一种发酵种子液的制备方法及豆粕发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种种子液的制备方法及连续化豆柏发酵的方法，属于生物发酵技术 领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国的养殖业有了巨大的发展，对饲料的需求逐年增加。豆柏因含有丰富 的蛋白质，是饲料行业中最重要的植物性蛋白源。因豆柏中含有大量的抗营养因子，限制了 豆柏的应用，尤其在幼小家畜饲料的使用，众多研究发现：微生物降解是一种高效、可行的 方法。
[0003] 采用微生物发酵处理，种子液制备工艺是保证产品质量稳定至关重要的一个环 节。
[0004] 目前，对于发酵豆柏工业化生产过程中种子液制备，文献报道常采用的是菌种复 壮后，斜面培养，接入摇瓶在摇床上培养一段时间后，再以一定接种量接入发酵罐，进行放 大培养，待种子液成熟后，接入一定含水量見柏，进行固体发酵；例如：CN101684450B公开 了一种饲料预混料的生产工艺，通过对枯草芽孢杆菌两次扩培后，将发酵液接入豆柏，制得 饲料预混料，可添加入多种动物饲料中，显著促进动物生长、提高饲料转化率、增加动物免 疫功能。又如：吴胜华、李吕木等人研究多菌种固态发酵豆柏生产小肽饲料中，乳酸菌、枯 草芽孢杆菌、酵母菌等都通过斜面活化后，接入各菌增殖培养基，经摇床或静置培养48h，再 以2%接种量分别接到各菌的发酵种子培养基中，培养24h，制成发酵种子液；为提高豆柏 的营养价值，霉菌也常被使用，如：Ilyas,A.M.Hirabayashi，T.Matsui，H.Yano等人用曲霉 (Aspergillususami)发酵豆柏，将曲霉接入摇瓶培养3-4d，将孢子悬浮于豆柏混匀，进行 固态发酵，去除豆柏中植酸，提高动物对有机磷的吸收利用。
[0005] 然而传统发酵豆柏种子液制备过程中，菌种需经斜面活化、摇瓶扩培再进行产业 化种子制备，工序繁琐、流程长、染菌风险大。
[0006] 另一种是将芽孢菌、酵母菌、乳酸菌、霉菌等一种或几种微生物制成干粉，先与一 定量水（可含一定营养物质）搅拌均匀后，再与豆柏混匀，或将一定量菌粉直接与一定含水 量豆柏拌匀，进行固体发酵。例如：CN102823717A将复合发酵菌剂与温热洁净水混合均匀 形成复合发酵菌液之后，均匀喷洒在豆柏原料上，经一段时间发酵、干燥后，制得高生物活 性发酵豆柏；此种方法成本高、工序更长，菌粉由发酵液经浓缩、冷冻干燥、分装等制成，设 备投入大，对于一些小型企业，难以实现。
[0007] 目前发酵中使用的发酵菌株在培养过程中，容易发生退化，不能连续进行发酵培 养获得发酵种子液，目前生产中还没有一种具有良好稳定性的菌株，以达到连续化豆柏发 酵，在豆柏发酵过程中，发酵菌株的退化问题是影响豆柏发酵连续化的一个重要问题。
[0008] 纵观我国发酵豆柏发展，还处于大规模产业化生产初期，国内大部分厂家采用的 都是批次生产，自动化程度低，产品质量参差不齐。总体来说，发酵豆柏产品受到菌株性能、 生产设备、市场竞争等诸多因素限制，至今未见连续化生产发酵豆柏的方法。本发明针对 现有发酵豆柏种子液制备工艺中发酵菌株容易退化、工艺繁琐且设备投入大的缺点，提供 一种稳定性好的菌株及连续化种子液制备工艺，缩短种子液制备时间，在此基础上，实现接 种、固态培养、干燥、包装等工序连续化生产，提高生产效率。
【发明内容】
[0009] 本发明的第一方面在于，提供一种制备枯草芽孢杆菌B3发酵种子液的方法，方法 包括以下步骤：
[0010] ⑴将枯草芽孢杆菌B3种子液接种至无菌发酵培养基中，发酵培养至发酵液0D6。。 到达 0. 8-1. 0 ;
[0011] (2-1)进行流加培养，优选的，流加培养时发酵液的0D_为0. 8-1. 0 ;或
[0012] (2-2)取出部分体积发酵种子液，以获得枯草芽孢杆菌B3发酵种子液，向保留的 种子液中补加无菌发酵培养基，并继续发酵培养至发酵液OD6。。到达0. 8-1. 0，
[0013] (3)收集获得枯草芽孢杆菌B3发酵种子液。
[0014] 在本发明的提供的制备种子液的方法中，在步骤（3)前重复步骤（2-2) 1-100次， 优选重复2-80次，更优选10-50次。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，步骤（1)所述的种子液为将枯草芽孢杆菌B3于 30°C-37°C，100_300rpm下培养 14-16h获得的。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，步骤（1)所述的种子液为使用LB培养基或牛肉膏蛋 白胨培养基获得的。
