专利名称：一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和应用。
背景技术：
^ -葡聚糖是一类非淀粉性多糖(NSP)，是谷物类植物细胞壁的主要成分，在大麦、燕麦、小麦、水稻胚乳细胞壁中含量尤为丰富(Buliga et al. Carbohydr Res 1986,157 :139-156)。谷物胚乳细胞壁￠-葡聚糖是由1200个以上吡喃型D-葡萄糖残基以￠-1,4和1，3-糖苷键连接形成线型分子。￠-葡聚糖独特的分子结构使其能以高分子量的形式 溶于水，且溶液粘度很高，给工业生产带来诸多不便。如高分子量的大麦￠-葡聚糖可引起麦汁和啤酒粘度增加，致使麦汁过滤困难、得率降低，啤酒非生物性浑浊，影响啤酒的稳定性和质量。3 -葡聚糖在消化道中吸水膨胀黏连，使其成为限制麦类饲料营养成分有效利用的主要抗营养因子。^ -葡聚糖酶可以水解谷物中P -葡聚糖成为较小的聚合物，消除谷物类P -葡聚糖造成的负面影响，是饲料工业和啤酒行业中广泛使用的一种酶。根据酶作用底物糖苷键的类型和机制，可将￠-葡聚糖酶分为0-1，3 (4)-葡聚糖酶(EC 3. 2. 1.6)、￠-1,4-葡聚糖酶(纤维素酶，EC 3. 2. I. 4)、3-1，3-葡聚糖酶(昆布多糖酶，EC 3. 2. I. 39)^-1,3-1,4-葡聚糖酶(地衣多糖酶，EC 3. 2. I. 73)等(McCarthy et al. Int J Biol Macromol. 2003,33 :141-148 ；Boyce and Walsh. Appl Microbiol Biotechnol. 2007,76 :835-8412007)。￠-葡聚糖酶广泛的存在于植物和微生物中。微生物是葡聚糖酶的重要来源，具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点。现在人们主要从细菌如枯草芽孢杆菌或真菌如黑曲霉、木霉等微生物中提取3-葡聚糖酶。而天然菌株葡聚糖酶产量较低是限制其工业化生产的一个重要因素。1983年爱尔兰学者CantwelI和McConnelI首先从枯草芽孢杆菌中克隆到P _葡聚糖酶基因并建立了检测手段(Cantwell and McConnell, gene. 198323(2) :211-219) 0随后，人们从许多其他的微生物中克隆得到了 ￠-葡聚糖酶基因，并进行序列分析和异源表达，葡聚糖酶的表达量得到很大提高。但目前，挖掘分离高比活、性质优良的葡聚糖酶和葡聚糖酶基因，实现葡聚糖酶的高效表达，仍然是提高3 -葡聚糖酶产量、降低生产成本的关键。本发明的P -葡聚糖酶作用PH范围广，在pHl. 5-5. 5范围内具有80%以上的酶活，并且具有良好的pH稳定性和耐热性，可应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。其具有高比活性，其比活高于目前报道的￠-葡聚糖酶的比活，并在毕赤酵母中实现了高效表达，表达量高于30，000U/ml，应用于工业生产葡聚糖酶可大大降低生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种高比活、宽pH范围的P -葡聚糖酶R-BgluA。本发明的另一目的是提供编码上述高比活、宽pH范围的P -葡聚糖酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述高比活、宽pH范围的P -葡聚糖酶基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供制备上述高比活、宽pH范围的P -葡聚糖酶的方法。本发明的另一目的是提供上述高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶的应用。本发明分离筛选出一种生产上述高比活、宽pH范围的P -葡聚糖酶R-BgluA的米根霉Y-I (Rhizopus oryzae),于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 5132。 本发明提供了一种高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶R-BgluA，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I 所示MLKSVITSLL VANLLFTSSA QGffVLKKNYQ GSSFFDGFSF FTDADPTHGFVQYVDKSTAQ60SAGLISTQGG KVIMRADNTT VSANGRRSVR ITSNDAYSNS ALVLLDLEHMPVGCGTffPAF120WMVGPNWPNS GEIDIIENVN KATLNQVTLH TKQGCSFAGV SRTQTGKTLTDNCDVNAAGQ180PSNAGCGVQA TDANTYGDGL NNIKGGVYAT RMTASQGIQV WFFPRNNIPSDISSGNPNPS240AffPTPLASFP FQSGHCTIDY FNNLQIVFDL TFCGDffAGSV YGSSGCPSNCNDYVKNNPGA300FSNAYffSVNY VKVYQ315其中，该酶全长315个氨基酸和一个终止密码子，N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列 “MLKSVITSLLVANLLFTSSA”。因此，成熟的高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶R-BgluA的理论分子量为31. 9kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示QGffVLKKNYQ GSSFFDGFSF FTDADPTHGF VQYVDKSTAQ SAGLISTQGGKVIMRADNTT60VSANGRRSVR ITSNDAYSNS ALVLLDLEHM PVGCGTffPAFWMVGPNWPNS GEIDIIENVN120KATLNQVTLH TKQGCSFAGV SRTQTGKTLT DNCDVNAAGQPSNAGCGVQA TDANTYGDGL180NNIKGGVYAT RMTASQGIQV WFFPRNNIPS DISSGNPNPS AffPTPLASFPFQSGHCTIDY240FNNLQIVFDL TFCGDffAGSV YGSSGCPSNC NDYVKNNPGA FSNAYffSVNYVKVYQ295本发明提供了编码上述高比活、宽pH范围的@ -葡聚糖酶的基因R-bgluA。该酶的全基因序列如SEQ ID NO. 3所不
