专利名称：一种粪肠球菌anse228及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种粪肠球菌及其应用。
技术背景
随着社会和科学的发展，食品安全性日益受到人们的关注，因为不安全食品不仅 危害人体健康和生命，甚至还可能对子孙后代产生不利影响。社会呼吁绿色、安全的食品， 而饲料的安全就是食品的安全。
抗生素作为饲料添加剂，对于促进动物生长发育、提高疾病抵抗力等方面具有重 要作用。但其长时间的大量使用导致了一些负面效应的产生，譬如破坏了动物自身的微生 态平衡，增加了畜禽消化道疾病发生的几率，并能使病原菌突变为耐药菌株等。更为重要的 是，抗生素在动物体内的残留，通过食物链传给人类，给人们健康带来隐患。鉴于此，很多国 家都在饲料中禁用和限用抗生素作为饲料添加剂。因此，抗生素替代产品的开发也成了世 界各国研究的重点。其中微生态制剂由于其独特的优势，如广谱的非特异性抑菌和杀菌作 用、绿色环保、无残留等，在使用抗生素替代领域正得到越来越多的重视。
本研究以粪肠球菌(Enterococcus faecium)作为研究对象，整合了现有的对益生 粪肠球菌的理论和实践认识，筛选出具有抗菌活性、抗逆性以及安全性的益生粪肠球菌，优 化该菌的发酵工艺并，研究其作为微生态制剂对动物生产性能的影响，为益生粪肠球菌的 应用和实践奠定基础。发明内容
本发明的目的在于提供一种粪肠球菌。
本发明的另一目的在于提供上述粪肠球菌的应用。
本发明的目的还在于提供一种微生态制剂。
本发明的再一目的在于提供上述微生态制剂的应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供一种粪肠球菌(Enterococcusfaecium) ANSE228，其保藏编号为CGMCC No. 4082，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2010年8月16日。 所述粪肠球菌ANSE2^是通过反复分离、纯化、复壮等工艺得到，具有生物活性强、益生性 显著并且抗逆性能好等优点。
本发明中所述粪肠球菌ANSE228的培养方法如下取粪肠球菌ANSE2^种子液 l-5ml (种子液是挑取的单个菌落在种子液培养基中培养的，其活菌浓度以109CFU/ml计； 种子液的培养基和培养条件与发酵的培养基和培养条件相同)，接种到50-100ml培养基中 进行摇瓶发酵培养。所述培养基由如下组分组成玉米粉10_25g/L、豆粕10_30g/L、葡萄糖 0-15g/L、磷酸氢二钾0. 1-0. 2g、磷酸二氢钾1. 0-2. 0g、一水硫酸锰0. 5-2. 0g、七水硫酸镁 0. 5-2. 0g、蒸馏水 800-1200mL，pH 值为 6. 5-7. 5。
其中，优选为玉米粉15g，豆粕20g，葡萄糖5g、磷酸氢二钾0. 15g、磷酸二氢钾1. 5g、一水硫酸锰1. 0g、七水硫酸镁1. 5g、蒸馏水lOOOmL，pH值为7. 0。
本发明中所述摇瓶发酵的条件为发酵温度25_45°C，发酵时间18_36h，pH值 6. 5-7. 5，静置培养；优选为发酵温度37°C、发酵时间Mh、pH值7. 0。
IOL发酵罐中试培养基与摇瓶发酵培养基相同。IOL发酵罐中试发酵条件为装液 量为4-7L培养基，接种量为30-100ml摇瓶种子液，发酵温度为25_45°C，发酵时间18_36h， pH值6. 5-7. 5，搅拌转速200-400r/min。其中，优选为装液量为5L培养基，接种量为50ml 摇瓶种子液发酵温度为37°C，发酵时间Mh，pH值7. 0，搅拌转速300r/min。
本发明还提供粪肠球菌ANSE2^在抑制鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌和/或金黄色 葡萄球菌中的应用。所述菌株具有显著的益生性，可显著抑制鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌以 及金黄色葡萄球菌等致病菌的生长繁殖。
本发明还提供所述粪肠球菌ANSE2^在模拟胃液和/或模拟胆盐和/或75_90°C 的高温环境中的应用。所述菌株具有较强的抗逆性，可以耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高温 环境，并且能保持80%以上较高的活菌存活率。
本发明粪肠球菌ANSE228的益生性的检验方法如下
在无菌操作台上，制备厚度为4mm左右的MRS平板，将致病菌(大肠杆菌、金黄色 葡萄球菌及沙门氏菌)浓度为IO6的菌悬液100-200 μ L涂布于该平板上，将灭菌的不锈 钢小管(内径6mm、外径8mm、高IOmm的圆形小管，管的两端要光滑)放置在培养基上，轻 轻加压，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的粪肠球菌 ANSE2^活化菌种菌液，勿使其外溢，35°C _40°C培养18-3 !，然后测量抑菌圈直径。每个实 验三个重复，取平均值。
