专利名称：一种酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性P -葡聚糖酶P-Bglul6A及其基因和应用。
背景技术：
￠-葡聚糖是谷物类植物细胞壁的主要成分，在大麦、燕麦、小麦、水稻胚乳细胞壁中含量尤为丰富(Buliga et al. Carbohydr Res 1986,157:139-156)。3 -葡聚糖是由1200个以上吡喃型D-葡萄糖残基以￠-1,4和1，3-糖苷键连接形成线型分子。￠-葡聚糖独特的分子结构使其能以高分子量的形式溶于水，且溶液粘度很高，给工业生产带来诸多不便。如￠-葡聚糖在消化道中吸水膨胀黏连，使其成为限制麦类饲料营养成分有效利用的主要抗营养因子。高分子量的大麦￠-葡聚糖可引起麦汁和啤酒粘度增加，致使麦汁过滤困难、得率降低，啤酒非生物性浑浊，影响啤酒的稳定性和质量。^ -葡聚糖酶可以将P -葡聚糖水解成为较小的聚合物，消除P -葡聚糖造成的负面影响，是饲料工业和啤酒行业中广泛使用的一种酶。根据酶作用底物糖苷键的类型和机制，可将￠-葡聚糖酶分为0-1，3 (4)-葡聚 糖酶(EC 3.2. 1.6)、￠-1,4-葡聚糖酶(纤维素酶，EC 3. 2. 1.4), 3-1，3-葡聚糖酶(昆布多糖酶，EC 3. 2. I. 39), 3-1，3-1，4-葡聚糖酶(地衣多糖酶，EC 3. 2. I. 73)等(McCarthy et al. Int J Biol Macromol. 2003,33 141-148 ；Boyce and Walsh. Appl Microbiol Biotechnol. 2007, 76 :835-8412007)。￠-葡聚糖酶广泛的存在于植物和微生物中。微生物￠-葡聚糖酶因其具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等优点而成为3 -葡聚糖酶的重要来源。现在人们主要从细菌如枯草芽孢杆菌或真菌如黑曲霉、木霉等微生物中提取3 -葡聚糖酶，而天然菌株产葡聚糖酶的量较低是限制其工业化生产的一个重要因素。1983年爱尔兰学者首先从枯草芽抱杆菌中克隆到葡聚糖酶基因(Cantwell and McConnell, gene. 198323(2)211-219)。随后，人们从许多微生物中克隆得到了 ￠-葡聚糖酶基因，并进行序列分析和异源表达。根据氨基酸序列的相似性，0-葡聚糖酶多属于糖苷水解酶第1、5、7、9、12、16和45家族。第16家族的P -葡聚糖酶多来源于细菌，而真菌16家族P -葡聚糖酶则报道的很少。^ -葡聚糖酶是最早的应用于饲料工业的酶类，主要来自芽孢杆菌的16家族 葡聚糖酶，其作用PH为中性限制了其在饲料中的应用效果。饲料用￠-葡聚糖酶的作
用环境是动物的胃肠道，单胃动物的胃呈酸性，PH值在2. 0 3. 5。这就要求优良的饲料用^ -葡聚糖酶的最适pH为酸性，而且在pH2. 0到6. 5这一范围内均能维持高活性，这样酶的作用时间最长，能最高地发挥其效率。另外，动物胃肠道中分泌胃蛋白酶、胰蛋白酶等多种蛋白酶以消化食物，￠-葡聚糖酶本身就是一种蛋白质，也有可能被这些蛋白酶降解而失去活性，这就要求饲料用￠-葡聚糖酶必需对动物胃肠道中的蛋白酶有一定的抗性。挖掘分离酸性、高比活、抗蛋白酶的性质优良的葡聚糖酶和葡聚糖酶基因，并实现葡聚糖酶的高效表达，仍然是提高3 -葡聚糖酶饲用效果、提高产量、降低生产成本的关键。
本发明从云南锡矿的酸性废水中分离的Penicillium sp. WNl菌株中得到了一个新的￠-葡聚糖酶基因，编码的￠-葡聚糖酶具有在酸性及偏中性的PH范围有高活性及稳定性、高比活、强的蛋白酶抗性、良好的热稳定性、容易发酵生产等特点。所有这些优点都意味着本发明的新的￠-葡聚糖酶在饲料及食品等行业，与现有￠-葡聚糖酶相比，将会更有应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种酸性P -葡聚糖酶P_Bglul6A。本发明的另一目的是提供编码上述酸性￠-葡聚糖酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述酸性￠-葡聚糖酶基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述酸性￠-葡聚糖酶的重组菌株。本发明的另一目的是提供制备上述酸性￠-葡聚糖酶的方法。本发明的另一目的是提供上述酸性￠-葡聚糖酶的应用。本发明分离筛选出一种生产上述酸性￠ -葡聚糖酶P_Bglul6A的青霉WNKPenicillium sp.)，于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 5131。