为SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列以及-35区的SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列 突变为SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列。
[0054] TATTAT(SEQ ID NO: 10)。
[0055] TATAAT(SEQ ID NO: 11)。
[0056] TTGAAA(SEQ ID NO: 12)。
[0057] TTGACA(SEQ ID NO: 13)。
[0058] 杂合启动子Pg2,是由来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THY_7(于2014年3 月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址是：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，保藏登记号为CGMCC NO. 8906)中分子伴侣GroEL的核心启动 子区与大肠杆菌阻遏蛋白基因 IacO操纵子组合构成的杂合启动子。
[0059] 枯草芽孢杆菌B. subtilis THY-7分子伴侣GroEL的核心启动子区具有SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，被称为PgroE。
[0060] 大肠杆菌阻遏蛋白基因 IacO操纵子，具有SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列。
[0061] AATTGTGAGCGGATAACAATT(SEQ ID N0:14)。
[0062] 构建（制备）枯草芽孢杆菌诱导型强启动子Pg3的方法
[0063] 在本发明的另一方面，本发明提出了一种枯草芽孢杆菌诱导型强启动子Pg3的构 建方法。下面结合图1~3对构建枯草芽孢杆菌诱导型强启动子Pg3的步骤进行详细描 述：
[0064] (1)从枯草芽孢杆菌B. subtilis THY-7中克隆分子伴侣基因 groEL的核心启动子 PgroE(其序列为SEQ ID NO :9所示），PgroE的凝胶电泳鉴定结果如图1所示。
[0065] (2)采用PCR方法，在下游引物中添加大肠杆菌阻遏蛋白基因 IacO操纵子（其序 列为SEQ ID NO: 14所示），将IacO操纵子引入PgroE的3'端，扩增获得能够被IPTG诱导 的人工启动子Pg2(其序列为SEQ ID N0:4所示）。构建示意图如图2所示。
[0066] (3)将Pg2进行双定点突变，将-10区的SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列突变为 SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列以及-35区的SEQ ID N0:12所示的核苷酸序列突变为SEQ ID N0:13所示的核苷酸酸序列，从而获得强诱导型新启动子Pg3(其序列为SEQ ID N0:1所 示）。突变位点示意图如图3所示。
[0067] 在枯草芽孢杆菌中高表达目标蛋白的方法
[0068] 在本发明的再一方面，本发明提出了一种在枯草芽孢杆菌中高表达目标蛋白的方 法。
[0069] 其一，本发明提出了一种使用诱导型强启动子Pg3,在枯草芽孢杆菌中高表达外源 酶β-半乳糖苷酶的方法。下面结合图4~6对上述方法进行详细描述：
[0070] (1)以大肠杆菌BL21基因组为模板，克隆β-半乳糖苷酶基因 IacZ(其序列为SEQ ID Ν0:3所示）。经BamH I+Sma I双酶切后连接至质粒ρΗΤ08,以便获得质粒pTS1112。构 建过程示意图如图4所示。
[0071] (2)在扩增启动子Pg3和Pg2的引物两端分别添加了 Kpn I与BamH I酶切位点 (引物序列如SEQ ID NO :7~8所示），将启动子插入质粒pTS1112,获得高表达IacZ的重 组质粒。构建过程示意图如图5所示。
[0072] (3)将以Pg2和Pg3为启动子的表达β-半乳糖苷酶的重组质粒通过电穿孔转 化进入野生型枯草芽孢杆菌Β. subtilis ΤΗΥ-7的感受态细胞（处于最适摄取和容纳外来 DNA的生理状态的细胞），分别获得重组菌株B. subtilis THY-7/Pg2-lacZ和B. subtilis THY-7/Pg3-lacZ〇
[0073] (4)对两株重组菌株进行摇瓶发酵培养，以IPTG诱导表达β -半乳糖苷酶，测定 β -半乳糖苷酶活性，从而验证Pg3启动子的诱导型强启动能力，结果如图6所示。重组菌 株B. subtilis THY-7/Pg3-lacZ的β -半乳糖苷酶活性，在12-36小时期间，达到THY-7/ Pg2-lacZ 的 3. 6 ~5. 5 倍。
[0074] 其二，本发明提出了一种使用诱导型强启动子Pg3替换枯草芽孢杆菌表面活性素 合成酶的天然启动子PsrfA，从而高效合成表面活性素的方法。下面将结合图7~8对上述 方法进行详细描述：
[0075] (1)从枯草芽孢杆菌B. subtilis THY-7基因组中扩增片段长度为5kb的表面活性 素合成酶基因片段SrfA(其序列为SEQ ID N0:2所示）。
[0076] (2)将srfA基因片段采用BamH I和Xho I双酶切，插入质粒pHT08的启动子下 游。进一步采用BamH I和Kpn I双酶切，把构建的Pg3诱导型强启动子插入到表面活性素 合成酶基因片段的5'端。筛选获得重组质粒Pg3-srfA，构建过程示意图如图7所示。
[0077] (3)将质粒Pg3_srfA导入枯草芽孢杆菌B. subtilis THY-7的感受态细胞，采用氯 霉素抗性平板筛选启动子Pg3与表面活性素合成酶天然启动子PsrfA发生单交换同源重组 的重组菌株B. subtilis THY-7/Pg3-srfA，并采用菌落PCR验证所获得的重组菌株的启动 子的替换正确性。