atgttgaaat ctgtcattac atctctgttg gtcgcaaact tactgttcacttctagcgca60caaggatggg tgttgaagaa aaattaccaa ggctctagtt tctttgatggattcagtttc120tttactgatg ctgaccctac tcatggcttt gttcaatatg tagacaagtcaactgcacaa180tctgctggct tgatctctac tcaaggagga aaggtcatca tgagagccgataataccaca240gttagtgcta acggcagacg ctctgtcaga attacttcca atgacgcttattccaactct300gcacttgtct tgcttgacct tgaacacatg ccggtcggat gcggtacttggcccgctttt360tggatggtcg gccctaactg gcccaacagc ggtgaaattg atgtaagtatttcgtgcaaa420 ttgcctggga attaagaatt agtctaacat aattatagat tatcgaaaatgtaaacaagg480ctactctcaa ccaagttact ttacatacca aacaaggatg tagctttgctggtgtttccc540gcacacagac tggaaagact ttgactgata actgtgacgt caatgctgctggccaaccaa600gcaatgctgg ttgtggcgtt caggctacgg acgcaaacac ctatggtgatggtttgaaca660acattaaggg tggcgtttat gctactagaa tgaccgcaag tcaaggtatccaagtttggt720tcttccctag aaacaacatc ccatctgata tctccagtgg taatcctaatccatccgcat780ggccaactcc tcttgcttcc ttcccattcc aatctggcca ttgtaccattgactacttta840acaaccttca aattgtattt gatttgacct tctgtggtga ttgggctggctccgtttatg900gttcttctgg ttgcccttcc aactgtaatg actatgttaa gaacaacccaggtgcattca960gtaacgctta ttggtctgtc aattacgtta aagtctacca gtaa1004本发明通过PCR的方法分离克隆了这一高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA，DNA全序列分析结果表明，P -葡聚糖酶R-BgluA的结构基因全长1，004bp，含有I个内含子，403-459bp为其内含子序列，cDNA长948bp，其cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示atgttgaaat ctgtcattac atctctgttg gtcgcaaact tactgttcacttctagcgca60caaggatggg tgttgaagaa aaattaccaa ggctctagtt tctttgatggattcagtttc120tttactgatg ctgaccctac tcatggcttt gttcaatatg tagacaagtcaactgcacaa180tctgctggct tgatctctac tcaaggagga aaggtcatca tgagagccgataataccaca240gttagtgcta acggcagacg ctctgtcaga attacttcca atgacgcttattccaactct300gcacttgtct tgcttgacct tgaacacatg ccggtcggat gcggtacttggcccgctttt360tggatggtcg gccctaactg gcccaacagc ggtgaaattg atattatcgaaaatgtaaac420aaggctactc tcaaccaagt tactttacat accaaacaag gatgtagctttgctggtgtt480tcccgcacac agactggaaa gactttgact gataactgtg acgtcaatgctgctggccaa540ccaagcaatg ctggttgtgg cgttcaggct acggacgcaa acacctatggtgatggtttg600aacaacatta agggtggcgt ttatgctact agaatgaccg caagtcaaggtatccaagtt660tggttcttcc ctagaaacaa catcccatct gatatctcca gtggtaatcctaatccatcc720gcatggccaa ctcctcttgc ttccttccca ttccaatctg gccattgtaccattgactac780tttaacaacc ttcaaattgt atttgatttg accttctgtg gtgattgggctggctccgtt840tatggttctt ctggttgccc ttccaactgt aatgactatg ttaagaacaacccaggtgca900ttcagtaacg cttattggtc tgtcaattac gttaaagtct accagtaa948其中，信号妝的减基序列为“atgttgaaat ctgtcattac atctctgttg gtcgcaaacttactgttcacttctagcgca”。所以编码成熟的高比活、宽pH范围的P _葡聚糖酶R-BgluA的核苷酸序列全长888bp，如SEQ ID NO. 5所示
