. EMBO J. 1987,6:3901-3907.)，将 TaNACs置于35S启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因TaNACs克隆到强启动子35S 的下游，获得表达载体地1220: TaNACs (图1)。经测序验证，表明载体构建成功。
[0022] 实施例3利用瞬间表达方法将TaNACs基因转入小麦叶片
[002引瞬间表达方法是一种可靠且快速鉴定基因功能的方法（Schweizer,化korny et al.A Transient Assay System for the Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat Mole州lar Plant-Microbe Interactions. 1999, 12:647-654.)。本研究 利用瞬间表达方法，将质粒DM包裹到金属微粒外层，借助基因枪将金属微粒和基因轰击 到小麦叶片的表皮细胞，然后统计轰击TaNACs细胞的白粉菌吸器指数与未轰击TaNACs细 胞的白粉菌吸器指数，明确目标基因是否具有白粉病抗病功能。
[0024] 载体DNA与金属微粒包裹的程序如下：
[0025] 制备鹤粉；称取30mg的鹤粉于1. 5ml eppendo计管中，加入1ml 70%酒精，祸旋 3 - 5min后静置15min，使鹤粉完全沉淀。1200化pm离屯、Imin后弃上清。加入1ml d地2〇 水，祸旋混匀后，离屯、弃上清（重复S次）。最后加入500 yl 50%甘油祸旋混匀，W备用。
[0026] 包裹子弹；吸取5 y 1祸旋均匀的鹤粉于1. 5ml的巧pendo计管中，加入5 y 1质粒 DNA(总量应为lug)。边祸旋边向巧pendo计管内滴加50yl 2. 5M CaCl2,然后加入20yl 0. 1M亚精氨（现配先用），祸旋3min。静置Imin后离屯、2s，弃上清。加入140yl 70%酒 精，充分祸旋，离屯、2s，弃上清。然后加入140 100%酒精，充分祸旋，离屯、2s，弃上清。 最后加入15 100%酒精，充分祸旋，W备使用。
[0027] 实施GUS基因单转化时，将含有GUS基因表达载体pA肥25 (化ristensen A H, Quail P H. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research, 1996, 5:213-218.)的质粒DNA与鹤粉包裹；当实施TaNACs与GUS基因共转化时， 将含有TaNACs基因表达载体地1220: TaNACs的质粒DM与含有GUS基因表达载体pA肥25 的质粒DNA按摩尔浓度1:1的比例混合，包裹鹤粉。当GUS基因与TaNACs基因进行共转化 时，Marker基因GUS转入的细胞也是TaNACs转入的细胞。因GUS基因表达的细胞经染色 整个细胞呈现藍色，所W本研究W藍色细胞作为TaNACs的表达细胞。
[002引基因枪轰击程序如下：剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部，平行贴在载玻片上，每 张玻片贴6片叶片左右。基因枪使用PDSlOOOAfe系统，采用135化si的可裂膜片，真空度 为28i址g。轰击后将叶片置于垫有润湿滤纸的瓷盘内，罩W打有小孔的保鲜膜，保湿并透 气，18-20°C恢复培养化后，高密度接种白粉菌分生抱子。接种4她后用GUS染液（配方为； 0.1mol/L化2册04/化&?04缓冲液（pH7. 0)，含lOmmol/L邸TA，5mmol/L铁氯化钟和亚铁氯 化钟，0.1 mg/ml X-Gluc，0. 1% Triton X-100,20% 甲醇，）真空渗透 10min，37°C染色 12h， 然后用70%酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0. 6%的考马斯亮藍对 白粉菌抱子染色。
[0029] 实施例4 TaNACs抗病功能的分析
[0030] 白粉菌侵入小麦叶片表皮细胞后，在表皮细胞中产生的指状物称为吸器。吸 器不能正常产生是叶片细胞对白粉菌具有抗性的重要指标。在GUS表达的细胞中，吸 器会被GUS染色液染成藍色，在显微镜下容易辨认（图2)。在GUS基因转化细胞后，通 过统计与白粉菌互作的GUS表达细胞中，吸器形成的细胞所占的比例（％ )，即为"吸器 指数"（Schweizer, Pokorny et al. A Transient Assay System for the Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat Molecular Plant-Microbe Interactions. 1999, 12:647-654.)。吸器指数越小，表明抗病性越强。本研究利用"吸器指 数"作为抗病强弱的衡量指标。
[0031]
【主权项】
1. 嫩(：转录因子基因了3隱〇8，来自普通小麦（1'1^丨(311111386^￥111111^)南农9918，其01^ 序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 权利要求1所述的基因 TaNACs编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。 3. NAC转录因子基因 TaNACs的重组表达载体pBI220:TaNACs。
4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述的NAC转录因子基因 TaNACs 的表达载体pBI220:TaNACs是以pBI220为出发载体，将TaNACs基因插入pBI220的BamHI 和KpnI酶切位点间所得。
5. 权利要求1所述的NAC转录因子基因 TaNACs在构建抗白粉病小麦品种中的应用。
6. 权利要求3或4所述的NAC转录因子基因 TaNACs的表达载体pBI220 = TaNACs在构 建抗白粉病小麦品种中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了小麦中一个NAC转录因子基因TaNACs及其表达载体和应用。具NAC转录因子基因TaNACs的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自普通小麦(Triticum asetivum L.)南农9918。TaNACs在抗白粉病小麦品种南农9918中受白粉菌诱导表达增强，且表达水平远高于在感病小麦品种扬麦158中的表达水平。通过瞬间表达将该基因转化感病小麦品种扬麦158，结果表明TaNACs的过量表达可以降低扬麦158的吸器指数。因此，TaNACs可望用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，有望提高小麦的白粉病抗性。
【IPC分类】C12N15-82, C12N15-29, A01H5-00, C07K14-415
【公开号】CN104630235
【申请号】CN201510045191
【发明人】曹爱忠, 钱晨, 胡平, 李若晨, 邢莉萍, 周渭皓, 王慧, 王秀娥, 王海燕, 肖进, 陈佩度, 张瑞奇, 袁春霞
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月28日