本发明提供了一种P -葡聚糖酶P_Bglul6A，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示RPSTLLQLA ALAGLSSAQT YTLYDDYPTG MDFFSKFSFFTVffVLFRDTD PTNGYVDYVN 60ENTAESAGLI YASGNATYVG VDSSNVASGS GRQSVRLTST ASYTHGLFVLDLAHMPGSVC120GSffPAFffTVG SNWPNNGEID IIEGVNQQSA NAMTLHTSEG CTINDSGFSGSLSTSNCffTE180APGQSNNAGC GIDATSSATY ⑶GFNSAGGG IYAMEWTCDY IQVFEFTHDSAPADLTSGSP240NPSTffGEPAA YFA⑶CDIDS HFTANQIVFD ITFCGDffAGN VffSSGTCSSLASTCNDYVQN300NPSAFSETYff LINSLKVYSS 320其中，该酶全长320个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列 “MRPSTLLQLA ALAGLSSA”。因此，成熟的0 -葡聚糖酶P_Bglul6A的理论分子量为32. 4kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 QTYTLYDDYP TGMDFFSKFS FFTVffVLFRD TDPTNGYVDYVNENTAESAG LIYASGNATY 60VGVDSSNVAS GSGRQSVRLT STASYTHGLF VLDLAHMPGSVCGSffPAFffT VGSNWPNNGE 120IDIIEGVNQQ SANAMTLHTS EGCTINDSGF SGSLSTSNCff TEAPGQSNNAGCGIDATSSA180
TYGDGFNSAG GGIYAMEWTG DYIQVFEFTH DSAPADLTSG SPNPSTWGEPAAYFAGDCDI240DSHFTANQIV FDITFCGDWA GNVWSSGTCS SLASTCNDYV QNNPSAFSETYWLINSLKVY300SS302该酸性￠-葡聚糖酶P_Bglul6A作用pH范围广，低于pH 7. 0时表现出水解活性，最适pH为5.0。在pH 4.0到5.5之间，酶活能达到最高酶活的70%以上，在pH3. 5到6. 0之间，酶活能达到最高酶活的40%以上；该酶最适作用温度50-55°C。这种性质的￠-葡聚糖酶未曾有过报道。
·
本发明提供了编码上述￠-葡聚糖酶的基因p_bglul6A。该酶的全基因序列如SEQID NO. 3 所示atgcgtcctt cgactctcct tcaactggct gcgctcgccg gcttgagcag tgctcaaacc60tacactttgt acgacgacta cccaactggg atggacttct tctccaagtt cagctttttc120actgtatggg tgctcttccg cgtgtgtcat ctcaaatgag ctaacatttc ttctttcttc180aggataccga tcccaccaat ggctacgtcg attatgtcaa tgagaacact gccgaaagtg240ctggattgat atatgcgagt ggcaatgcta cttatgttgg tgttgattct tcaaatgtag300cctccggcag tggtcgtcag agcgtgcgtc tgaccagcac cgcttcttac acccatggct360tgttcgttct tgatctggct cacatgccag gttccgtttg tggttcttgg cctgccttgt420aagtcttccg aaaattgtga ggtagaatga tagatactaa tatctattag ctggaccgtt480ggaagcaact ggccgaacaa cggcgaaatc gatatcatcg aaggagtcaa tcagcaaagc540gccaatgcca tgaccctgca caccagcgag ggctgcacca tcaacgattc cggctttagt600ggttccctat cgacgagcaa ctgctggacc gaagccccag gccagagtaa caacgccggc660tgcggtattg atgcgacttc ctctgccacg tacggagatg gattcaacag cgccggtggc720ggcatctacg ctatggaatg gacaggcgac tacattcaag tctttgaatt cacccacgac780agcgctccgg ctgatctcac ttctggtagc cctaacccaa gtacctgggg cgaacctgcg840gcttactttg ctggtgactg cgatattgac tctcacttta ccgccaacca gatcgtacgt900taccccctac agtcatactt gtctagaaaa caattaacta atcatgtcca