Gene Answer) 提取阳性克隆质粒，然后将质粒酶送至华大基因测序得到三条长度分别为450bp、700bp及 IlOObp的序列，对这些序列进行拼接，最终得到长度1254bp的序列，该基因具有1047bp的 开放阅读框，编码349个氨基酸。以bHLH93全长cDNA编码的蛋白质序列在NCBI数据库中进 行Blast比对分析，发现茄科植物番前、马铃薯bHLH93的序列相似性分别为80%和76%， 与模式植物拟南芥、水稻^11^93的相似性分别为69%和75%，将该基因命名为财1^1^93。
[0046] 三、TRV2-NtbHLH93 载体构建
[0047] 构建TRV2-NtbHLH93载体：所用引物为NtbHLH93-VIGS上游引物如SEQ ID NO :2 所示，下游引物如SEQ ID NO :3所示。分别在两条引物上设计Nco I和Sac I酶切位点和 相应的保护碱基，以实施例2中测序正确的NtbHLH93-T质粒为模板进行扩增，对回收纯化 的PCR产物和TRV2病毒空载体使用Nco I和Sac I进行酶切，酶切后的PCR片段和TRV2 病毒空载体载体连接，转化大肠杆菌DH5a。菌落PCR鉴定阳性克隆，提取质粒，对得到的质 粒进行酶切和测序验证。
[0048] 四、农杆菌介导的病毒侵染
[0049] (1)农杆菌感受态制备：挑取单菌落农杆菌GV3101在2ml LB (含20mg/mLRif)中 28°C培养过夜，取生长良好的菌液2ml (含25mg/L Rif)接种于50mlLB液体培养基中，28°C 振荡培养至0D600约等于0. 5左右；将菌液转移至50ml离心管，放置冰上30分钟，然后离 心收集菌体（5000rpm/4°C，5分钟）；用IOmlO. 15M预冷的氯化钠溶液轻悬菌体，离心收集 菌体（5000rpm/4°C，5分钟，）；弃去上清，加入20ml预冷的20mM氯化钙溶液悬浮菌体，将制 好的感受态细胞以100 μ 1/管分装，在液氮中速冻后保存在_80°C备用。
[0050] (2)质粒转化农杆菌：分别取1 μ 1TRV1、TRV2和TRV2-NtbHLH93质粒，加入含 100 μ 1的农杆菌感受态的离心管中，冰上放置30分钟；后转入液氮速冻1分钟，然后37°C 温育5分钟；加入1mlLB液体培养基，28°C震荡培养3小时；5000rpm离心1分钟，弃去上 清，加入200 μ I LB液体培养基，重悬沉淀；取200 μ 1重悬菌液均匀地涂于含20mg/L Rif 和50mg/L卡那霉素（Kan)的LB固体平板上，28 °C培养2-3天；经菌落PCR鉴定无误后保存 菌种。
[0051] (3)分别挑取步骤（2)中保存的TRVUTRV2和TRV2-NtbHLH93菌落接种至2ml LB 培养基（50mg/mlKan，05mg/ml Rif)，28°C过夜活化。取生长良好的菌液2ml接种于同样 的50ml LB培养基中，再加入IOmM 2-N-吗啉基乙磺酸（MES)和20 μ M乙酰丁香酮（AS)， 28°C过夜培养。低速离心菌液后，用侵染缓冲液（IOmM MgCl2, IOmM MES，200 μ M AS)重悬菌 体。使用0D600波长下调整OD值至1.0,室温静置3h后接种。空白对照注射侵染缓冲液， TRV1&TRV2(TRV)作为阴性对照，TRVl&TRV2-NtbHLH93为实验组，各菌液按照1:1的比例混 合，用无针头的无菌注射器注入烟草的下部叶位叶片中。
[0052] 五、NtbHLH93基因沉默效果检测
[0053] (1)表型观察：病毒载体接种本氏烟草叶片四周后，实验组本氏烟新生叶片和茎 出现明显的白化症状，而且植株明显矮化（图1)。
[0054] (2)病毒载体接种本氏烟草叶片后4周，提取烟草叶片的RNA并反转录成cDNA， QPCR分析NtbHLH93的沉默效果（相对于未接种的烟草对照和接种带有TRV1&TRV2 空病毒载体的烟草）。NtbHLH93沉默效果检测用引物为：上游引物NtbHLH93-F : 5' -TTACTGGGAAATTACAAAGAGC-3' ；下游引物 NtbHLH93-R :5' -ACTTGTGGTCGATTGTGGGC-3'。 QPCR实验结果表明，叶片中NtbHLH93的表达量明显降低（图2)。
