专利名称：一株产α-酮戊二酸重组菌的构建及用其实现α-酮戊二酸过量积累的方法
技术领域：
本发明涉及一种在光滑球拟酵母(T. glabrata)胞内过量表达来源于酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)中编码丙酮酸脱氢酶系亚基PDA1 (PDH-E1 a )基因，从而提 高PDH活性，加速碳代谢流流向TCA循环途径，提高a -酮戊二酸(a -KG)的产量及生产强 度的方法，属于代谢控制策略优化发酵过程技术领域。
背景技术：
a-酮戊二酸，又称a-胶酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸，是三羧酸(TCA)
循环中重要的中间产物之一，在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，也是合成多种氨基
酸、蛋白质的重要前体物质。其结构式为
a -酮戊二酸结构式 a-酮戊二酸在医药、有机合成、营养强化剂等领域有着重要的应用前景，目前主 要应用领域为作为运动营养饮料的成分；有机中间体；生化试剂和测肝功能的配套试剂； 体格增强补剂；降低术后患者和长期病人的机体损耗；在脑部作为酪氨酸和谷氨酸的前 体；研究还表明，a-酮戊二酸具有抗氰作用，与亚硝酸钠、硫代硫酸钠配合使用可提高抗 氰能力，且有抗惊厥作用。a -酮戊二酸目前主要消费于医疗机构，用来诊断和对神经疾病 进行治疗。 T. glabrata利用葡萄糖积累a -KG的过程可分为两个阶段一是微生物利用葡萄 糖完成菌体的扩增，并生成大量丙酮酸和少量a-KG(约48h) ;二是微生物消耗丙酮酸并转 化为a-KG(约24h)。在这个过程中第二阶段——由丙酮酸向a-KG转化的效率尤为重要， 而丙酮酸脱氢酶系(PDH)正是控制这个转化效率的关键酶。前期研究中发现，通过增加发 酵液中PDH辅因子——维生素B工浓度提高PDH途径流量，可以有效的促进丙酮酸进一步代 谢，以此达到了过量积累a -KG的目的。 PDH是连接糖酵解途径和TCA循环的关键酶，其通量决定了由葡萄糖经糖酵解途 径进入TCA循环的碳流量大小，增加其通量是过量积累TCA循环中间代谢产物的关键因素。 其中编码El a亚基的PAD1基因为决定该酶系表达活性的主要因素，过量表达该基因可有 效提高PDH活性，进而促进丙酮酸的进一步代谢和a -KG的积累。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过T. glabrata过量表达丙酮酸脱氢酶系亚基 PDAl(PDH-Ela)基因，显著提高PDH活性，加速碳代谢流进入TCA循环的途径，导致a-酮戊二酸(a-KG)含量及生产强度的升高。 本发明的技术方案一株产a-酮戊二酸重组菌，其分类命名为光滑球拟酵母 (Torulopsis glabrata)PDA1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO :M 209247。所述的CCTCC NO:M 209247菌株的构建方法，通过过量表达丙酮酸脱氢酶系亚基
PDA1基因的手段，根据NCBI网站发表的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中丙酮酸脱
氢酶系序列，设计一对引物 S : 5' -CGGAATTCGCCAATGCTTGCTGCTTC-3'A :5' -ATCGGGCCCTTAATCCCTAGAGGCAAAACC-3，用于从酿酒酵母总DNA中扩增出PDA1基因，得到表达质粒pYX212_PDAl，转化
T. glabrata CCTCC M202019的尿嘧啶缺陷型菌株，筛选获得重组菌CCTCCNO :M 209247，提
高了 a-酮戊二酸合成速率，实现a-酮戊二酸过量积累。 所述CCTCC NO :M209247菌株发酵产a -酮戊二酸的方法 (1)、菌株:CCTCC NO :M209247 (2)、培养基 种子和斜面培养基(g/L):葡萄糖30，蛋白胨10， KH2P041， MgS04 7H200. 5 ;斜面培 养基添加琼脂20，pH 5. 5 ;基本发酵培养基(g/L):葡萄糖100， NH4S047， MgS04 7H20 0. 8， KH2P045， CH3C00Na 5，微量元素液lOmL，维生素液10mL， pH 5. 0 ;摇瓶发酵用60g/LCaC03作为pH缓冲齐U ;
微量元素液CaCl2 2H20 2g， FeS04 7H20 2g， ZnCl20. 5g， MnCl2 4H20 12g， CuS04 5H20 0. 05g，2mol/L HC1溶解后用去离子水定容至1L ; 维生素液烟酸80mg，硫胺素0. 15mg，吡哆醇40mg，生物素4mg，核黄素10mg，去离