[0017] 在本发明的一个实施方案中，步骤（1)中所述的发酵培养为于30-37°C，通气量 3_4vvm，揽泮速度500-600rpm下培养。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，步骤（2-1)中所述流加培养速度为200-500ml/min。
[0019] 在本发明的一个实施方案中，其特征在于，步骤（2-1)中所述的流加培养和/或步 骤（2-2)中所述的发酵培养的通气量为3-4vvm，搅拌速度500-600rpm。
[0020] 在本发明的一个实施方案中，步骤（2-2)中所述取出部分体积发酵种子液为取出 发酵种子液的50% -99%体积，优选取出50% -80%体积。
[0021] 本发明的第二方面在于，提供一种连续化生产发酵豆柏的方法，所述方法为将使 用前述方法制得的枯草芽孢杆菌B3发酵种子液接种至豆柏，进行发酵得发酵豆柏。
[0022] 在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括所述发酵豆柏经干燥的步骤。
[0023] 在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括粉碎或制粒的步骤。
[0024] 在本发明的一个实施方案中，所述的接种为接种后豆柏中活细胞数达到 (1-9)XlO7CfVg;在本发明的一个实施方案中，所述的豆柏含水量为45-50%。
[0025] 在本发明的一个实施方案中，其特征在于，所述的发酵为固态发酵，优选的，所述 固态发酵于30-37 °C下发酵24h-168h。
[0026] 本发明因采用连续化制备发酵豆柏种子液及连续化生产发酵豆柏的的工艺方法， 具有以下优点：
[0027] (1)工艺简单，实现豆柏的连续化生产；
[0028] (2)提商生广效率和设备利用率；
[0029] (3)减少设备投入及能耗、降低生产成本。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明的连续化模式I发酵豆柏生产工艺流程图。
[0031] 图2是本发明的连续化模式II发酵豆柏生产工艺流程图。
【具体实施方式】
[0032] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
[0033] 在本发明中，如果没有特别的说明，百分数（％)或者份都指相对于组合物的重量 百分数或者重量份。
[0034] 在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合 形成新的技术方案。
[0035] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方 式可以相互组合形成新的技术方案。
[0036] 在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可 以相互组合形成新的技术方案。
[0037] 在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100%。
[0038] 在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量 份。
[0039] 在本发明中，除非有其他说明，数值范围"a_b"表示a到b之间的任意实数组合的 缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围"0-5"表示本文中已经全部列出了 "0-5" 之间的全部实数，"0-5"只是这些数值组合的缩略表示。
[0040] 在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围"a-b"表示a到b之间的任意整数组 合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围" 1-N"表示1、2……N，其中N是 整数。
[0041] 在本发明中，除非有其他说明，"其组合"表示所述各元件的多组分混合物，例如两 种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
[0042] 如果没有特别指出，本说明书所用的术语"一种"指"至少一种"。
[0043] 如果没有特别指出，