caaggatggg tgttgaagaa aaattaccaa ggctctagtt tctttgatgg attcagtttc 60tttactgatg ctgaccctac tcatggcttt gttcaatatg tagacaagtc aactgcacaa 120tctgctggct tgatctctac tcaaggagga aaggtcatca tgagagccga taataccaca 180gttagtgcta acggcagacg ctctgtcaga attacttcca atgacgctta ttccaactct 240gcacttgtct tgcttgacct tgaacacatg ccggtcggat gcggtacttg gcccgctttt 300tggatggtcg gccctaactg gcccaacagc ggtgaaattg atattatcga aaatgtaaac 360aaggctactc tcaaccaagt tactttacat accaaacaag gatgtagctt tgctggtgtt 420tcccgcacac agactggaaa gactttgact gataactgtg acgtcaatgc tgctggccaa 480ccaagcaatg ctggttgtgg cgttcaggct acggacgcaa acacctatgg tgatggtttg 540aacaacatta agggtggcgt ttatgctact agaatgaccg caagtcaagg tatccaagtt 600tggttcttcc ctagaaacaa catcccatct gatatctcca gtggtaatcc taatccatcc 660gcatggccaa ctcctcttgc ttccttccca ttccaatctg gccattgtac cattgactac 720tttaacaacc ttcaaattgt atttgatttg accttctgtg gtgattgggc tggctccgtt 780tatggttctt ctggttgccc ttccaactgt aatgactatg ttaagaacaa cccaggtgca 840ttcagtaacg cttattggtc tgtcaattac gttaaagtct accagtaa888本发明还提供了包含上述高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶R-BgluA的重组载体，优选为pPIC9-R-bgluA，pPIC9k-R-bgluA。将本发明的P -葡聚糖酶基因R-bgluA插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将￠-葡聚糖酶基因插入到质粒pPIC9或pPIC9k上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒。本发明还提供了包含上述高比活、宽pH范围的P -葡聚糖酶基因R-bgluA的重组菌株，优选为毕赤酵母重组菌株。本发明还提供了一种制备高比活、宽pH范围的P -葡聚糖酶R-BgluA的方法，包括以下步骤I)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组P -葡聚糖酶R-BgluA的表达；以及3)回收并纯化所表达的P -葡聚糖酶R-BgluA。其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或丝状真菌细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris),得到重组菌株。本发明还提供了上述高比活、宽pH范围的P -葡聚糖酶R-BgluA的应用，优选该酶在水解￠-葡聚糖以及其在饲料、食品工业领域的应用。本发明提供了一个新的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA，其编码的￠-葡聚糖酶R-BgluA具有高比活性，作用pH范围广(pHI. 5-6. 5)，并且具有良好的pH稳定性和耐热性，可应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产P-葡聚糖酶 。
图I重组P -葡聚糖酶R-BgluA的SDS-PAGE分析，I :低分子量蛋白质Marker ；2 毕赤酵母表达的0 -葡聚糖酶R-BgluA发酵上清3 :纯化的P -葡聚糖酶R-BgluA。
图2 ￠-葡聚糖酶R-BgluA的最适pH。图3 葡聚糖酶R-BgluA的pH稳定性。图4 ￠-葡聚糖酶R-BgluA作用的最适温度。图5 葡聚糖酶R-BgluA的热稳定性。本发明分离筛选出一种生产上述高比活、宽pH范围的P -葡聚糖酶R-BgluA的米根霉Y-I (Rhizopus oryzae),于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 5132。
具体实施方式