子水定容至1L ; (3)、摇瓶培养 将3(TC、200rpm下培养24h的种子以10 %的接种量转入基本发酵培养基，于 30。C、200rpm条件下培养48h。 所述光滑球拟酵母(T. glabrata) CCTCC M202019，烟酸(NA)、生物素(Bio)、硫胺 素(B》、吡哆醇(Pdx)等四种维生素营养缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为本研 究室选育菌株，该菌种已申请中国专利，专利号为ZL 02113142. 2。 细胞干重的测定取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加2mol/L盐酸溶解菌悬 液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于660nm处 比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。
丙酮酸和a -KG浓度的测定高效液相色谱(HPLC)。 仪器Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、视差折光检测器和工 作站)； 色谱条件色谱柱C18柱，5iim，4. 6mmX250mm
流动相0. 1% H3P04
流速lmL/min
4
柱温28t: 进样量10iiL 紫外检测器波长215nm 样品制备5mL发酵液在10000rpm下离心10min，取上清液移入试管中以备测 a -KG用。测a -KG时，取lmL上清液移入50mL容量瓶中，去离子水定容至刻线，经0. 45 y m 滤膜过滤后，滤液供液相色谱分析用。 本发明的有益效果利用本发明调控工业微生物中碳代谢和碳代谢流流向分布， 使碳代谢流从积累丙酮酸转向大量积累a-酮戊二酸(a-KG)。 72h发酵结束后丙酮酸残 留量降为10. 4g/L，比出发菌(27. 4g/L)降低62. 0% ;相反a -KG产量达到31. 7g/L，比出 发菌(22. 8g/L)提高39%。 生物材料样品保藏光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)PDAl，已保藏于中国典 型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO :M209247，保藏日期为2009年10
月28日。
图1 :目的基因扩增及重组质粒pYX212-PDAl。 Ml :DL2000markers ;M2 :lkb ladder ;泳道1 :PDA1 ;泳道2 :pYX212-PDAl ;泳道3 :pYX212-PDAl/EcoRI/Apa I ;泳道4 : pYX212。 图2 :T. glabrata-PDAl的质粒提取和菌落PCR验证。Ml :lkb ladder ; M2 :DL2000markers ; 泳道1 :pYX212-PDAlfrom JM109 ; 泳道2 :pYX212-PDAlfrom T. glabrata-PDAl ;泳道3 :T. glabrata ;泳道4 :Pyx212_PDA 1 ;泳道5 :T. glabrata-PDAl 。
图3 :过量表达PDH酶对a -酮戊二酸(a -KG)发酵的影响。菌体干重(V)，葡萄 糖(參)，丙酮酸(▲)， a-酮戊二酸(國)，出发菌株(空心点)，工程菌(实心点)。
具体实施例方式
实施例1重组菌的构建及鉴定 以酿酒酵母基因组为模板，反应条件为94 °C 5min ;再94°C 30s，55°C 30s， 72°C 4min(30个循环)；72°C lOmin进行PCR反应，并以1 %琼脂糖凝胶电泳验证并回收 PCR扩增产物，结果为扩增得到与文献报道大小相符的PDA1基因片段(图la-泳道1)。用 限制性内切酶EcoR I和Apa I双酶切消化并纯化后的PDA1基因和穿梭载体pYX212，用 T4DNA连接酶于16t:过夜连接，连接产物转化宿主菌JM109，转化菌液涂布在LBA平板上， 37t:过夜培养，挑选阳性克隆子用酶切和PCR方法鉴定(图lb-泳道3)，并送上海生工测 序验证，最终获得含有PDA1基因的酵母表达质粒pYX212-PDA1(图lb-泳道2)。将重组 质粒pYX212-PDAl电转化T. glabrata Aura3感受态细胞，由于质粒pYX212中带有ura3 基因，与尿嘧啶缺陷型菌株遗传互补，得到能在匪平板正常生长的基因工程菌，并命名为 T. glabrata-PDAl。酵母电转化法为8iiL质粒或连接产物(约1 P g/P L)加入80iiL T. glabrata A ura3感受态细胞，冰浴5min，转入预冷的2mm电转杯，转化条件电压1. 5kV， 电容25iiF，电阻200Q，电击时间为5ms ;电击完毕后，迅速加入lmL冰预冷的1M山梨醇 溶液将菌体混匀，转至1. 5mL的EP管中，3(TC温育l_2h ;3500rpm离心5min，倒出800 900 y L上清，将剩余约200 ii L菌体悬液涂布于筛选培养基。在重组酵母T. glabrata-PDA 1中用质粒提取试剂盒提取质粒，并电转化大肠杆菌扩增，得到的质粒经限制酶EcoR I单 酶切后，经琼脂糖凝胶电泳验证为pYX212-PDAl (图2a-泳道2)。以PDA1-S和PDA1-A为 引物，T. glabrata-PDAl经菌落PCR得到大小约为1. 2kb的特异性片段(图2b_泳道5)，而 T. glabrata菌落PCR没有明显条带产生(图2b_泳道3)。 实施例2过量表达PDH酶对T. glabrata a -酮戊二酸(a -KG)发酵的影响