[0055] (3)采用GC-MS分析检测转基因烟草甾醇代谢物的变化，数据真实准确的 反应烟草叶片中胆留醇、菜油留醇、豆留醇、β-谷留醇等的变化。分析条件：称取烟 叶冻干样50mg，加正己烧I. 5ml，50ul内标，混勾，抽提；超声20min，离心12000rpm， lOmin。上清转移到尖底玻璃瓶，氮气吹干；沉淀加80 %甲醇、20 % KOH溶液I. 2ml， 70°C 30min ;离心12000rpm，lOmin，取上清转移至玻璃瓶，加正己烧L Oml，震荡、静置； 取上清，加饱和NaCl 1.0 ml，取上清为溶液二，溶液一、二合并，吹干；加氯仿0. 5ml，取 IOOul吹干加50ul MSTFA，37°C，50min ;取液体进行GC/MS分析。气质联用条件：色谱柱 DB-5MS(30mx0.25mmx0.25ym);进样量 Ι.ΟμΙ ;分流比 10:1 ;进样口温度 280°C ;载气 He ; 流速 lml/min ;升温程序 60°C 3min，15°C /min 升至 210°C，0. 8°C /min 升至 220°C，15°C / min升至310°C保持20min ;质谱条件：离子源温度230°C ;四级杆温度150°C ;EI源；采集模 式：全扫描（Scan)与选择离子检测（SIM)同时采集。
[0056] 表2不同类型甾醇含量
[0058] 结果分析：如表2所示，对照植株和转基因植株相比胆固醇、菜籽留醇、菜油甾醇、 谷留醇的含量变化差异不明显（P〈〇. 05)，其中豆留醇的含量较对照相比下降了 22%， NtbHLH93基因 RNAi植株总甾醇的含量下降约18%。证明利用VIGS技术将NtbHLH93基因 沉默掉之后烟草叶片中豆甾醇和总甾醇的含量明显降低。
【主权项】
1. 一种烟草甾醇合成相关转录因子bHLH93基因，其特征在于：bHLH93基因的核苷酸序 列如SEQIDNO:1所示。2. 如权利要求1所述的烟草留醇合成相关转录因子bHLH93基因，其特征在于：所述基 因是通过同源克隆的方法得到的。3. -种烟草留醇合成相关转录因子bHLH93基因在调控烟草留醇含量中的应用。4. 如权利要求3所述的烟草留醇合成相关转录因子bHLH93基因在调控烟草留醇含量 中的应用，其特征在于：基于bHLH93基因序列，根据干扰载体引物设计原则设计引物，构建 烟草bHLH93基因干扰载体，并通过VIGS实验鉴定该转录因子的功能。5. 如权利要求3所述的烟草留醇合成相关转录因子bHLH93基因在调控烟草留醇含 量中的应用，其特征在于：所述烟草bHLH93基因干扰载体为TRV2-bHLH93,是由酶切后的 bHLH93基因PCR片段和TRV2病毒空载体连接、转化，并测序验证而得。6. 如权利要求4或5所述的烟草留醇合成相关转录因子bHLH93基因在调控烟草甾醇 含量中的应用，其特征在于：所述PCR所用引物为： bHLH93-VIGS上游引物如SEQIDNO:2所示； bHLH93-VIGS下游引物如SEQIDNO:3所示。7. 如权利要求4或5所述的烟草留醇合成相关转录因子bHLH93基因在调控烟草甾醇 含量中的应用，其特征在于：所述酶为两种限制性内切酶NcoI和SacI。8. 如权利要求4或5所述的烟草留醇合成相关转录因子bHLH93基因在调控烟草甾醇 含量中的应用，其特征在于：所述VIGS实验是通过农杆菌介导的病毒侵染实现。
【专利摘要】本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种烟草甾醇合成相关转录因子bHLH93基因及应用。bHLH93基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。本发明所述的基因NtbHLH93被沉默后，烟草叶片中甾醇特别是豆甾醇的含量明显降低，其含量的降低，可作为烟草甾醇调控领域的应用。
【IPC分类】C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00
【公开号】CN105400794
【申请号】CN201511017917
【发明人】武明珠, 陈千思, 王中, 李锋, 魏攀, 谢小东, 刘萍萍, 郑庆霞, 杨军, 林福呈
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月30日