实验材料及一般实验方法I、菌株及载体大肠杆菌菌株(Escherichia coli) JM109、载体自全式金公司；毕赤酵母菌株(Pichia pastoris) GS115, pPIC9及pPIC9k质粒购自invitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂工具酶包括限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶购自TakaRa公司，DNA提取、纯化、凝胶回收试剂盒购自天根生化公司，RNA提取试剂盒购自Promega公司，逆转录试剂盒购自东洋纺公司(ReverTra Ace, T0Y0B0)。大麦葡聚糖、羧甲基纤维素钠、燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基Rhizopus oryzae WNl 产 P -葡聚糖酶诱导选择培养基0. 2% MgSO4 WH20,0. IKH2PO4,0. 1% CuSO4 5H20，0. 1% CaCl2,0. 5%蛋白胨，1%玉米芯粉，1%麸皮，pH5. O。标准的分子操作技术如DNA提取、RNA提取、反转录、凝胶电泳、大肠杆菌转化、酵母转化均使用标准技术(Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3 版 2001) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual(1990)；invitrogen酵母操作手册)进行。实施例I米根霉Rhizopus oryzae Y-I菌株的基因组DNA的分离米曲霉Rhizopus oryzae Y_1分离于云南森林土，生长pH 5.0,最适生长温度为30 °C o根据形态及ITS序列鉴定为Rhizopus属，命名为Y-I (Rhizopus oryzae)。该菌种保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为=CGMCC No. 5132，保藏日期:2011年8月11曰。将米曲霉Yl经马铃薯汁培养基培养后，接种于诱导培养基中(0. 2% MgSO4 *7H20,
0.I % KH2PO4,0. I % CuSO4 5H20，0. I % CaCl2,0. 5 % 蛋白胨，I % 玉米芯粉，I % 麸皮，pH
5.0)，30°C培养3 4d，测定其产纤维素半纤维素酶的活性。经测定该菌为高产葡聚糖酶菌株。将马铃薯汁培养基培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，采用CTAB方法提取基因组DNA (Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版 2001))。
实施例2米根霉Rhizopus oryzae Y_1的P _葡聚糖酶编码基因的克隆根据糖苷水解酶第16家族P -葡聚糖酶的保守序列(CGTWPA和FCGDWAG)设计合成了简并引物 GH16F :TGCGGTAYNTGGCCNGC 和 GH16R :CCGGCCCANTBNCCRCARAA，其中Y = C/T, R = A/G, B = G/C/T, N = A/T/G/C。以Rhizopus oryzae Y-1基因组DNA为模板，GH16F和GH16R为引物进行PCR扩增。PCR 反应参数为95°C、5min ;94°C、30sec，49°C、30sec，72°C、lmin，30 个循环后；72°C、10min，4°C保温。琼脂糖电泳检测。得到的长约550bp的片段，经回收后与pEASY_T3载体相连并测序，得到保守区核苷酸序列551bp。为了得到编码基因全长序列，根据测序得到的保守区核苷酸序列，利用TAIL-PCR扩增保守区两侧的序列。TAIL-PCR特异引物序列见表I。表I. P -葡聚糖酶基因R-bgluA TAIL-PCR特异性引物
权利要求
1.一种高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶R-BgluA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO. I 或 SEQ ID NO. 2 所示。
2.一种高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA，其特征在于，编码权利要求I所述的高比活、宽PH范围的P -葡聚糖酶R-BgluA。
3.根据权利要求2所述的高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3、4或5所示。
4.包含权利要求2或3所述高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-R-bgluA或pPIC9k-R-bgIuA o
6.包含权利要求2或3所述高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶基因R-bgluA的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。
8.一种制备高比活、宽pH范围的￠-葡聚糖酶R-BgluA的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组P-葡聚糖酶R-BgluA的表达；以及 3)回收并纯化所表达的P-葡聚糖酶R-BgluA。
9.权利要求I所述高比活、宽pH范围的P-葡聚糖酶R-BgluA的应用。
10.米根霉Rhizopusoryzae Y-1，其特征在于，其保藏号为CGMCC No. 5132。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和应用。本发明提供了一种新的高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的β-葡聚糖酶R-BgluA具有高比活性，作用pH范围广(pH1.5-6.5)，并且具有良好的pH稳定性和耐热性，可应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产β-葡聚糖酶。
文档编号C12N15/81GK102978184SQ201110262729
公开日2013年3月20日 申请日期2011年9月6日 优先权日2011年9月6日
发明者张王照, 张健康, 朱世琴, 董玲丽, 邵娜, 姜小伟 申请人:北京卫诺恩生物科技有限公司