生物工程化的组织构建物、其制备方法及其应用的制作方法

专利名称：生物工程化的组织构建物、其制备方法及其应用的制作方法
生物工程化的组织构建物、其制备方法及其应用本申请是中国申请99815621. 3的分案申请，该母案的申请日为1999年11月19 日，本分案采用了与该母案一致的发明名称。发明领域本发明属于组织工程领域。本发明涉及诱导细胞体外产生细胞外基质的方法。这 种有生命的细胞外基质具有类似于组织的特征，可用于检验或临床目的。
背景技术：
组织工程领域将生物工程方法与生命科学的基本原理结合起来，以便了解正常及 病理状态下的哺乳动物组织中结构与功能之间的关系。组织工程的目标是开发并最终应用 生物代用品保存、维持或改进组织的功能。因此，通过组织工程有可能在实验室里设计并制 造生物工程化的组织。生物工程化的组织可包括通常与天然哺乳动物或人类组织相关的细 胞，以及合成的或外源的基质支架。新的生物工程化组织应当是移植至宿主后具有功能，而 且可在该宿主体内持久掺入或由受体宿主患者的细胞不断进行生物再改造。不含支持组件 或支架的组织等价体的制备为新型生物工程化组织的产生带来了科学挑战。发明简述本发明涉及生物工程化的组织构建物，其含有培养的细胞和无需外源性基质成分 或网状系统支持物或支架组件便可内源产生的细胞外基质成分。因此，当本发明的生物工 程化组织构建物是设计用于人类时，它可从人的细胞，以及由这些细胞产生的人的基质成 分而完整产生。本发明还涉及产生组织构建物的方法，其为刺激培养中的细胞，如成纤维细胞，从 而在不添加任何外源性基质成分、网状系统支持物、或支架组件的情况下可产生细胞外基 质成分。本发明还涉及另一种产生组织构建物的方法，其为刺激培养中的细胞，如成纤维 细胞，以便在组成已知的培养基系统中和/或在没有使用不明确或非人类衍生的生物成 分，如牛血清或有机提取物的情况下产生细胞外基质成分。该组织构建物的产生可以是，通过不同类型细胞的系列培养，导致产生与天然组 织具有类似细胞组成和组织构建物的培养的组织构建物。培养的细胞无需加入支架支持物或外源性细胞外基质成分，就可以产生所述组织 构建物。该组织构建物的强度特征使其便于操作，可以从产生它的培养仪器中轻易剥离， 并在临床或检验中直接转移而无需任何支持物或载体。本发明的组织构建物具有临床应用价值，如可移植给具有组织或器官缺陷的患 者，如皮肤溃疡或伤口，或进行体外组织检验或移植入动物进行安全性检验或药物、化妆 品、及化学产品的效力鉴定。更具体地，本发明涉及1. 一种含成纤维细胞的培养的组织构建物，所述成纤维细胞在产生细胞外基质层的条件下生长，所述细胞外基质由培养的成纤维细胞合成并装配，培养的成纤维细胞包含 在所述合成的细胞外基质层内，其中所述细胞外基质包括(i)纤丝胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；(ii)decorin ；和(iii)糖胺聚糖；且其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分 或合成的成分时产生。2.项1的培养的组织构建物，其中成纤维细胞来自选自下组的组织新生男婴包 皮，真皮，腱，肺，尿道，脐带，角膜基质，口腔粘膜，和肠。3.项1的培养的组织构建物，其中所述培养的细胞为真皮成纤维细胞。4.项1的培养的组织构建物，其中所述培养的细胞来自毛囊的真皮乳头。5.项1的培养的组织构建物，其中所述层具有来自毛囊的真皮乳头的培养细胞， 它们定位于该层。6.项1的培养的组织构建物，其中所述培养细胞在化学确定的培养基中培养。7.项1的培养的组织构建物，其中所述培养的细胞来自人的组织并在不含非人成 分的培养基中培养。8. 