其中，所述MRS平板是将121°C高温灭菌后的MRS培养基，倒入灭菌后的平板， 冷却后形成表面光滑的4mm厚的MRS平板。所述MRS培养基的配方为蛋白胨10g、牛肉 膏10g、酵母浸膏5g、K2HP042g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、Tween-801mL、 MgSO4 · 7Η200· 58g、MnSO4 · 4H20 0. 25g、琼月旨 16g、蒸馏水 1000ml, pH = 7. 0。
本发明粪肠球菌抗逆性的检验方法如下
1、高温耐受试验取5mL粪肠球菌ANSE2^活菌菌液注入到离心管1中，用无菌生 理盐水十倍逐级稀释，选择合适稀释度的稀释液，在MRS平板1上涂布。另取5mL粪肠球菌 ANSE228活菌菌液注入到离心管2中，置于75_90°C水浴锅中加热10-20min，取加热后的粪 肠球菌ANSE2^活菌菌液用无菌生理盐水进行十倍逐级稀释，选择与前述相同稀释度的稀 释液，在MRS平板2上涂布。将平板1和平板2在30-45°C条件下培养18_3他，计算粪肠球 菌加热前后的数量。
2、模拟胃液的耐受试验将胃蛋白酶溶解在0. 5% -0. 85%生理盐水中，使其终浓 度为3g/L，并用浓盐酸或者10 %的NaOH调整pH值到2. 0-4. 0。取0. 5mL粪肠球菌ANSE2^ 菌悬液加入到4. 5mL的模拟胃液中(即十倍逐级稀释)，并迅速在振荡器上充分混和，然后 置于30-45°C静置培养2-4h。分别在》i、4h的时候取出培养液并立即计数残存活菌数，与 原活菌数进行比较。
3、模拟胆盐的耐受试验
用胰液素制成lg/L-1. 5g/L的溶液，并在溶液中加入0. 3%的猪胆盐，用10%的 NaOH调整pH为7. 0-9. 0，然后用0. 45 μ m微滤膜过滤并除菌。将0. 5ml粪肠球菌ANSE228活菌菌液接种到4. 5ml模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计数残存粪肠球菌ANSE2^的 活菌数。将菌液在灭菌生理盐水中十倍逐级稀释，并进行MRS平板涂布，然后置于30-45°C 静置培养18-36h(粪肠球菌一般要培养18h以上才能长成明显单菌落)。
模拟胃液和模拟胆盐耐受试验中的计数方法
样品用无菌生理盐水十倍梯度稀释，选择合适的稀释度用于计数。采用MRS琼脂 培养基，取0. 5mL稀释液涂布在平板上，在37 °C培养Mh。
本发明还提供一种微生态制剂，其含有上述粪肠球菌ANSE228。所述微生态制剂是 将通过反复分离、纯化、复壮等工艺得到的生物活性强、益生性显著并且抗逆性能良好的粪 肠球菌ANSE228，经过液体深层发酵等生产工艺得到发酵液，然后经干燥后制得。
本发明还提供上述微生态制剂在养殖中的应用，其是将微生态制剂作为添加剂， 添加到养殖动物的饮水或饲料中。其中，所述粪肠球菌ANSE2^在饮水中的添加量为 IO8-IOiiCFU/!饮水；所述粪肠球菌ANSE2^在饲料中的添加量为107-101(lCFU/kg饲料。本 发明中所述养殖动物包括肉鸡、蛋鸡和猪，还包括鱼、鸭或反刍动物，如牛或羊。
本发明的粪肠球菌ANSE2^在其用量较少，例如在饲料中仅为107CFU/kg时即可 显著提高动物的生产性能，使肉鸡料肉比降低33. 14%、仔猪死淘率降低至0%、蛋鸡料蛋 比降低19.8%，显著提高了动物的生产性能，降低了生产成本。
本发明的有益效果在于
1.本发明的粪肠球菌ANSE2^具有显著的益生性，能显著抑制鸡白痢沙门氏菌、 大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌等致病菌的生长繁殖。
2.本发明的粪肠球菌ANSE2^具有较强的抗逆性，能够耐受模拟胃酸、模拟胆盐 以及高温环境，并且能保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达到80%以上。由于饲料加 工制粒的过程中温度较高，达到75-90°C，因此菌株需要耐受住这个温度范围才能保证动物 吃到的是活菌，而活菌才具有益生性。耐受胃酸和胆盐是为了使粪肠球菌在动物消化道内 可以发挥其作用。
3.本发明发掘了已知的粪肠球菌新的用途，开拓了一个新的应用领域。
4.本发明中粪肠球菌ANSE2^制成的微生态制剂进入动物肠道后，功能强大的粪 肠球菌ANSE2^迅速活化、增殖，同时在肠道微生态环境中形成有益优势菌群。
5.本发明的粪肠球菌ANSE228，具有显著的益生性以及抗逆性，不但可以提高动 物的饲料利用效率，节约成本，而且改善了动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收 利用，促进动物生长，提高经济效益等功效，预示着良好的应用前景。