ggtctttgat960atcactttct gcggtgactg ggctggcaat gtttggagct caggtacctg ctccagcctg1020gctagtactt gcaatgacta cgtccagaac aacccttctg ccttttccga gacttattgg1080ctcatcaact ctctcaaggt ctactcaagc tag1113本发明通过PCR的方法分离克隆了这一酸性P -葡聚糖酶基p_bglul6A，DNA全序列分析结果表明，0 -葡聚糖酶P-Bglul6A的结构基因全长1，113bp，含有3个内含子，143-184bp，419-470bp，897-953bp 为其内含子序列，cDNA 长 963bp，其 cDNA 序列如 SEQ IDNO. 4所示atgcgtcctt cgactctcct tcaactggct gcgctcgccg gcttgagcag tgctcaaacc60tacactttgt acgacgacta cccaactggg atggacttct tctccaagtt cagctttttc120actgtatggg tgctcttccg cgataccgat cccaccaatg gctacgtcga ttatgtcaat180gagaacactg ccgaaagtgc tggattgata tatgcgagtg gcaatgctac ttatgttggt240gttgattctt caaatgtagc ctccggcagt ggtcgtcaga gcgtgcgtct gaccagcacc300
gcttcttaca cccatggctt gttcgttctt gatctggctc acatgccagg ttccgtttgt 360ggttcttggc ctgccttctg gaccgttgga agcaactggc cgaacaacgg cgaaatcgat 420atcatcgaag gagtcaatca gcaaagcgcc aatgccatga ccctgcacac cagcgagggc 480tgcaccatca acgattccgg ctttagtggt tccctatcga cgagcaactg ctggaccgaa 540gccccaggcc agagtaacaa cgccggctgc ggtattgatg cgacttcctc tgccacgtac 600ggagatggat tcaacagcgc cggtggcggc atctacgcta tggaatggac aggcgactac 660attcaagtct ttgaattcac ccacgacagc gctccggctg atctcacttc tggtagccct 720·aacccaagta cctggggcga acctgcggct tactttgctg gtgactgcga tattgactct 780cactttaccg ccaaccagat cgtctttgat atcactttct gcggtgactg ggctggcaat 840gtttggagct caggtacctg ctccagcctg gctagtactt gcaatgacta cgtccagaac 900aacccttctg ccttttccga gacttattgg ctcatcaact ctctcaaggt ctactcaagc 960tag963其中，信号肽的碱基序列为“atgcgtccttcgactctcct tcaactggct gcgctcgccggcttgagcagtgct ”，所以编码成熟P -葡聚糖酶P_Bglul6A蛋白的核苷酸序列全长909bp，如SEQ IDN0. 5 所示caaacctaca ctttgtacga cgactaccca actgggatgg acttcttctc caagttcagc 60tttttcactg tatgggtgct cttccgcgat accgatccca ccaatggcta cgtcgattat 120gtcaatgaga acactgccga aagtgctgga ttgatatatg cgagtggcaa tgctacttat 180gttggtgttg attcttcaaa tgtagcctcc ggcagtggtc gtcagagcgt gcgtctgacc 240agcaccgctt cttacaccca tggcttgttc gttcttgatc tggctcacat gccaggttcc 300gtttgtggtt cttggcctgc cttctggacc gttggaagca actggccgaa caacggcgaa 360atcgatatca tcgaaggagt caatcagcaa agcgccaatg ccatgaccct gcacaccagc 420gagggctgca ccatcaacga ttccggcttt agtggttccc tatcgacgag caactgctgg 480accgaagccc