一种含培养的真皮成纤维细胞的培养的组织构建物，所述成纤维细胞在产生细 胞外基质层的条件下生长，所述细胞外基质由培养的成纤维细胞合成并装配，所述培养的 成纤维细胞包含在所述合成的细胞外基质层内，其中所述细胞外基质包括(i)纤丝状I型和II型胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的 67nm带状；(ii)decorin,(iii)纤连蛋白，(iv)腱生蛋白；和(ν)糖胺聚糖；且其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分 或合成的成分时产生。9. 一种培养的组织构建物，其至少有2层，其包括(a)第一层培养的成纤维细胞，其在产生细胞外基质层的条件下生长，所述细胞外 基质由培养的成纤维细胞合成并装配，所述培养的成纤维细胞包含在所述合成的细胞外基 质层内，其中所述细胞外基质包括(i)纤丝胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；(ii)decorin ；禾口(iii)糖胺聚糖；其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分或 合成的成分时产生；和(b)第二层细胞，其含有处于所述第一层上的上皮细胞。10.项9的培养的双层组织构建物，其中所述上皮细胞选自角质细胞、角膜上皮细 胞、口腔粘膜的上皮细胞、食道上皮细胞、和尿道上皮细胞。
11.项9的培养的双层组织构建物，其中所述包含在该第一层中的成纤维细胞衍 生自选自下组的组织新生男婴包皮，真皮，腱，肺，软骨，尿道，角膜基质，口腔粘膜，和肠。12.项9的培养的双层组织构建物，其中所述包含在该第一层中的成纤维细胞为 皮成纤维细胞。13.项12的培养的双层组织构建物，其中所述包含在该第一层中的成纤维细胞来 自毛囊的真皮乳头。14.项9的培养的双层组织构建物，其中所述第一层具有来自毛囊真皮乳头的培 养的细胞，它们定位于该第一层上。15.项9的培养的双层组织构建物，还包括位于所述第二层上皮细胞上的第三层 细胞。16. 一种培养的皮肤构建物，其至少有2层，其包含(a)第一层培养的真皮成纤维细胞，其在产生细胞外基质层的条件下生长，所述细 胞外基质由所述培养的成纤维细胞合成并装配，所述培养的成纤维细胞包含在所述合成的 细胞外基质层内，其中所述细胞外基质包括(i)I型和II型胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；(ii)decorin,(iii)纤连蛋白，(iv)腱生蛋白；和(ν)糖胺聚糖；且其中所述细胞外基质由所述培养的真皮成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源 基质成分或合成的成分时产生；和(b)第二层角质细胞，其位于第一层上，形成一个表皮细胞层，其中所述表皮细胞 层为多层、分层的已分化层，并表现为基底层、基底上层、立方上皮层和角质层；且其中所述培养的双层皮肤构建物在该第一和第二层之间的连接处有一基底膜。17.项1，8，9，和16中任一项的构建物，其中所述培养的成纤维细胞受到遗传修饰 以产生细胞外基质成分。18.项17的构建物，其中所述培养的成纤维细胞受到遗传修饰以产生生长因子、 激素、肽、或蛋白质。19. 一种产生培养的组织构建物的方法，其包括(a)在培养容器中的多孔膜上，于第一细胞培养基中接种能合成细胞外基质的成 纤维细胞；(b)于所述第一细胞培养基中培养步骤(a)的成纤维细胞，使所述多孔膜上的细 胞融合达到约80% -约100% ；(c)在培养条件下刺激所述成纤维细胞在第二培养基中合成、分泌并排列细胞外 基质成分；和(d)继续培养这些成纤维细胞，直至这些细胞合成至少约30 μ M厚的细胞外基 质层，所述培养的成纤维细胞包含在该合成的细胞外基质层中，其中所述细胞外基质层包 括(i)纤丝胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；
