专利名称：哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法、应用以及表达该抗原的菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法和该抗原作为抗海水鱼类弧菌病疫苗的应用，以及表达该抗原的菌株。
背景技术：
弧菌为革兰氏阴性杆菌或弯曲杆菌，广泛分布于海洋、河口等各种盐度的水生环境，也可见于人或鱼肠道中。弧菌是最主要的海水养殖动物的病原菌，由病原弧菌引起的感染性疾病在世界各地普遍流行。我国沿海各省海水养殖业发达，但主要养殖品种如大黄鱼、鲈鱼、石斑鱼、牙鲆、大菱鲆、欧洲鳗等均受到弧菌病的严重危害。传统的抗生素治疗在防治海水动物弧菌病中曾经发挥了重要的作用，但是由于长期用药可能引起水产品药物残留和耐药菌的传播问题，目前农业部对抗生素在水产养殖中的使用已有严格的规定，能够应用的种类少之又少。近年来，免疫预防由于其对动物无副作用、对环境的友好特性、预防特定疾病的有效性而备受重视，疫苗在水产动物病害控制中的应用正逐步推广。目前在养殖实践中应用的多数为灭活疫苗，一般以浸泡的方式进行免疫接种，存在相对保护率较低、有效保护期不长等不足。研究者们努力开展基因工程疫苗研究，应用大肠杆菌表达的亚单位疫苗成分进行注射或口服免疫，但是，由于原核表达的重组蛋白多数以不溶的包涵体形式表达，抗原蛋白需经历后期相对难度较大的纯化和复性过程，批量生产工艺复杂，生产成本居高不下，难以大规模推广应用。弧菌外膜蛋白ompK作为弧菌属种类中一种较为保守的功能性外膜蛋白，其良好的免疫原性已经获得验证(Fish & aiellfishlmmunology， 23(2007)567-575)。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种表达哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的菌株。本发明的目的之二在于提供一种可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原。本发明的目的之三在于提供一种哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法。本发明的目的之四在于提供一种用于防治海水鱼类弧菌病的口服疫苗。本发明的目的之五在于提供哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原在抗海水鱼类弧菌病疫苗方面的应用。本发明可表达哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白ompK抗原的菌株，其为一种毕赤酵母重组菌株(Pichiapastoris)GS115-ompK，它的保藏编号为CGMCC No. 4362，其具有分泌表达如序列<400>2的氨基酸序列的可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的能力。本发明哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的DNA，它的核苷酸序列如序列<400>1所述。本发明哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原，它的氨基酸序列如序列<400>2所述。本发明哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法，是以哈维氏弧菌鲈鱼分离致病株(Vibrio harveyi)zj2008的基因组DNA为模板，用PCR方法克隆ompK的编码基因，将该基因重组到表达质粒pPIC9K中，获得重组质粒pPIC9K-ompK，将重组质粒线性化，以原生质体转化的方法整合到毕赤酵母GS115细胞中，获得整合了质粒pPIC9K-ompK DNA的毕赤酵母重组菌株，该毕赤酵母重组菌株GS115-ompK的保藏编号为CGMCC No. 4362，转化的毕赤酵母GS115重组菌株细胞在甲醇诱导下表达重组蛋白，重组蛋白以可溶性的形式分泌到培养液中，表达的蛋白经离心后收集，浓缩；所述哈维氏弧菌鲈鱼分离致病株zj2008的保藏编号为 CGMCC No. 4363。本发明防治海水鱼类弧菌病的口服疫苗，其由如序列<400>2的氨基酸序列的可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原佐以药学上可接受的佐剂而成。所述佐剂为海藻酸钠和壳聚糖。所述哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原在疫苗中的含量为10mg/L，海藻酸钠和壳聚糖在疫苗中的含量分别为1.5Wt%和1.0Wt%，其为一种微球疫苗悬液。