图1为粪肠球菌ANSE2^对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈。
图2为粪肠球菌ANSE2^对大肠杆菌的抑菌圈。
图3为粪肠球菌ANSE2^对金黄色沙门氏菌的抑菌圈。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1粪肠球菌ANSE2^发酵液的制备
取粪肠球菌ANSE228 (保藏编号为CGMCC No. 4082，活菌浓度为109CFU/ml)，接种于 50ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37°C、pH值7. 0、静置培养，发酵时间Mh。
其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成玉米粉15g、豆粕20g、葡萄糖5g、磷酸氢 二钾0. 15g、磷酸二氢钾1. 5g、一水硫酸锰1. 0g、七水硫酸镁1. 5g、蒸馏水lOOOmL，pH值为 7. 0。
摇瓶发酵结束后进行发酵罐中试试验，取50ml摇瓶发酵种子液接种到IOL发酵罐 中，装液量为5L、发酵温度为37°C、pH值7. 0，搅拌转速300r/min，发酵时间36h。发酵罐中 试培养基组成同摇瓶发酵。
发酵结束后，将发酵液保存在4°C冰箱内备用。
实施例2粪肠球菌ANSE2^益生性验证
制备厚度为4mm左右的MRS平板，将致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏 菌)浓度为IO6的菌悬液100 μ L涂布于该平板上，以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(内径 6mm、外径8mm、高IOmm的圆形小管，管的两端要光滑)，放置在培养基上，轻轻加压，使其与 培养基接触无空隙，待数分钟后，分别向各小管中滴加200-300微升的实施例1制备得到的 发酵液(活化菌种菌液)，勿使其外溢，37°C温度下培养Mh，然后测量抑菌圈直径。每个实 验三个重复，取平均值。结果如图1-3所示。
其中，所述MRS平板是将121°C高温灭菌后的MRS培养基，倒入灭菌后的平板，冷却 后形成表面光滑的4mm厚的MRS平板。所述MRS培养基的配方为蛋白胨10g、牛肉膏10g、 酵母浸膏5g、K2HP042g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、Tween-801mL、MgSO4 · 7H20 0. 58g、MnSO4 · 4H20 0. 25g、琼脂 16g、蒸馏水 1000ml, pH = 7. 0。
粪肠球菌ANSE2^对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈直径为1. 20cm，对大肠杆菌以及金 黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为1. 16cm和1. 12cm。
实施例3粪肠球菌ANSE2^抗逆性验证
1、取保存好的5mL实施例1制备得到的发酵液注入到离心管1中，采用十倍逐级 稀释，在MRS平板1上涂布。再将装有5mL实施例1制备得到的发酵液的离心管2置于80°C 水浴锅中加热15min，取加热后的粪肠球菌菌液进行十倍逐级稀释，在MRS平板2上涂布。 最后将加热前和加热后的平板均在37°C条件下培养Mh，计算粪肠球菌ANSE2^加热前后 的数量。
结果表明，活菌存活率达到了 85%。
2、模拟胃液的耐受试验将胃蛋白酶溶解在0. 5%生理盐水中，使其终浓度为3g/ L,并用浓盐酸或者10%的NaOH调整pH值到2. 0。取0. 5mL粪肠球菌ANSE2^菌悬液加入 到4. 5mL的模拟胃液中(即十倍稀释)，并迅速在振荡器上充分混和，然后置于37°C静置培 养池。在处理池后取出培养液并立即计数残存活菌数，与原活菌数进行比较。结果表明， 活菌存活率为96%。
3、模拟胆盐的耐受试验用胰液素制成lg/L的溶液，并在溶液中加入0. 3%的猪 胆盐，用10%的NaOH调整pH为8. 0，然后用0. 45 μ m微滤膜过滤并除菌。将0. 5ml粪肠球 菌ANSE2^活菌菌液接种到4. 5ml模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计数残存粪肠球菌 ANSE228的活菌数。将菌液在灭菌生理盐水中十倍逐级稀释，并进行MRS平板涂布，然后置 于37 °C静置培养Mh。结果表明，活菌存活率为96%。
实施例4肉鸡生长性能试验
