培养2-3天。
[0029]D.筛选
将愈伤转移至筛选培养基(N6D + 50 mg/L潮霉素B + 250 mg/L头孢霉素)上，28°C光培养。每15?20天可以更换一次培养基，筛选时间不得少于45天。
[0030]E.分化
将经过筛选新长出来的愈伤转移至分化培养基(MS+2 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA +2 mg/L KT + 0.2 mg/L IAA + 50 mg/L 潮霉素 + 250 mg/L 头孢霉素)，28°C 16 小时光培养。在进行分化培养前，可以先将愈伤暗培养几天以作为预分化。定期更换培养基。
[0031]F.生根
将分化出来的转基因苗Olcm高)，剥除多余的愈伤组织，并剪去根(留约0.5cm)，移至1/2 MS培养基中生根。28°C光培养16小时。
[0032]G.炼苗与移栽
生根结束后，可以除去生根培养基后，将苗泡于水中数日进行炼苗，然后移栽入土中生长。
[0033]实施例6⑶S组织染色
取Tl代阳性转基因水稻的不同组织，浸于⑶S染液[0.2 mo I / L Na2HP04/NaH2P04,0.1 mo I / L K3Fe (CN)6A4Fe (CN) 6,0.1% X_Gluc，0.1% Triton X-100]中，抽气后于 37°C染色6小时，无水乙醇脱色处理两天，期间换液数次，最后用70%乙醇浸泡保存。在体视显微镜(Leica S8AP0)下观察并拍照。
[0034]其中，SEQID N0.1 说明:
(i)序列特征:长2224bp，线性核苷酸 (?)分子类型:核酸
(iii)序列及序列标记:下划线为上下游引物序列
(iv)加黑ATG为基因起始密码子L
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2151TCTTGTTAGTTCTTCCCTAGCTAGCTATTTAAGCTGGTATATGCGATTCC 2200
2201ATTTGAGAGCAATTCTGCGAGACGatg2227。
【主权项】
1.一种干旱诱导的花粉特异性启动子，其特征在于是从水稻的OsCLCn基因起始密码子上游克隆到的约2224bp大小的DNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。2.一种利用权利要求1所述的启动子构建的基因工程载体。3.如权利要求1所述的启动子作为花粉粒特异型启动子在基因工程中的应用，该启动子能够驱动目的基因在雄蕊发育9-12期的花粉中特异性表达。4.如权利要求1所述的启动子作为雄蕊发育早期花药中干旱诱导型启动子的应用，该启动子能在干旱胁迫下驱动目的基因表达于发育中的花粉粒中。
【专利摘要】本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种水稻花粉特异性启动子及其应用。本发明是水稻<i>OsCLO7</i>基因的启动子序列如SEQIDNO.1所示。该启动子活性受花药发育过程及干旱胁迫影响。定量PCR检测结果显示：<i>OsCLO7</i>主要在水稻穗中表达，更明确地是在穗组织的雄蕊中表达；随着发育过程推进表达增强；幼穗发育前期受干旱胁迫诱导表达。该启动子驱动的GUS报告基因在水稻减数分裂后不同发育时期的花药中表达，更明确地是在花药的花粉粒中表达；穗发育前期GUS活性受干旱诱导，且仅限于花粉粒。本发明中的启动子可被用于构建驱动外源基因在花粉粒中特异性表达的转基因载体，在农业生产上均具有重要的应用价值。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/82
【公开号】CN105624157
【申请号】CN201410618726
【发明人】葛晓春, 马红, 黄蔚, 姚玲娅
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年11月6日