caggccagag taacaacgcc ggctgcggta ttgatgcgac ttcctctgcc 540acgtacggag atggattcaa cagcgccggt ggcggcatct acgctatgga atggacaggc 600gactacattc aagtctttga attcacccac gacagcgctc cggctgatct cacttctggt 660agccctaacc caagtacctg gggcgaacct gcggcttact ttgctggtga ctgcgatatt 720gactctcact ttaccgccaa ccagatcgtc tttgatatca ctttctgcgg tgactgggct 780ggcaatgttt ggagctcagg tacctgctcc agcctggcta gtacttgcaa tgactacgtc 840cagaacaacc cttctgcctt ttccgagact tattggctca tcaactctct caaggtctac 900tcaagctag909本发明还提供了包含上述￠-葡聚糖酶基因p_bglul6A的重组载体，优选为pPIC9-p_bglul6A。将本发明的P -葡聚糖酶基因p_bglul6A插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将3 -葡聚糖酶基因插入到质粒PPIC9上的SnaB I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒。本发明还提供了包含上述￠-葡聚糖酶基因p_bglul6A的重组菌株，优选为毕赤酵母重组菌株。
本发明还提供了一种制备P -葡聚糖酶P-Bglul6A的方法，包括以下步骤I)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组P -葡聚糖酶P_Bglul6A的表达；以及3)回收并纯化所表达的￠-葡聚糖酶P_Bglul6A。其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或丝状真菌细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞Pichic pastoris,得到重组菌株。本发明还提供了上述￠-葡聚糖酶P-Bglul6A的应用，优选该酶在水解￠-葡聚糖以及其在饲料、食品工业领域的应用。本发明提供了一个新的￠-葡聚糖酶基因p-bglul6A，其编码的P -葡聚糖酶P_Bglul6A具有高比活性，作用pH范围广(pH3. 5-6. 0)，良好的PH稳定性和耐热性，可应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产￠-葡聚糖酶。
图I重组0 -葡聚糖酶P-Bglul6A的SDS-PAGE分析,M :低分子量蛋白质Marker ；I :纯化的￠-葡聚糖酶。图2 P -葡聚糖酶P_Bglul6A的最适pH。图3 P -葡聚糖酶P_Bglul6A的pH稳定性。图4P -葡聚糖酶P_Bglul6A作用的最适温度。图5 P -葡聚糖酶P_Bglul6A的热稳定性。本发明分离筛选出一种生产上述酸性P -葡聚糖酶P_Bglul6A的青霉WNKPenicillium sp.)，于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 5131。
具体实施例方式实验材料及一般实验方法I、菌株及载体大肠杆菌菌株(Escherichia coli) JM109、载体自全式金公司；毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)GS115及pPIC9质粒购自invitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂工具酶包括限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶购自TakaRa公司，DNA提取、纯化、凝胶回收试剂盒购自天根生化公司，RNA提取试剂盒购自Promega公司，逆转录试剂盒购自东洋纺公司(ReverTra Ace, T0Y0B0)。大麦葡聚糖、羧甲基纤维素钠、燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基Penicillium sp. WNl 产 P -葡聚糖酶诱导选择培养基0. 2% MgSO4 7H20，0. I %KH2PO4,0. 1% CuSO4 5H20，0. 1% CaCl2,0. 5%蛋白胨，1%玉米芯粉，1%麸皮，pH5. O。