(ii)decorin ；和(iii)糖胺聚糖；且其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分 或合成的成分时产生。20.项19的方法，其中所述第一培养基，或所述第二培养基为化学确定的培养基， 或这两种培养基均为化学确定的培养基。21.项19的方法，其中所述第一和第二培养基不含非人的成分。22.项19的方法，其中步骤(a)的成纤维细胞以约1 X IO5个细胞/cm2-约6. 6X IO5 个细胞/cm2的密度接种。23.项19的方法，其中所述成纤维细胞衍生自选自下组的组织新生男婴包皮，脐 带，真皮，腱，肺，尿道，角膜基质，口腔粘膜，和肠。24. 一种产生培养的双层组织构建物的方法，其包括(a)在培养容器中的多孔膜上，于第一细胞培养基中接种能合成细胞外基质的成 纤维细胞；(b)于所述第一细胞培养基中培养步骤(a)的成纤维细胞，使所述多孔膜上的细 胞融合达到约80% -约100% ；(c)在培养条件下刺激所述成纤维细胞在第二培养基中合成、分泌并排列细胞外 基质成分；和(d)继续培养这些成纤维细胞，直至这些细胞合成约30 μ M-约110 μ M厚的细胞外 基质层，所述培养的成纤维细胞包含在该合成的细胞外基质层中，其中所述细胞外基质层 包括(i)纤丝胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；(ii)decorin ；禾口(iii)糖胺聚糖；且其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分 或合成的成分时产生；(e)在步骤(d)的合成的细胞外基质之上表面接种上皮细胞，和(f)在培养条件下刺激步骤(e)的上皮细胞，使之形成细胞外基质的双层组织构 建物，其中所述培养的成纤维细胞包含在该合成的细胞外基质中，和第二层上皮细胞层。25.项M的方法，其中所述能合成细胞外基质的成纤维细胞衍生自选自下组的组 织新生男婴包皮，真皮，腱，肺，软骨，尿道，角膜基质，口腔粘膜，和肠。26.项M的方法，其中所述上皮细胞选自角质细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜的上 皮细胞、食道上皮细胞、和尿道上皮细胞。27. 一种产生培养的双层皮肤构建物的方法，所述构建物包含一个真皮层和一个 表皮层，该表皮层在缺乏结构支持物或外源基质成分的情况下处在该真皮层上，其中该方 法包括以下步骤(a)将成纤维细胞接种在培养容器中多孔膜上的化学确定的第一细胞培养基中， 接种密度为约IX IO5个细胞/cm2-约6. 6 X IO5个细胞/cm2 ；(b)于所述化学确定的第一培养基中培养步骤(a)的成纤维细胞至约80% -约100%的融合；(c)通过在化学确定的第二培养基中培养步骤(a)的成纤维细胞，刺激它们合成、 分泌并排列细胞外基质成分；(d)继续培养所述成纤维细胞，直至这些细胞合成至少约30 μ M厚的细胞外基质 层，所述培养的成纤维细胞包含在该合成的细胞外基质层中，其中所述细胞外基质包括(i)I型和II型胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；(ii)decorin,(iii)腱生蛋白；和(iν)糖胺聚糖；且其中所述细胞外基质由培养的真皮成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质 成分或合成的成分时产生；(e)于步骤(d)的合成的细胞外基质之上表面接种角质细胞，和(f)在培养条件下培养这些角质细胞以形成表皮层，其中所述表皮细胞层为多层、分层的、已分化的角质细胞层，它表现为基底层、基 底上层、立方上皮层和角质层；且其中所述培养的双层皮肤构建物在该第一和第二层之间的连接处有一基底膜。28. 一种将培养的组织构建物移植或植入患者的方法，其包括将项1，8，9，或16中 任一项的培养的组织构建物移植或植入需要相应治疗的患者。29. 