使用时，该微球疫苗悬液可拌于海水鱼饲料中给海水鱼口服，并且以添加适量玉米油为宜，优选是，微球疫苗悬液、海水鱼饲料及玉米油的重量配比优选为10 90 3。本发明如序列<400>2的氨基酸序列的哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原，可制备弧菌基因工程口服亚单位疫苗，用于防治海水鱼类弧菌病。本发明将哈维氏弧菌ompK基因构建到真核表达载体pPIC9K (Invitrogen)，再重组到毕赤酵母GSl 15细胞中，获得毕赤酵母GSl 15重组菌株，从而实现蛋白经酵母细胞分泌表达，且表达的哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原溶解于酵母培养液中，为抗原蛋白的工业化生产提供了捷径，使亚单位疫苗的生产成为可能。毕赤酵母表达系统是一类能够有效表达重组蛋白的真核表达系统，其表达的蛋白能进行正确的翻译后加工和折叠，从而实现具有生物学活性目的蛋白的高效表达；并且，毕赤酵母诱导培养基中少有蛋白成分，其表达过程中也很少向细胞外分泌本身蛋白，分泌表达的重组蛋白成为胞外培养液中最主要的蛋白成分，采用相对简单的纯化工艺即可获得重组蛋白-哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原。同时， 成熟的高密度发酵技术为目的蛋白的工业化生产提供了捷径，使亚单位疫苗的生产成为可能。酵母表达系统用于研制口服疫苗具有很好的前景，因为酵母早就是饲料的一种重要成份，通常被认为是安全的。由此可见，本发明借助于先进的分子生物学技术，应用酵母获得抗原蛋白开发疫苗，具有较好的经济性和可实践性。本发明研究结果表明，目的蛋白可经简单纯化和浓缩后制备成口服疫苗免疫海水养殖鱼类，有效抵抗弧菌病的侵袭。另外，采用本发明方法可批量生产弧菌外膜蛋白抗原，操作简便，成本低廉。保藏说明1、毕赤酵母重组菌株GS115-ompK，于2010年11月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 4362。2、哈维氏弧菌鲈鱼分离致病株ζ j2008，于2010年11月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 4363。
图1是真核表达载体pPIC9K-ompK的电泳图；图中M为DNA分子量标准DL2000，1 为PCR产物，2为重组质粒pPIC9K-ompK。
图2是经转化整合了真核表达载体pPIC9K-ompK载体DNA的重组酵母的PCR鉴定电泳图；图中M为DNA分子量标准DL2000，1为原始pPIC9K载体对照，2为未转化的GS115 阴性对照，3为阳性对照，4-9为含4. Omg/L抗生素G418的MD平板上的阳性克隆。图3是重组蛋白ompK经酵母细胞的表达图；图中M为蛋白分子量标准，1为转化了原始载体PPICQk的GS115第3天培养上清(对照)，2为重组阳性克隆甲醇诱导表达第1 天的培养液上清，3为重组阳性克隆甲醇诱导表达第2天的培养液上清，4为重组阳性克隆甲醇诱导表达第3天的培养液上清。图4是酵母表达的重组蛋白ompK的免疫印迹图；图中，1为甲醇诱导第3天的重组酵母GS115-ompK培养上清，2为转化了原始载体的酵母菌株经同样处理同时期的培养上清(对照)。
具体实施例方式以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。实施例1 ompK真核表达载体pPIC9K_ompK的构建PCR引物根据本课题组已克隆到的哈维氏弧菌ompK序列(基因登录号 HQ395754)的成熟肽编码基因两端序列设计引物，同时为构建载体方便，在引物的5’端分别引入酶切位点 EcoR I 和 Not 1，引物口1:5' GGAATTCGCTGACTACTCAGACGGCG 3，，引物口2: 5，ATAAGAATGCGGCCGCTTAGAACTTGTAAGTTACTGC 3，，引物序列由上海生工生物技术有限公司合成。OmpK成熟肽编码基因的制备以哈维氏弧菌ζ j2008株基因组DNA为模板，用PCR技术获得目的序列。PCR反应条件为初始变性940C，4min, 94°C变性，45S，56°C，45S，72°C， 60S，循环30次，最后72°C延伸5min。PCR产物的克隆和鉴定纯化的PCR产物以EcoR I 和Not I双酶切，与经同样酶切的PPIC9K连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，用酶切方法进一步鉴定，以上操作均按常规方法进行。用ΑΒΙ3730型自动测序仪对阳性克隆进行序列分析以鉴定重组质粒。经鉴定的重组质粒pPICTk-ompK以Ml I酶切线性化。