重组菌T. glabrata-pdal与出发菌的发酵过程曲线如图3所示。由(图3_a)显 示重组菌的葡萄糖消耗较出发菌快，而菌体生长速率则较慢，56h发酵液中残糖浓度低于 5g/L，出发菌停止生长，而重组菌利用培养基中积累的丙酮酸继续生长了 2.3g/L;由(图 3-b)显示发酵至48h时重组菌丙酮酸最高产量达到最大值39. 9g/L，为出发菌(43. 4g/L) 的91.9%，随后丙酮酸快速消耗，发酵结束时(72h)，残留丙酮酸仅为10. 4g/L，比出发菌降 低了76%;由(图3-c)显示随着丙酮酸的快速降解，重组菌a-KG合成速率加快，72h产量 到达31.7g/L，比出发菌(22. 8g/L)提高39%。
权利要求
一株产α-酮戊二酸重组菌，其分类命名为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)PDA1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NOM 209247。
2. —株权利要求1所述的CCTCC NO:M 209247菌株的构建方法，其特征是通过过量表达丙酮酸脱氢酶系亚基PDA1基因的手段，根据NCBI网站发表的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中丙酮酸脱氢酶系序列，设计一对引物S :5' -CGGAATTCGCCAATGCTTGCTGCTTC-3'A :5' -ATCGGGCCCTTAATCCCTAGAGGCAAAACC-3，用于从酿酒酵母总DNA中扩增出PDA7基因，得到表达质粒pYX212-PDAl ，转化T. glabrata CCTCC M202019的尿嘧啶缺陷型菌株，筛选获得重组菌CCTCCNO :M 209247，提高了 a-酮戊二酸合成速率，实现a-酮戊二酸过量积累。
3. 用权利要求l所述CCTCC NO :M209247菌株发酵产a -酮戊二酸的方法，其特征是(1) 、菌株CCTCC NO :M209247(2) 、培养基:种子和斜面培养基(g/L):葡萄糖30，蛋白胨10， KH2P04 1， MgS04 7H200. 5 ;斜面培养基添加琼脂20， pH 5. 5 ;基本发酵培养基(g/L):葡萄糖100，NH4S04 7，MgS04*7H20 0.8，KH2P04 5，CH3COONa 5，微量元素液10mL，维生素液10mL， pH 5. 0 ;摇瓶发酵用60g/LCaC03作为pH缓冲剂；微量元素液:CaCl2 2H20 2g， FeS04 7H20 2g， ZnCl20. 5g， MnCl2 4H20 12g， CuS04 5H200. 05g，2mol/L HC1溶解后用去离子水定容至1L ;维生素液烟酸80mg，硫胺素0. 15mg，吡哆醇40mg，生物素4mg，核黄素10mg，去离子水定容至1L ;(3) 、摇瓶培养将3(TC、200rpm下培养24h的种子以10%的接种量转入基本发酵培养基，于30°C、200rpm条件下培养48h。
全文摘要
一株产α-酮戊二酸重组菌的构建及用其实现α-酮戊二酸过量积累的方法，属于代谢控制策略优化发酵过程技术领域。本发明采用将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中编码丙酮酸脱氢酶系亚基的PDA1(PDH-E1α)基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株CCTCC NOM202019中，获得了一株产α-酮戊二酸重组菌CCTCC NOM209247。其丙酮酸脱氢酶(PDH)活性达到0.35U/mgprotein，为出发菌(0.092U/mg protein)3.8倍，过量表达PDA1基因提高了PDH途径的通量，可有效促进丙酮酸的进一步代谢，将碳代谢流导向TCA循环，α-KG产量达到31.7g/L，比出发菌(22.8g/L)提高39％。结果表明可以通过加强PDH活性的方法过量积累α-酮戊二酸(α-KG)，提高α-KG的生产强度。
文档编号C12P7/50GK101717735SQ20091023229
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者刘立明, 周景文, 张旦旦, 汪军, 陈坚 申请人:江南大学