后面的96深孔板回收升降架上，第7个含有核酸的深孔板将通过横向推进装置142、经过滑动平台20传送到核酸移液分配装置中，当纵向推进器141复位后升降机18会升高一层使第二层深孔板达到预定位置同时回收装置中的升降机会下降一层以便回收下一层深孔板。实施例二 电脑自动化控制的核酸移液分配装置(参见图6) 1核酸的冷藏
当由核酸提取装置运送来的含有提取核酸的96式深孔板251进入核酸移液分配装置中现有平板载台28承载，而后由底部运动装置延导轨21运入冷藏室27 ； 2试剂添加与核酸移动
待到依次完成了 4个96控深孔板的核酸提取后，再由冷藏室27内运出到96通道自动移液器22的水平下方。自动移液器22在三维运动部件26的带动下在移液吸头盒(右)231 和试剂盒(左)232吸取吸头和试剂后，加入试剂并将核酸移到384孔板磁力架载台29上的多孔板252上，然后通过螺旋导轨212运出。其间装有药品的试剂盒232以及更换吸头用的一次性吸头盒载架231和吸头回收台24都设置在96通道自动移液器22所能运动到不远的地方，以方便吸头的更换和药品的加入； 3核酸的PCR反应
当完成上述工作后384孔板载台29，通过纵向螺旋导轨212将移液分配后的384孔板252运出装置进行PCR反应，反应完成后再由载台运载进入质谱点样的样品平台36中进行下一步操作。或者，也可通过导轨212直接将384孔板252运到质谱点样的样品平台36 中进行下一步操作。实施例三芯片样品点样(参看图7-9)
打开进水阀门，通过进水口的进水管，将超纯水注入到超纯水清洗槽323中，在进水过程结束之后，关闭进水阀门。取样前，在酒精瓶321中注入100%的酒精溶液，倒置安装酒精瓶321使其100%的酒精溶液流向超声波清洗槽322并充满清洗槽中，将点样针31 (优选24针金属式滴液头) 插到容纳酒精的超声波清洗槽322中，浸泡30分钟，以清洗点样针31头上残留的样品。根据样品浓度的不同，选择合适的取液速度，取液深度，取液时间，点液速度，点液深度以及点液时间，将设置好的参数和方法保存下来。
取样开始，M针金属式滴液头31，首先在超纯水清洗槽中进行清洗，然后由三维运动部件33带动M针金属式滴液头31移动到干燥槽32c中，进行干燥，干燥结束，进入预点样状态。滴液头由X轴导轨331、Y轴导轨引导332、Z轴导轨引导333移动到384微孔板样品平板台36的正上方，以设置的取液速度，深度，时间，插入到384微孔板的样品中，然后移动到芯片载台35上，以设置的点液速度、深度、时间，与芯片表明接触，使得样品液体附在 384芯片上，完成点液操作。
点样完毕，重复点样之前的清洗操作，在使用一段时间之后，需要进行排废液与加超纯水。
排废液之前，观察废液液面显示柱，若高于70%，需排废液。此时，将出水口的出水管接出，打开出水阀，即可排除废液。
加超纯水之前，观察图7-8中纯水液面显示柱，若低于30%，需加水。此时，将进水口的进水管插入到外部超纯水的容器中，通过触摸屏，打开进水阀，即可进行加水操作。
实施例四质谱分析经过点样装置的点样操作，经过处理的样本，按照预定的体积，滴定到质谱芯片上，此时，将芯片放置到质谱仪的进样口中，设置点样程序，开始点样。经过质谱仪分析，质谱结果如图10所示，检测结果质谱峰单一，无杂峰。
