专利名称：一种粪肠球菌的制作方法
技术领域：
本发明属于菌种领域，具体的说，涉及一种提取降纤酶的菌种。
背景技术：
血栓是血管系统内血液本身组成物形成的肿块，由血栓造成管道闭塞所导致的许多病变都属于血栓栓塞性疾病，如心肌梗塞、脑血栓、肺血栓、静脉血栓塞等。随着人类寿命的延长和饮食结构的改变，血栓栓塞性病例也明显增多，据世界卫生组织调查显示，全世界血塞性疾病患者不少于1500万人，血栓栓塞性疾病已成为当前危害人类健康，导致死亡率最高的疾病之一。
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目前，治疗血栓栓塞性疾病最为可靠并且有效的手段之一是溶栓疗法，即注射溶栓剂使血管再通。现行临床所用的溶栓剂主要是链激酶、尿激酶、葡激酶、人组织性纤维蛋白溶解酶原激活剂(tissue plasminogen activator, t_PA)、蝮蛇抗栓酶等,但链激酶、尿激酶、蝮蛇抗栓酶都有较大的副作用；t_PA虽与血栓基质纤维蛋白有较强的特异亲和力，能在血栓局部高效地激活纤溶系统，但它在血液中半衰期很短，而且血浆中的纤溶酶原激活剂的抑制剂可快速抑制其活性。葡激酶对纤维蛋白也有很强的特异性，但由于产率低且该菌本身的致病性，限制了它的应用。目前国际上已采用基因工程的方法对t-PA进行改造并生产出第三代溶栓药物——t-PA的突变体和嵌合体，其疗效有所改善，但是价格昂贵。因此，研制相对廉价、高效、快速、防止再栓塞及减低出血等不良反应的新型溶栓药物的需求迫切。自1987年日本学者Sumi等首先发现微生物纤溶酶(fibrinolytic enzyme)具有纤溶活性以来，微生物纤溶酶以其具有体内半衰期长、成本低廉等其它溶栓剂所不具备的特点，受到各国科学家的广泛关注和深入研究。从作用机理上划分，微生物来源的溶栓剂可以分成两类一类是纤溶酶原激活剂，如链激酶、葡激酶，其作用原理是纤溶酶原激活剂能将纤溶酶原激活为纤溶酶，而具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶则能降解构成血栓骨架的纤维蛋白，从而引起溶栓的作用；另一类是纤溶酶类物质，其作用不通过激活纤溶酶原，而是直接降解血块中的纤维蛋白，溶解血栓，这类物质有来源于枯草芽孢杆菌的纳豆激酶(nattokinase，NK)以及分别来源于芽孢杆菌、粪链球菌、链酶菌等的纤溶活性物质。除早期发现的产链激酶的β_溶血链球菌(Streptococcus hemolytius)和产葡激酶的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)外,近年来,又陆续筛选出可产生纤溶酶活性的芽孢杆菌、放线菌、黄青霉菌、尖镰胞菌、镰胞菌、旋孢霉菌、海洋假单胞菌、藤黄微球菌等。但这些菌株中有的产酶量较低、有的自身存在致病性、有的菌株产生的降纤酶在临床应用后存在较大的副作用，这些因素在一定程度上制约了微生物纤溶酶的开发和应用，因而筛选出无致病性、易培养、产酶量高的菌株，并且摸索出成熟的工艺条件就显得尤为重要。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种提取物制备降纤酶的粪肠球菌。粪肠球菌先用富集培养基在自然环境中富集，然后在琼脂糖-纤维蛋白培养基平板上初筛，挑选活性较高的菌落再经过摇瓶复筛，取上清液用纤维蛋白平板测定纤溶活性。经富集培养、分离筛选，获得粪肠球菌，粪肠球菌已于2012年7月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址北京市朝阳区北辰路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC Nol. 6313。培养基制备I LB培养基蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，琼脂1.5%。 2富集培养基猪血粉2%，蛋白胨1%，NaCl 5%，琼脂2%，pH 7.2。3纤维蛋白培养基称取纤维蛋白原16. Omg溶解于8mL双蒸水中，配制成纤维蛋白原溶液，于37°C中水浴保温；称取O. 16g琼脂粉加双蒸水定容至8mL并煮化，待冷却至50°C左右加入O. ImL 100IU/mL的凝血酶，摇匀后加入上面配置好的纤维蛋白原溶液，迅速摇匀后倒入直径为9cm的平皿中，室温平放30min，待平板凝固后置于4°C下冷藏备用。菌种的分离先用富集培养基在自然环境中富集，然后在琼脂糖-纤维蛋白培养基平板上初筛，挑选活性较高的菌落再经过摇瓶复筛，取上清液用纤维蛋白平板测定纤溶活性。形态学特征经富集培养、分离筛选，获得一株纤溶酶产生菌——粪肠球菌(菌株EF608)，在LB固体培养基上呈圆形透明菌落，白色，表面光滑，有光泽，边缘整齐。菌体成对或短链状排列，无运动型，不生成芽孢，革兰氏染色阳性。菌株鉴定I形态观察粪肠球菌(菌株EF608)在LB固体培养基上呈圆形菌落，白色，表面光滑，有光泽，边缘整齐(图I)。菌体成对或短链状排列，无运动性，不生成芽孢，革兰氏染色阳性(图2)。2生理生化特征菌株EF608能在高温、高pH、高盐的极端条件下生长，具有水解胆汁七叶苷的能力，详细结果见表I。根据《伯杰细菌鉴定手册》可初步判断该菌为粪肠球菌。表I菌株EF608的生理生化特征Table I Physiological and biochemical characters of strain EF608
权利要求
1. 一种类肠球菌(Enterococcus faecalis)菌株 EF608 CGMCC NO. 6313。
全文摘要
本发明为一种粪肠球菌(Enterococcus faecalis)菌株EF608 CGMCC NO.6313。本发明从自然界中富集培养、分离筛选得到粪肠球(Enterococcus faecalis)菌株EF608，从粪肠球菌菌株发酵液中分离纯化能得出一种分子量为37.1KD的纤溶酶，易于纯化和批量制备，并且纤溶活性强，无毒性，是较为理想的纤溶酶制剂原料。
文档编号C12N1/20GK102899267SQ20121028725
公开日2013年1月30日 申请日期2012年8月13日 优先权日2012年8月13日
发明者和七一, 余晓东, 文浩平 申请人:重庆师范大学