一种产生培养的组织构建物的方法，其包括(a)在培养容器中的多孔膜上，于细胞培养基中接种能合成细胞外基质的成纤维 细胞至约80% -约100%融合；(b)在培养条件下刺激所述成纤维细胞在第二培养基中合成、分泌并排列细胞外 基质成分；和(C)继续培养所述成纤维细胞，直至这些细胞合成至少约30 μ M厚的细胞外基质 层，所述培养的成纤维细胞包含在该合成的细胞外基质层中，其中所述细胞外基质包括(i)纤丝胶原，其显示纤丝和纤丝束的紧密排列，为垂直交错的67nm带状；(ii)腱生蛋白；和(iii)糖胺聚糖；其中所述细胞外基质由培养的成纤维细胞于培养条件下在缺乏外源基质成分或 合成的成分时产生。30.项1-18中任一项的构建物，其中所述构建物能维持物理整体性以及类似于组 织的手感特征。附图简述

图1图示羟脯氨酸试验中测定的相对于人类新生包皮细胞衍生的真皮构建物之 细胞数的胶原浓度，如实施例1所述。图2为显微照片(接物镜20X)，显示在化学确定型培养基中培养21天的人真皮 成纤维细胞所形成的细胞-基质构建物经固定、石蜡包埋、苏木精和伊红染色后的切片。多 孔膜呈现为所述构建物以下的薄层透明带。图3为透射电镜图，显示在化学确定型培养基中培养21天的人真皮成纤维细胞所形成的细胞-基质构建物在两种分辨率下的图像。图3A为7600X分辨率，显示内源基质， 包括成纤维细胞之间的胶原纤丝的排列。图:3B为19000X分辨率，显示完整形成的内源胶 纤丝，其证实纤丝的排列和包裹。图4为显微照片(接物镜20 X)，显示在化学确定型培养基中，在缺乏外源基质成 分的情况下，形成的皮肤构建物经固定、石蜡包埋、苏木精和伊红染色后的切片，其中包含 人真皮成纤维细胞在化学确定型培养基上所形成的细胞-基质构建物，以及由人的角质细 胞在化学确定型培养基上形成的多层、已分化的表皮。发明详述现有人工活组织构建物并非完全由细胞组成，需另行加入或掺入外源基质成分或 人工合成的结构和/或支持物。本文所述经生物工程技术产生的组织构建物显示其来源组织的很多天然特征。如 此产生的组织构建物可用于向患者移植或体外检测。一个优选实施方案是一种细胞-基质构建物，其含有第一种细胞及内源产生的细 胞外基质，其中所述第一种细胞能合成并分泌细胞外基质，从而产生所述细胞-基质构建 物。另一优选实施方案是一种双层构建物，其包含第一种细胞，外源产生的细胞外基 质，以及由所述第一种细胞形成于其上层或其内部的一层第二种细胞。一个更优选实施方案是一种细胞-基质构建物，其含有成纤维细胞(如衍生于真 皮的那些)以形成人工培养型真皮构建物。另一更优选实施方案是一种细胞-基质构建物，其含有成纤维细胞(如衍生于真 皮的那些)以形成人工培养型真皮构建物，其上层为一层培养的角化蛋白，用于形成表皮， 从而最终形成人工培养型双层皮肤构建物。本发明的人工培养型皮肤构建物可表达天然皮 肤的多种物理、形态、及生化特征。在一个还要更优选的实施方案中，所述细胞-基质构建物是一种组织构建物，它 是类似于皮肤真皮层的人类真皮构建物，是在含有人源细胞、但未使用任何化学非确定成 分的、成分确定的系统中经培养而形成的。在一个最优选实施方案中，本发明的组织构建物形成于一种化学确定型系统，该 系统包含人源细胞，但不含化学非确定的或非人类生物学的成分或细胞。本发明一个优选实施方案包括由至少一种产细胞外基质的细胞和内源产生的细 胞外基质成分(简称“基质”)所形成的结构层，其中所述基质完全由细胞经培养而合成 并装配。该层在本文称为“细胞-基质构建物”或“细胞-基质层”，因为这些细胞可分泌 基质并使它们自身包含在该基质中或穿过该基质。所述人工培养的组织构建物无需，因 此也不包括，外源基质成分，即并非由培养细胞而是通过其它方式引入的基质成分。在一 个更优选实施方案中，所述由人的真皮成纤维细胞产生的细胞-基质构建物具有类似于 天然皮肤的胶原优势浓度。电镜检查表明，该基质本性为纤维状，其含有表现为垂直交错 (quarter-staggered)的67nm带状形式的胶原，以及类似于天然胶原的纤丝构成和纤丝 束。经延迟还原型SDS-PAGE检测出这些构建物中同时存在I型和III型胶原，这是天然人 类皮肤中出现的占优势类型的胶原。