1—核酸提取系统11:步进电机 121:磁棒122:磁棒套；131:磁棒升降架；132 磁棒套升降架 141:纵向推进架；142:横向推进架；15:平板加热器；16:平板振荡器 17 升降电机(未显示)，18 垂直升降机2-核酸分配系统20 滑动平台，211 导轨，212 螺旋导轨，22 自动移液器，231 移液吸头盒(右)， 232 试剂盒(左)，M 吸头回收台，251 移液分配前的多孔板，252 移液分配后的多孔板， 26 三维运动部件，27 冷藏室，28 移液分配前的多孔板载台，四移液分配后的多孔板磁力架载台3-核酸质谱点样系统31 点样针，32 处理槽(包括321 酒精瓶，322 超声波清洗槽，323 超纯水清洗槽， 324 废液槽，325 干燥池)，33 三维运动部件(包括331 :X轴导轨，332 :y轴导轨，333 :Z轴导轨)，34:图像采集器，35:芯片载台35，36:点样样品平板台4-防护罩
权利要求
1.一种用于生物质谱分析核酸样品的提取核酸和质谱点样芯片的连续操作过程的自动化仪器，包括核酸提取纯化装置1，包括三维步进电机11、磁棒121、磁棒套升降架131、磁棒套122、 磁棒套升降架132、用于纵向移动核酸样品板以接受磁棒121处理的纵向推进架141、用于将提取纯化后的样品板横向移动到核酸移液分配装置的横向推进架142，其中磁棒121和升降架131设置在磁棒套122及其升降架132的竖直上方，通过升降架131、132使得磁棒 121能够竖直插入磁棒套122 ；三维步进电机11设置在磁棒/磁棒套及其升降架设置在的上方，使得磁棒套122能够前后左右上下运动并准确插入样品孔，以避免磁棒被样品污染和便于随时抽出磁棒121，从而实现磁珠瞬间吸附和脱离磁棒套122 ；核酸移液分配装置2，包括用于移动来自滑动平台20的样品板的导轨211、用于移动分配样品后多孔板的螺旋导轨212、自动移液器22、移液吸头盒(右)231及试剂盒(左)232、 吸头回收台24、移液分配前的多孔板251、移液分配后的多孔板252、用于控制移液器22运动方向的三维运动部件26、移液分配前的多孔板载台28、移液分配后的多孔板磁力架载台 29，其中自动移液器22设置在三维运动部件26的下方，可分别移动至移液吸头盒231、试剂盒232、移液分配前的多孔板251、移液分配后的多孔板252、吸头回收台24的竖直上方， 从而顺序完成装配吸头、吸取试剂、吸取且混合样品、转移分配样品、弃去吸头的自动化操作；质谱芯片点样装置3，包括点样针31、用于清洗和干燥点样针的处理槽32、用于控制点样针运动方向的三维运动部件33、图像采集器34、芯片及载台35，样品平板台36，其中点样针31设置在三维运动部件33的下方，可分别移动至处理槽32、点样样品平板台36、芯片载台35的竖直上方，从而顺序完成点样针的清洗和干燥、取样、点样的自动化操作。
2.权利要求1的自动化仪器，其中在提取纯化装置1中，所述样品板优选96孔样品板， 所述磁棒板优选96式磁棒、磁棒套板优选96式磁棒套；横向推进架142的下方设置平板加热器15，而纵向推进架141的下方设置平板振荡器16，可产生样品裂解和吸附所需的温度和振荡条件；在横向推进架142的下方起始位置可设置垂直升降机18，用于将样品板从存储空间中垂直升降到横向推进架142上。
3.权利要求1的自动化仪器，其中在所述分配装置2中，导轨211上有多个平板载台 28，用于承载并固定由核酸提取纯化装置上传送过来的承载有样品的多孔板251 ；导轨211 上的前方还包括用于接纳并保藏样品板的冷藏容器27。
4.权利要求3的自动化仪器，其中样品板是96孔样品板，移液器22是96通道加样器， 多孔容器板251是384孔微孔板；所述螺旋导轨212既可将多孔容器板252直接运输到质谱芯片点样装置中的样品平板台36，也可将多孔容器板252也可运送到PCR仪，待完成PCR 之后再运送到质谱芯片点样装置中。