毕赤酵母菌株GSl 15按常规方法制备原生质体，将线性化的质粒转化至原生质体，与融化的再生葡萄糖琼脂(RD)混合后涂布再生平板(RDB)，30°C培养，4-6天后长出再生的酵母菌落；将长出的菌落转接到加有不同浓度的抗生素G418 (0. 5mg/L, lmg/L, 2mg/L, 4mg/L)的MD平板，30°C培养2天后获得整合了质粒DNA的重组菌株，经相应引物(5，A0X1引物5' GACTGGTTCCAATTGACAAGC3‘； 3’ AOXl引物5' GCAAATGGCATTCTGACATCC3‘)进行PCR鉴定，阳性克隆进一步以最小甲醇培养基(MM)平板和最小葡萄糖培养基(MD)平板平行培养鉴定菌株的表型，重组菌株在 MD和匪平板上的菌落呈乳白色，在MD和匪平板上的生长速度相近，经30°C，72h培养后， 菌落平均直径相近，平均约4mm，确定重组菌株为利用甲醇生长的野生型Mut+型。总的来说，重组的酵母菌GSl 15在含G418^ig/L的MD平板上生长，在匪平板上也正常生长；以其基因组DNA为模板，以醇氧化酶引物5’ AOXl引物和3’ AOXl引物进行PCR扩增，可获得长为12^bp(目的片段741bp+载体片段481bp)的特异性片段。PCR扩增产物的长度为741碱基，真核表达载体的构建和酵母重组菌株的鉴定如图1、2所示。图1中M为DNA分子量标准DL2000，1为PCR产物，2为重组质粒pPIC9K-ompK。 图2中M为DNA分子量标准DL2000，1为原始pPIC9K载体对照，2为未转化的GS115阴性对照，3为阳性对照，4-9为含4. Omg/L G418的MD平板上的阳性克隆。实施例2 重组ompK基因的表达和免疫印迹(Western-blotting)经PCR验证的重组菌株在BMGY培养基中，30°C，250rpm旋转培养16h，离心收集细胞，转接到诱导培养基中，连续4天，每24h加入50ml/L的甲醇进行诱导并取样，离心，收集诱导表达的培养上清液，以12.5% (w/v)的胶浓度进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)， 分析表达情况。免疫印迹程序采用常规操作方法，培养上清样品经12. 5%胶浓度的SDS-PAGE后， 转移到硝酸纤维素膜上，用5% (w/v)的脱脂奶粉封闭，兔抗ompK —抗反应池，辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG 二抗反应lh，用3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)显色。重组ompK在酵母细胞内的表达和免疫印迹验证结果见图3、4。图中，培养液上清中出现目的蛋白，分子量约为36kDa，比预期Q9kDa)稍高，表明重组蛋白以可溶性的形式分泌表达，部分糖基化。重组蛋白在加入甲醇诱导后，第2天出现明显的表达带，第3天达到最高，蛋白产量为2mg/L(Bandsan软件分析)。图3中M为蛋白分子量标准，1为转化了原始载体PPICQk的GS115第3天培养上清(对照)，2为重组阳性克隆甲醇诱导表达第1天的培养液上清，3为重组阳性克隆甲醇诱导表达第2天的培养液上清，4为重组阳性克隆甲醇诱导表达第3天的培养液上清。图4中M为蛋白分子量标准，1为重组菌株GS115-ompK 经甲醇诱导表达的分泌蛋白，2为对照(转化了原始载体PPIC9K的酵母菌株的分泌蛋白)。 图4中在36kDa分子量处出现了一条明显的印迹带，而仅转化了原始载体的酵母菌株分泌蛋白中无相应反应带，指示了重组蛋白ompK的准确表达并具有免疫原性。图4中，1为重组酵母GS115-ompK经甲醇诱导表达第3天的培养上清，2为转化了原始载体的酵母菌株经同样处理同时期的培养上清。实施例3重组蛋白对大黄鱼哈维氏弧菌病的免疫防治效果健康大黄鱼200尾，体重40_50g，随机分为4组，每组50尾。以三种抗原，即80% 饱和硫酸铵盐析获得粗纯化的重组蛋白ompK、表达ompK的酵母细胞全培养液和哈维氏弧菌zj2008灭活菌体(终浓度为0.8%的福尔马林灭活，菌体浓度1 XlO8ceIlsAiL)，与 1.5%的海藻酸钠和1.0%的壳聚糖制备微球疫苗悬液(浓度分别为含蛋白10mg/L、含菌体4.0X101(lcellS/L)，以此疫苗加入到海水鱼粉状饲料中制备湿颗粒饵料(将微球疫苗溶液与鳗鲡粉状饲料(宁波天邦股份有限公司)混合，按3% (w/w)的比例添加玉米油， 经小型搅肉机搅拌，制备湿颗粒饵料)，作为口服疫苗分别免疫大黄鱼，剂量分别为含重组蛋白50 μ g/尾、50 μ g/尾、2. OX IO8Cells/尾，每天一次，持续7天，4周后以哈维氏弧菌 zj2008株活菌悬液腹腔注射进行人工攻击，观察和记录14天内的死亡率，计算存活率和免疫保护率，三试验组的存活率分别达到70%、72%和72%的存活率，极显著高于对照组(P < 0. 01)，相对免疫保护率则分别为66. 7%,68. 9%和68. 9%，均达到有效保护。实施结果表明，酵母表达的重组ompK无论经纯化或者不经纯化均可用于制备海水鱼口服疫苗，获得优良的免疫保护效果。表1重组外膜蛋白ompK对大黄鱼的免疫保护效果组别攻击尾数死亡尾数存活率(％)免疫保护率(％)粗纯化的重组ompK湿颗粒饵料组50157066.7表达ompK的酵母细胞全培养液50147268.9湿颗粒饵料组灭活哈维氏弧菌疫苗组50147268.9生理盐水对照组504510