用标准的免疫组化(IHC)技术，所述真皮细胞-基质 构建物中的deC0rin(已知其为与胶原纤丝相关的硫酸皮肤素蛋白多糖，并被认为可体内调节纤丝直径)为阳性染色。在用TEM检查所述构建物时也可见到decorin。所产生的组 织中腱生蛋白(在诸如间质或待修复的组织中发现的细胞外基质)也为阳性染色。与体内 待修复的组织极其相似的是，培养中产生的组织在形成基质时其I型和III型胶原的比例 增加。在不受任何理论限制的情况下，认为所述细胞很快与一种松散基质一起充斥于它们 之间(该松散基质类似于粒状组织(granulation tissue)，主要包含III型胶原和纤连蛋 白)，然后用主要含有I型胶原的较紧密基质重新改造上述松散基质。所产生的细胞-基质 含有糖胺聚糖(GAG)，如透明质酸(HA)；纤连蛋白；除decorin以外的多糖蛋白如双糖和多 功能蛋白聚糖；以及一组(a profile)硫酸糖胺聚糖如二-透明质酸；二 -软骨素_0_硫 酸；二 -软骨素-4-硫酸；二 -软骨素-6-硫酸；二 -软骨素-4，6-硫酸；二 -软骨素-4-硫 酸-UA-2S ；及二 -软骨素-6-硫酸-UA-2S。这些结构和生化特征在培养形成构建物时表现 出来，在构建物最终形成时变得明显，并各具特色。这些成分在已完全形成的培养型真皮细 胞-基质构建物中的存在，表明所述构建物具有接近于正常真皮的结构和生化特征。上述所列是由真皮成纤维细胞形成的培养细胞-基质构建物的生化及结构特征， 须知由其它类型成纤维细胞形成的培养型细胞-基质构建物可产生其来源组织类型的这 些特征和其它表型特征。在某些例子中，可通过化学暴露或接触、物理压力、或通过转基因 方式诱导成纤维细胞，使之表达非表型成分。本发明的另一优选实施方案是细胞-基质层， 其上层有第二层细胞。在所述细胞-基质上培养所述第二层细胞，以形成一种生物工程化 的双层组织构建物。在一个更优选实施方案中，所述第二层包含培养的人源角质细胞，其与 第一层细胞-基质(由真皮成纤维细胞形成的细胞-基质构建物)以及内源基质一起形成 一个包含活的皮肤构建物的真皮层。当彻底成形时，该表皮层为角质细胞的多层、分层的、 良好分化层，其表现为基底层、基底上层、立方上皮层(granular layer)和角质层。该皮肤 构建物在真皮-表皮连接处有发育良好的基底膜，如透射电镜(TEM)所示。该基底膜在半 桥粒周围是最厚的，由包含VII型胶原的锚着纤丝包围，如TEM所示。可观察到该锚着纤丝 始于基底膜，将胶原纤丝陷在真皮层中。这些锚着纤丝，以及其它基底膜成分均由角质细胞 分泌。已知白色角质细胞能在它们的表面分泌基底膜，可识别的基底膜在缺乏成纤维细胞 的情况下不能形成。对本发明皮肤构建物的免疫组化染色也显示存在层粘连蛋白，它是一 种基底膜蛋白。本发明关于形成一种细胞-基质构建物的优选实施方案中，将第一种能产生细 胞外基质的细胞接种于培养基质上，加以培养，并进行诱导以便合成和在它们周围分泌一 种有序排列的细胞外基质，从而形成细胞-基质构建物。本发明另一实施方案中，在该细 胞-基质构建物的一个表面上接种第二种细胞，进行培养以形成双层组织构建物。在一个 更优选方法中，通过在足以诱导基质合成以便形成真皮细胞和基质的细胞-基质构建物的 条件下，培养成纤维细胞，如人类真皮成纤维细胞，在真皮层上接种人类表皮细胞如角质细 胞并在足以形成完全分化的分层的表皮层的条件下培养，最终可形成具有类似于天然人类 皮肤的特征的完整厚度的皮肤构建物。因此，获得本发明组织构建物的一种方法包括(a)在缺乏外源基质成分或结构支持物的情况下，培养至少一种产细胞外基质的 细胞；和(b)刺激步骤(a)的细胞，使它们合成、分泌、和排列细胞外基质成分，从而形成一种组织构建物，该构建物包含上述细胞及其合成的基质；其中步骤(a)和(b)可以同时进 行，也可以依次进行。为了形成双层组织构建物(其包含细胞-基质构建物和位于其上的第二细胞层)， 所述方法还包括以下步骤(C)在所形成的组织构建物上培养第二种细胞，以产生双层组 织构建物。