5.权利要求1的自动化仪器，其中在质谱芯片点样装置3中，所述点样针31优选为24 针金属式滴液头；所述处理槽32包括酒精瓶321、用于容纳酒精的超声波清洗槽322、超纯水清洗槽323、废液槽324、干燥槽325 ；所述三维运动部件33主要包括分别控制X、Y、Z轴方向运动的螺旋导轨331、332、333 ；所述处理槽还包括位于处理槽内部下方的压力泵，用于将超纯水输送到处理槽，并对残留有样品的针头进行清洗、干燥。
6.使用权利要求1-5中任一项的自动化仪器，进行自动化提取核酸、移液分配以及质谱检测的方法，步骤包括(1)核酸提取纯化将样品加到样品板的裂解液孔中，并将磁棒121插入磁棒套122 中，然而一起插入裂解液孔中搅动样品液，随后加入磁珠以结合核酸，收集磁珠后，经过盐洗、三次洗涤、洗脱后，获得纯化的核酸样品；(2)核酸移液分配自动移液器22从移液吸头盒(右)231和试剂盒(左)吸取吸头和试剂后，再水平移动到多孔容器板251中吸取核酸溶液，而后水平转移至多孔容器板252中， 同时将吸头置于吸头回收台M进行回收，最后通过螺旋导轨212将移液分配后的多孔容器板252移出核酸移液分配装置；(3)质谱芯片点样将点样针31进行清洗和干燥后，吸取点样样品平板台36上的样品液滴，而后在芯片载台35上进行点样，并进行质谱检测。
7.权利要求6的方法，其中步骤1中，所述96孔样品板依次密封容纳裂解液、磁珠、盐洗液、连续3次洗涤液、洗脱液，使得该装置可在封闭条件下完成核酸样品的裂解、磁珠吸附、盐洗磁珠、三次洗涤磁珠、从磁珠洗脱核酸、回收磁珠的过程。
8.权利要求6的方法，其中步骤2中，当样品板停在自动液压器22下方时，三维运动部件沈驱动自动移液器水平移动，直至多孔板竖直上方，而后驱动移液器22垂直向下吸取核酸样品，然后通过自动移液器22将试剂盒232中的试剂以及核酸样品分配到多孔容器板 252中，然后通过螺旋导轨212既可将多孔容器板252直接到质谱芯片点样装置的样品平板台36，也可运送到PCR仪，待完成PCR之后再运送到质谱芯片点样装置中。
9.权利要求6的方法中，其中步骤3中，通过X轴导轨331、Y轴导轨332、Ζ轴导轨333 控制点样针移动到样品台36上的样品板252的上方，吸取样品，并转移到芯片35并与基质均勻混合以进行点样，且所述芯片35是384芯片。
10.权利要求9的方法，其中酒精槽321中依次将100%、50%酒精注入超声波清洗槽 322，然后点样针预先依次在装有酒精的超声波清洗槽322、超纯水清洗槽323中清洗残留样品，并在干燥槽325中干燥，废液注入废液槽324中通过出水阀排出，从而完成两次清洗过程，使得点样针进入预点样状态。
全文摘要
一种用于生物质谱分析核酸样品的提取核酸和质谱点样芯片的连续操作过程的自动化仪器，包括核酸提取纯化装置，核酸移液分配装置，质谱芯片点样装置三个主要装置，通过利用磁珠法提取体液中核酸，利用机械臂完成核酸提取动作，将提取的核酸通过分液器分装到样品板上，再通过移液器将样品板转移到芯片点样仪上，通过质谱仪的激光采样，得到核酸的质谱图以及相关信息，以实现快速、直接、连续的核酸分析。本仪器能够实现高精度控制点液体积，高净度控制点液质量，高效完成大批量的样品点样需求；同时，通过在电脑程序控制下完成样品的均匀分配，避免手工操作引起的体积误差和可能的外来污染，同时提高了点样的速度和效率。
文档编号C12Q1/68GK102492603SQ20111037280
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月22日 优先权日2011年11月22日
发明者时刊, 邢双艳, 马庆伟 申请人:马庆伟