权利要求
1.一种毕赤酵母重组菌株(Pichiapastoris)GSl 15-ompK，它的保藏编号为 CGMCCNo. 4362，其具有分泌表达如序列<400>2的氨基酸序列的可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的能力。
2.一种哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的DNA，它的核苷酸序列如序列<400>1所述。
3.—种哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原，它的氨基酸序列如序列<400>2所述。
4.一种如权利要求3所述的哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法，是以哈维氏弧菌鲈鱼分离致病株(Vibrio harveyi)zj2008的基因组DNA为模板，用PCR方法克隆ompK的编码基因，将该基因重组到表达质粒pPIC9K中，获得重组质粒pPIC9K-ompK，将重组质粒线性化，以原生质体转化的方法整合到毕赤酵母GSl 15细胞中，获得整合了质粒pPIC9K-ompK DNA的毕赤酵母重组菌株，该毕赤酵母重组菌株GSl 15-ompK的保藏编号为CGMCC No. 4362， 转化的毕赤酵母GS115重组菌株细胞在甲醇诱导下表达重组蛋白，重组蛋白以可溶性的形式分泌到培养液中，表达的蛋白经离心后收集，浓缩；所述哈维氏弧菌鲈鱼分离致病株 zj2008 的保藏编号为 CGMCCNo. 4363。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述PCR方法中所用引物为引物 pi :5' GGAATTCGCTGACTACTCAGACGGCG 3’ ；引物 p2 :5’ ATAAGAATGCGGCCGCTTAGAACTTGTAAGTTACTGC 3’ ；并在引物Pl和引物P2的5’端分别引入酶切位点EcoR I和Not I。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于所述PCR方法中的PCR反应条件为初始变性940C，4min, 94°C变性，45S，56°C，45S，72°C，60S,循环30次，最后72°C延伸 5min。
7.一种防治海水鱼类弧菌病的口服疫苗，其特征在于其由如序列<400>2的氨基酸序列的可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原佐以药学上可接受的佐剂而成。
8.根据权利要求7所述的口服疫苗，其特征在于所述佐剂为海藻酸钠和壳聚糖。
9.根据权利要求8所述的口服疫苗，其特征在于所述哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原在疫苗中的含量为10mg/L，海藻酸钠和壳聚糖在疫苗中的含量分别为1. 5wt%和1. Owt%。
10.一种如序列<400>2的氨基酸序列的哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原在制备防治海水鱼类弧菌病口服疫苗方面的应用。
全文摘要
本发明涉及哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法、应用以及表达该抗原的菌株。本发明以哈维氏弧菌致病菌株zj2008株为模板，用PCR法克隆抗原ompK的编码基因，将该基因构建到真核表达载体pPIC9K中获得重组载体pPIC9K-ompK；重组载体线性化后转化毕赤酵母细胞GS115，经抗性筛选和PCR鉴定获得整合了重组载体的阳性酵母克隆；重组的酵母经甲醇诱导分泌表达ompK，分子量约为36kDa，产量达2mg/L。重组酵母经甲醇诱导表达3天后离心，收集上清，浓缩后获得粗纯化的蛋白溶液，以浓缩后的蛋白抗原制口服疫苗，免疫实验鱼，一段时间后对攻击感染产生有效的免疫保护性。
文档编号C12R1/84GK102161974SQ20101061955
公开日2011年8月24日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者何超军, 吴雄飞, 毛芝娟, 陈吉刚 申请人:毛芝娟