本发明所用的产细胞外基质的细胞可以是能产生并分泌细胞外基质成分，排列这 些细胞外基质成分以形成细胞-基质构建物的任何细胞类型。可对不止一种的产细胞外基 质细胞进行培养，以形成细胞-基质构建物。可对不同类型或组织来源的细胞进行混合培 养以产生类似于天然组织中的互补成分和结构。例如，所述产细胞外基质的细胞类型可能 有其它细胞类型参与其产生细胞外基质，这种产量并非上述第一种类型细胞的正常产量。 或者，也可将所述产细胞外基质的细胞类型与其它细胞类型混合，所述其它类型的细胞来 自所述组织中特化的组织结构，但基本不参与所述细胞-基质构建物中基质方面的整个形 成，如在本发明的某些皮肤构建物中那样。根据本发明，任何产细胞外基质的细胞类型均可使用，但优选使用衍生于间质的 细胞。更优选的细胞类型有成纤维细胞、基质细胞、和其它支持性结缔组织细胞，更优选发 现于人的真皮的人真皮成纤维细胞，以便产生人的真皮构建物。通常，成纤维细胞产生多种 细胞外基质蛋白，主要是胶原。由成纤维细胞产生的胶原有数种类型，但体内最常见的是 I型胶原。人成纤维细胞株有多种来源，包括但不限于新生男性包皮、真皮、腱、肺、脐带、软 骨、尿道、角膜基质、口腔粘膜、和肠。人的细胞可包括但不限于成纤维细胞，但可包括平滑 肌细胞、软骨细胞和间质来源的其它结缔组织细胞。优选(但非必需)用于产生组织构建 物的产基质细胞衍生自以下组织类型，即通过应用本发明的培养方法将被类似或模拟的组 织类型。例如，在产生皮肤构建物的实施方案中，优选的产基质细胞为成纤维细胞，优选为 真皮来源。在另一优选实施方案中，可使用由毛囊的真皮乳头经显微解剖分离的成纤维细 胞来产生所述基质或与其它成纤维细胞相连。在产生角膜构建物的实施方案中，所述产基 质细胞衍生自角膜基质。细胞供体可能在发育和年龄上有差异。细胞可衍生自胚胎、新生 儿、或较年长个体包括成人的供体组织。胚胎始祖细胞如间质干细胞可用于本发明，并可通 过诱导而分化发育为所需组织。虽然本发明优选使用人的细胞，但本发明方法所用的细胞不限于人源的。细胞可 来自其它哺乳动物物种，包括但不限于马、犬、猪、牛、和绵羊；或啮齿类动物如小鼠或大鼠。 此外，本发明的细胞均通过自发转染、化学转染、或病毒转染，或可使用重组细胞或遗传工 程化细胞。对于那些掺入了不止一种细胞类型的实施方案而言，可使用两种或多种来源的 正常细胞的嵌合混合物；正常细胞与遗传修饰的细胞或转染的细胞的混合物；或两个或多 个物种或组织来源的细胞的混合物。重组细胞或遗传工程化细胞可用于所述细胞-基质构建物的产生，从而产生一种 组织构建物，其可作为向患者运送药物的转移物发挥作用，其中所述患者需要增加天然细 胞产物水平或需要药物治疗。所述细胞可产生并通过该转移物向患者运送重组细胞产物、 生长因子、激素、肽或蛋白质，这种行为可以是连续的或发生在患者病情变化而发出了生物 学、化学、或热学信号以示需要时。根据所培养的组织构建物的使用说明，可能需要基因产 物的长期或短期表达。通过埋植培养型组织构建物而在较长时间段内向患者运送治疗性产物时，需要长期表达。相反，当转移培养型组织构建物旨在使该培养型组织构建物的细胞促 进患者伤口恢复正常或接近正常或减小伤处的损伤时，需要短期表达。一旦伤处治愈，不再 需要所述培养型组织构建物产生的基因产物或其在该部位的存在。也可对细胞进行遗传工 程修饰，使其表达以下蛋白质或不同类型的细胞外基质成分，所述蛋白质或成分既可以是 “正常”的但表达水平较高，也可以以某种方式被修饰而能产生包含细胞外基质及活细胞的 转移装置，该装置对于促进伤口复原、促进或指导新血管形成、或减少疤痕或瘢痕瘤形成具 有治疗作用。这些方法为领域内已知，见Sambrook等，分子克隆实验室手册，冷泉港出版 社，冷泉港，纽约(1989)，已引入作参考。上述所有类型的细胞均包括在本发明所用“产基 质细胞”的定义内。成纤维细胞产生的最主要细胞外基质成分是纤丝胶原，尤其I型胶原。