标准的分子操作技术如DNA提取、RNA提取、反转录、凝胶电泳、大肠杆菌转化、酵母转化均使用标准技术(Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3 版 2001) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual(1990)；invitrogen酵母操作手册)进行 。实施例I青霉Penicillium sp. WNl菌株的基因组DNA的分离本发明从云南锡矿的酸性废水中分离的真菌WN1。根据形态及ITS序列鉴定为Penicillium属，命名为WNl (Penicillium sp.)。该菌株于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 5131。将青霉WNl经马铃薯汁培养基培养后，接种于诱导培养基中((NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 lg/L, MgSO4 7H20 0. 5g/L, FeSO4 7H20 0. Olg/L, CaCl2 0. 2g/L,玉米芯粉 I %，麸皮1%，1.5%琼脂糖，pH5.0)平板上，30°C培养5 6d，测定其产￠-葡聚糖酶的活性。经测定该菌为高产￠-葡聚糖酶菌株。将马铃薯汁培养基培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，采用CTAB方法提取基因组DNA (Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版 2001))。实施例2青霉Penicillium sp. WNl P -葡聚糖酶编码基因的克隆根据糖苷水解酶第16家族P -葡聚糖酶的保守序列(CGTWPA和FCGDWAG)设计合成了简并引物 GH16F :TGCGGTAYNTGGCCNGC 和 GH16R :CCGGCCCANTBNCCRCARAA，其中Y = C/T, R = A/G, B = G/C/T, N = A/T/G/C以Penicillium sp. WNl基因组DNA为模板，GH16F和GH16R为引物进行PCR扩增。PCR 反应参数为95°C、5min ;94°C、30sec，49°C、30sec，72°C、lmin，30 个循环后；72°C、10min，4°C保温。琼脂糖电泳检测。得到的长约580bp的片段，经回收后与pEASY_T3载体相连并测序。得到保守区核苷酸序列588bp。为了得到编码基因全长序列，根据测序得到的保守区核苷酸序列，利用TAIL-PCR扩增保守区两侧的序列。TAIL-PCR特异引物序列见表I。表I. 0 -葡聚糖酶基因p_bglul6A TAIL-PCR特异性引物
引物
引物
权利要求
1.一种酸性￠-葡聚糖酶P_Bglul6A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2 所示。
2.—种酸性￠-葡聚糖酶基因p_bglul6A，其特征在于，编码权利要求I所述的￠-葡聚糖酶 P_Bglul6A。
3.根据权利要求2所述的酸性￠-葡聚糖酶基因p-bglul6A，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3、4或5所示。
4.包含权利要求2或3所述酸性P-葡聚糖酶基因p_bglul6A的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-p-bglul6A。
6.包含权利要求2或3所述P-葡聚糖酶基因p_bglul6A的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母。
8.一种制备酸性￠-葡聚糖酶P-Bglul6A的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组酸性￠-葡聚糖酶P_Bglul6A的表达；以及 3)回收并纯化所表达的酸性P-葡聚糖酶P_Bglul6A。
9.权利要求I所述酸性P-葡聚糖酶P_Bglul6A的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A及其基因和应用。本发明提供了一种新的酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A，其具有如SEQID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A作用pH范围广(pH3.5-6.0)，最适pH5.0，最适温度50-55℃，在酸性条件下具有良好的稳定性和耐热性，可应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产β-葡聚糖酶。
文档编号C12R1/80GK102978183SQ20111026259
公开日2013年3月20日 申请日期2011年9月6日 优先权日2011年9月6日
发明者张健康, 张王照, 朱世琴, 邵娜, 姜小伟, 董玲丽 申请人:北京卫诺恩生物科技有限公司