选用120只30日龄健康肉鸡，称重，随机分成4个处理组，每个处理设5个重复， 每个重复6只鸡，公母各占1/2。试验饮水分别为(1)普通饮水(对照组)；( 饮水中粪 肠球菌ANSE2^活菌浓度为101QCFU/L ； (3)饮水中粪肠球菌ANSE2^活菌浓度为IO9CFU/ L ； (4)饮水中粪肠球菌ANSE2^活菌浓度为108CFU/L。试验鸡自由采食和饮水，饲养管理 和免疫程序参照肉鸡饲养管理手册。
表1粪肠球菌ANSE2^对肉鸡生长性能的影响
处理生长性能对照组粪肠球菌粪肠球菌粪肠球菌SEMP值(1010CFU/1)(109CFU/1)(108CFU/1)平均日釆食量(g)173.35a154.86b161.56^168.72仙0.330.0441平均日增重(g)55.07bc59.49^53.76c60·36α8.530.0123料肉比3.16a2.62°3.02^2.78bc0.080.0006
注同行数据肩标不含相同字母者表示差异显著(P < 0. 05)(下同)
本试验结果显示，粪肠球菌ANSE2^显著提高了肉鸡平均日增重(P = 0. 0123)和 饲料转化效率(P = 0. 0006)。同时，饮水中粪肠球菌ANSE2^活菌浓度为101(ICFU/L时，肉 鸡饲料转化率最高。
实施例5蛋鸡生产性能试验
试验为单因子设计，576只罗曼褐商品代蛋鸡随即分为3个处理，每个处理6个重 复，每个重复8个笼，每笼4只鸡。处理1为负对照，饲喂基础日粮，不含任何药物饲料添加 剂；处理2为正对照，在基础日粮基础上添加杆菌肽锌20mg/kg褐硫酸抗敌素％ig/kg ；处理 3在基础日粮基础上添加3 X 109CFU/kg的粪肠球菌ANSE2^微生态制剂。试验鸡自由采食 和饮水，饲养管理和免疫程序参照蛋鸡饲养管理手册。
表2粪肠球菌ANSE2^对蛋鸡生产性能的影响
权利要求
1.一种粪肠球菌(Enterococcus faecium)ANSE228，其保藏编号为 CGMCC No. 4082。
2.一种培养权利要求1所述粪肠球菌ANSE228的方法，其特征在于，取粪肠球菌 ANSE228种子液l_5ml，接种到50_100ml培养基中进行摇瓶发酵培养。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述培养基由如下组分组成玉米粉 10-25g/L、豆粕 10-30g/L、葡萄糖 0-15g/L、磷酸氢二钾 0. 1-0. 2g、磷酸二氢钾 1. 0-2. Og、一 水硫酸锰0. 5-2. Og、七水硫酸镁0. 5-2. Og、蒸馏水800-1200mL，pH值为6. 5-7. 5。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述摇瓶发酵的条件为发酵温度 25-45°C、发酵时间18-36h、pH值6. 5-7. 5、静置培养。
5.权利要求1所述的粪肠球菌ANSE2^在抑制鸡白痢沙门氏菌和/或大肠杆菌和/或 金黄色葡萄球菌中的应用。
6.权利要求1所述的粪肠球菌ANSE2^在模拟胃液和/或模拟胆盐和/或75-90°C的 高温环境中的应用。
7.—种微生态制剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的粪肠球菌ANSE228。
8.权利要求7所述的微生态制剂在养殖中的应用，其特征在于，将微生态制剂作为添 加剂，添加到养殖动物的饮水或饲料中。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述粪肠球菌ANSE2^在饮水中的添加量 为108-10"CFU/L饮水；所述粪肠球菌ANSE2^在饲料中的添加量为107-101(lCFU/kg饲料。
10.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述养殖动物包括肉鸡、蛋鸡和猪， 还包括鱼、鸭、牛或羊。
全文摘要
本发明提供了一种粪肠球菌ANSE228，其保藏编号为CGMCC No.4082。本发明还提供上述粪肠球菌ANSE228在抑制鸡白痢沙门氏菌和/或大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌中的应用。所述粪肠球菌ANSE228是通过反复分离、纯化、复壮等工艺得到，具有生物活性强、益生性显著并且抗逆性能好等优点。本发明还提供一种微生态制剂，其含有上述粪肠球菌ANSE228，将该微生态制剂添加到养殖动物饮水和/或饲料中，在进入动物肠道后粪肠球菌ANSE228能迅速活化、繁殖并且能够形成优势的有益菌群，具有减少肠道中的有害菌群、调节肠道微生态平衡、替代抗生素等药物、提高动物增重以及饲料利用率等功效。
文档编号C12N1/20GK102031235SQ201010539988
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者李笑樱, 范彧, 计成, 马秋刚, 高欣 申请人:中国农业大学