纤丝胶原 是细胞-基质结构中的关键成分；但本发明并不限于仅包含这种蛋白或蛋白类型的基质。 例如，通过使用适当的细胞类型可以产生其它胶原，它们可以是胶原家族的纤丝胶原或非 纤丝胶原，如 II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、 XIX型胶原。类似地，可用现有方法产生并保存的其它基质蛋白包括，但不限于，弹性蛋白； 多糖蛋白如decorin或双糖；或糖蛋白如腱生蛋白；玻连蛋白；纤连蛋白；层粘连蛋白，血 小板反应蛋白I，及糖胺聚糖(GAG)如透明质酸(HA)。产基质细胞在适于动物细胞或组织培养的培养皿、烧瓶、或滚瓶(roller-bottle) 等允许形成三维组织样结构的容器内培养。可用于所述细胞生长的适当细胞生长表面可以 是能允许所述细胞粘附并为所述细胞-基质构建物的形成提供固定方式的任何生物学兼 容性材料。玻璃；不锈钢；聚合物，包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚偏乙烯、聚二甲基 硅氧烷、含氟聚合物、及氟化亚乙基丙烯；硅物质如熔凝硅石、聚硅、或硅晶等均可作为细胞 生长表面使用。细胞生长表面材料可接受化学处理或修饰，或带电荷，或用生物材料如多 聚-1-赖氨酸或多肽包被。肽包被的实例如RGD肽。本发明的组织构建物虽然可以生长在固相细胞生长表面，但优选带有孔的细胞生 长表面，它可以联通这种膜的上表面和下表面，从而允许培养基与形成中的组织构建物的 双向交流或仅与培养基以下部分进行接触。双向交流使培养基与形成中的构建物的顶部 和底部均可以交流，从而有最大表面积与培养基所含营养物质接触。培养基也可以仅与形 成中的组织构建物底部接触，而使上表面在形成皮肤构建物时暴露于空气。优选的培养容 器是应用了隔膜插入件的容器，所述隔膜插入件是一种经培养处理的渗透膜如多孔膜，它 悬浮于含有培养基的培养容器中。通常将此膜固定在某种管状膜或基架的一端，后者则插 入底座并形成接触面，如有盖培养皿。插入了多孔隔膜插入件的培养容器为领域内已知， 并被优选用于实施本发明，参见本领域的多个美国专利，其中部分已有商品，如5766937， 5466602，5366893，5358871，5215920，5026649，4871674，4608342，均引入本文参考。使用这 些类型的容器时，组织构建物产生于所述膜的其中一个表面，优选上表面，细胞培养基可同 时与上、下两个表面接触。生长表面上的孔可传送培养基，以便为穿膜培养物的下表面提 供营养，从而使细胞接受双面营养或仅从下表面接受营养。优选孔的孔径小到不会让生长 的细胞穿过此膜，但又大到足以使培养基所含营养物可自由地向该细胞-基质构建物的下 表面传送，如通过毛细作用。优选的孔径大小约不到3 μ m，可使用约0. 1-3 μ m，更优选约 0. 2-1 μ m，最优选约0. 4-0. 6 μ m。在人类真皮成纤维细胞的例子中，最优选的材料是孔径为约0. 4-0. 6 μ m的聚碳酸酯。最大孔径不仅取决于细胞大小，还取决于细胞改变其形状并穿 过该膜的能力。重要的是，该组织样构建物与所述表面粘附，但不掺入或包埋至所述材料， 因此只需稍稍加力便可剥除。所形成的组织构建物的大小和形状受它生长于其上的容器表 面或膜的大小的引导。所述材料可以是圆形、有角形、或带有圆形边角的形状、或不规则形 状，也可以是平整的、或有一定轮廓的模具，以便形成一定形状的构建物而与伤口吻合或可 模仿天然组织的物理结构。用于生长的材料表面积越大，就需要在该表面接种越多的细胞， 并加入更大体积的培养基从而足以浸泡并滋养这些细胞。当组织构建物最终形成时，不管 它是单层细胞-基质构建物还是双层构建物，均需在植入患者前从所述膜材料上剥离。本发明的培养型组织构建物的形成并不依赖于合成的或生物可吸收的膜如网状 膜。网状膜为机织物、手工编织物、或毛毡材料。在使用了网状膜的系统中，细胞在该网状 膜上培养，可生长于其中任一面的网眼中，使该网状膜被包裹或掺入所述培养型组织构建 物内。