[0078] (4)对重组菌株B. subtilis THY-7/Pg3-srfA进行摇瓶发酵培养，加入I. 25mM IPTG诱导Pg3启动子高效合成表面活性素。重组菌株B. subtilis THY-7/Pg3-srfA与野生 菌株B. subtilis THY-7的对比培养，并分别测量表面活性素产量。测量结果表明，重组菌 株B. subtilis THY-7/Pg3-srfA的表面活性素产量在摇瓶48h时达到9. 74g/L，是野生菌株 B. subtilis THY-7的17. 7倍。测量结果如图8所示。
[0079] 含有启动子Pg3的表达载体、重组菌株
[0080] 在本发明的最后一个方面，本发明提出了一种含有所述启动子Pg3的表达载体和 一种含有所述启动子Pg3的重组菌株。
[0081] 表达载体的宿主菌为枯草芽孢杆菌或其它芽孢杆菌，重组菌株为枯草芽孢杆菌或 其它芽孢杆菌。
[0082] 上述重组菌株的构建（制备）方法，是采用电穿孔转化法（Sambrook J 等.Molecular Cloning:A Laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)将载体导入受体菌，如果是以高表达内源/外源目的基因 为目标，则不进行同源交换重组，直接筛选得到所需要的重组菌株。如果是以染色体上的启 动子替换为目标，则含有内源目的基因的载体导入受体菌进行同源单交换重组后，进而筛 选得到所需要的重组菌株。此处的筛选是基于表达载体上所携带的抗性筛选基因，任选地， 所述抗性筛选基因包括氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、红霉素抗性基因、新霉素抗 性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因的至少之一。
[0083] 综上，根据本发明的实施例，本发明所提出的一种枯草芽孢杆菌强诱导型启动子 Pg3,可在IPTG诱导下强启动目标蛋白基因的表达。在本发明的一个实施例中，发明人采用 启动子Pg3诱导表达的β-半乳糖苷酶，酶活可以达到-35区和-10区核心启动子未突变 的启动子Pg2的2倍。在本发明的另一个实施例中，发明人将启动子Pg3经过同源单交换 重组，成功替换了表面活性素合成酶天然启动子PsrfA，获得的重组枯草芽孢杆菌合成表面 活性素的摇瓶产量达到9. 74g/L，是野生菌株B. subtilis THY-7的17. 7倍。本发明所提出 枯草芽孢杆菌强诱导型启动子Pg3及其在枯草芽孢杆菌高表达目标蛋白中的应用和其在 构建（制备）表面活性素高产菌株中的应用，具有重要的价值和良好的工业应用前景。
[0084] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的 实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条 件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0085] 实施例1设计与构建枯草芽孢杆菌诱导型强启动子Pg3
[0086] 以枯草芽孢杆菌Β· subtilis THY-7基因组DNA为模板，使用Pyrobest高保真聚 合酶（购自Takara公司）扩增分子伴侣GroEL的核心启动子序列PgroE(序列如SEQ ID NO: 9所示），所用引物为PgroEF与PgroER (序列如SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 15所示）。
[0087] CGGGATCCCCGTGATGGTGATGGTGATG(SEQ ID N0:15)。
[0088] 扩增条件为：94 °C，5min ;94 °C，30s，52 °C，30s，72 °C，lmin，35 个循环；72 °C， lOmin。最后对PCR扩增产物切胶回收，测序比对回收产物与目标序列的一致性，比对序列 一致的回收产物即为所要获得的PgroE产物。
[0089] 在下游引物PgroER(如SEQ ID NO: 15所示序列）中添加大肠杆菌阻遏蛋白基因 lac0操纵子（序列如SEQIDN0:14所示），得到引物Pg2R(序列如SEQIDN0:8所示）。 以PgroE为模板，使用引物PgroEF与Pg2R进行PCR扩增，从而将IacO操纵子引入PgroE 的 3' 端。PCR 扩增条件为：94°C，5min ;94°(：，3〇8,52°(：，3〇8,72°(：，11^11，35个循环；72°(：， lOmin。最后对扩增产物进行切胶回收，测序比对回收产物序列与目标序列的一致性，比对 序列一致的回收产物即为所要获得的人工启动子Pg2(序列如SEQ ID N0:4所示），启动子 Pg2能够被IPTG诱导。
[0090] 通过拼接PCR对Pg2进行点突变，从而进一步提高Pg2的转录活性。将突变位点 设计在引物PMF及PMR(序列如SEQ ID N0:5及SEQ ID N0:6所示）的5'端。以Pg2为模 板，PgroEF/PMR以及PMF/Pg2R为引物，使用Pyrobest高保真聚合酶分别进行第一轮扩增。 扩增条件为：94°C，5min ;94°C，30s，52°C，30s，72°C，lmin，35 个循环；72°C，lOmin。将第一 轮PCR扩增产物混合稀释后作为模板，Pgr〇EF/Pg2R为引物进行第二轮扩增，扩增条件与第 一轮相同。扩增产物经Kpn I+BamH I双酶切得到突变后的启动子（序列如SEQ ID NO: 1 所示），将其命名为Pg3。
[0091] 实施例2构建启动子Pg3调控的高表达β -半乳糖苷酶的重组菌株
[0092] 所述β -半乳糖苷酶基因 IacZ来自大肠杆菌BL21 (购自天根生化科技（北京） 有限公司）。以BL21基因组DNA为模板，使用引物lacZF/lacZR(序列如SEQ ID Ν0:16