通过这些掺入网状膜的方法最终形成的构建物依赖于这些网状膜以获得物理支持并 扩增。依赖合成的网状膜的培养型组织构建物可参见Naughton等人的美国专利5580781， 5443950,5266480,5032508，4963489。产生细胞-基质层的系统可以是静态的，也可以是向培养基中灌注式的。静态系 统中的培养基相对较平静，而灌注系统中的培养基是处于动态的。培养基的灌注影响细胞 的活性并促进基质层的形成。灌注方式包括，但不限于在培养皿下部或邻近含培养膜的隔 膜材料处使用磁力棒或机动叶轮来搅拌培养基；在培养皿或室内抽吸培养基或使之流经培 养皿或室；在振动或旋转平台上轻轻摇动培养皿；如果是形成于滚瓶，则滚动。本领域技术 人员可确定能在本发明中使用的其它灌注方式。适用于本发明的培养基可根据待培养的细胞类型和待形成的组织结构来选择。促 进细胞生长、基质合成、以及活力的培养基以及具体培养条件取决于培养细胞的类型。有时，如形成本发明生物工程化的双层皮肤构建物时，不同形成阶段培养基的组 成不同以适应不同的添加需要。在一优选方法中，细胞-基质层在指定条件，即在化学确定 的培养基中形成。在另一优选方法中，组织构建物含有细胞-基质层以及在其上生长的第 二细胞层，其中这两种细胞均在指定的培养系统中培养。或者，该组织构建物含有在限定的 培养条件下形成的细胞-基质层，和在非限定的培养条件下于该层上形成的第二层。反之， 所述组织构建物含有可在非限定培养条件下形成的细胞-基质层，以及在限定的培养条件 下形成于其上的第二层。优选使用化学确定的培养基，即不含成分不明的动物器官或组织提取物，如血液、 垂体提取物、下丘脑提取物、胎盘提取物、或胚胎提取物或滋养细胞分泌的蛋白质和因子。 在最优选实施方案中，所述培养基不含未确定的成分和确定的非人源生物成分。未确定的 成分虽然不优选加入，但可根据已公开的方法在任何时间点向培养基中加入，以便成功地 形成组织构建物。当利用在非人动物来源的化学确定的成分上培养后筛选出来的人类细胞 实施本发明时，所得组织构建物是限定的组织构建物。可在化学确定的培养基中添加最优 选的制备方法中所用的化学确定的人工合成型功能等价体。通常，本领域的细胞培养技术 人员无需调查或实验就能确定向本发明培养基中添加的等价于公知动物成分的天然人类 等价体、人的重组等价体、或人工合成的等价体。这种构建物在临床上的优势在于消除了偶 然的动物或其它物种病毒的污染和感染。在检验环节中，化学确定的构建物的优势在于，进12行检验时，所得结果不会由于未限定的成分的存在而被混淆。培养基由营养基质组成，通常还添加其它成分。技术人员可确定动物细胞领域 的适当营养基质并有理由预期能成功地产生本发明的组织构建物。有很多商供营养源可 有效实施本发明。这些包括提供无机盐、能源、氨基酸、以及B族维生素的商供营养源如 Dulbecco' s 改良型 Eagle，s 培养基(DMEM)；最小基本培养基(MEM) ；MlOO ；RPMI 1640 ； Iscove，s改良型Dulbecco，s培养基(EDMEM)。最小基本培养基(MEM)和M199需要额外 加入磷脂前体和非必需氨基酸。商供的可提供额外氨基酸、核酸、酶之輔因子、磷脂前体、及 无机盐的富含维生素之混合物包括Ham，s F-12，Ham，s F_10，NCTC 109 JPNCTC 135。虽 然在各种浓度下，所有基本培养基以葡萄糖、氨基酸、维生素、和无机离子，以及其它基本培 养基成分的形式为细胞提供基本营养源。最优选的本发明基本培养基所含营养源为无钙或 低钙的Dulbecco，s改良型Eagle’ s培养基(DMEM)，或可任选的，DMEM加Ham’ s F_12(比 例在3 1至1 3之间)。在所述基本培养基中添加氨基酸、生长因子、和激素等成分。培养本发明细胞的确 定型培养基见Parenteau的美国专利5712163，和PCT国际
发明者文森特·龙法德, 迈克尔·P·墨菲 申请人:奥加诺吉尼西斯公司