一种具有启动子功能的dna片段与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种DNA片段，具体设及一种具有启动子功能的DNA片段W及它的用 途。
【背景技术】
[0002] 解淀粉芽抱杆菌是一种在农业、医药和食品工业都有广泛用途的重要的工业微生 物生产菌株之一。目前在解淀粉芽抱杆菌中高效生产高附加值的重组酶仍有许多限制，其 中缺乏高效转录的启动子、可W控制的启动子，具有特征的启动子是限制基因高效表达的 主要限制因素。启动子是基因表达的重要组成元件，是RNA聚合酶结合开始转录合成mRNA 的地方，启动子与RNA聚合酶的结合效率是影响酶基因表达的关键。不同于大肠杆菌，研究 表明枯草菌属含有丰富的0因子（12种），RNA聚合酶与启动子的特异性结合取决于0因 子，给在枯草菌属中捜寻高效的启动子带来了难度。
[0003] 目前报道用于枯草菌属表达重组蛋白的有S类启动子，首先是诱导型启动子。 Pspac (杂合启动子，来源于枯草芽抱杆菌瞻菌体SPO-1与大肠杆菌lac操纵子的融合）需 要添加IPTG诱导，其弱点是启动效率不强需要改进。Pxyl启动子需要木糖作为诱导物，最 初运用于枯草芽抱杆菌中，现在也运用于巨大芽抱杆菌的蛋白表达系统，通过加添0. 1-2% 的木糖，启动子效率上调200倍。PcitM来源于枯草芽抱杆菌，只需要添加2mM巧樣酸盐作 为诱导物就可W合成大量蛋白；PsacB用于生产一系列降解酶包括胞内水解酶，胞外分泌 酶果聚糖庶糖酶，碱性蛋白水解酶等。Ptet用四环素作为诱导，Geissendcxrfer和化lien 将其成功用于生产葡糖脱氨酶和人单链尿激酶。基于glycine riboswitch特点构建利用甘 氨酸作为诱导物的启动子体系。其次是与生长阶段相关的启动子类型。比如rpsF基因启动 子，编码S6和S18核糖体蛋白，单链DNA错定蛋白，在对数生长阶段被激活。Nijland等利 用rpsF基因启动子在产气英膜杆菌中大量生产0-类毒素。ap巧编码枯草杆菌蛋白酶，其 基因启动子在生长稳定期被激活，属于sigA因子类型的启动子，启动强度高。Jan等利用该 启动子的单拷贝重组蛋白整合枯草芽抱杆菌基因组中可W获得10%的总蛋白量。最后是自 诱导启动子。巧St启动子可W在磯酸盐饥饿状态的情况下表达上调5000倍。Kerovuo利 用巧St启动子获得2. 9g/L植酸酶占胞外总蛋白的65%。PgsiB属于si浊因子类型的启 动子，其特点是其mRNA有很长的半衰期达到20min，是应对压力时被诱导，比如温度压力， 盐浓度压力，抑压力或者己醇压力。基于lysine riboswirch特点的启动子（与glycine riboswitch相反）在细胞质中存在大量的赖氨酸时转录终止。
[0004] 而解淀粉芽抱杆菌的启动子的挖掘和应用和其它芽抱杆菌属相比就非常少了。非 专利文献Marcus Schallme et al. (Developments in the use of Bacillus species for industrial production. Canadian Journal of Microbiology [J]. 2004, 50:1-17.)报道利 用解淀粉芽抱杆菌的a-淀粉酶启动子用于表达胞外a-淀粉酶具有明显的热稳定性并用 于糖化作用中，其缺点在于a-淀粉酶启动子的活性还需要进一步提高。专利文献王正祥 (王正祥.一种0-葡聚糖酶的高效制备方法.CN201110001750[P].2006.)报道将源于地 衣芽抱杆菌高温a-淀粉酶启动子和来源于解淀粉芽抱杆菌的中温a-淀粉酶启动子组合 成杂合启动子成功产业化生产0-葡聚糖酶，该杂合启动子具有一定的偏好性。因此，需要 挖掘更多优良性状的不同启动子运用于工业化生产中。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于在解淀粉芽抱杆菌中寻找高表达的启动子，并能运用于异源蛋 白的表达和生产。本发明提供了一种DNA片段，该DNA片段具有启动子的功能；本发明还提 供了所述DNA片段的用途。
[0006] 该方法设及运用RNA-seq技术测定解淀粉芽抱杆菌在对数生长后期的全基因转 录组，筛选高表达的基因，在解淀粉芽抱杆菌中找到一个转录活性高的基因。克隆所筛选的 高表达基因对应的启动子序列，并应用于耐热0-半乳糖巧酶基因（bgaB)的表达，通过测 定bgaB的活性，证明筛选的启动子在解淀粉芽抱杆菌中具有高活性。应用于转谷氨酷胺酶 (MTG)的表达，通过SDS-PAGE电泳图验证其蛋白表达。
[0007] 本发明提供了一种DNA片段，所述DNA片段为如下任一序列：
[000引 （a)如SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列或者其互补序列；
[0009] 化）对SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列进行一个或多个核巧酸取代、缺失或添加所 获得的，具有与SEQ ID NO: 1相同的作为启动子功能的核巧酸序列或者其互补序列；
[0010] (C)对SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列添加一个或多个核糖体结合位点的序列。
[0011] 所述核糖体结合位点的序列为SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列。
[001引一种载体，所述载体包含权利要求1所述的DNA序列和SEQ ID NO: 2所示的核巧 酸序列，优选地，所述载体为质粒载体，如序列SEQ ID NO: 15所示。
[0013] 一种表达质粒，所述质粒包含上述载体W及与该载体可操作连接的位于所述DM 序列下游编码异源蛋白质核巧酸序列。
[0014] 所述异源蛋白质核巧酸序列为好热地芽抱杆菌（Geobacillus kaustophilus)编 码的耐热0-半乳糖巧酶的核巧酸序列，或为茂原链霉菌（Str巧tomyces mobaraensia)编 码的转谷氨酷胺酶的核巧酸序列。
[0015] 一种宿主细胞，所述宿主细胞为上述载体或者上述质粒转化或转导的宿主细胞。
[0016] 所述宿主细胞为芽抱杆菌。
[0017] 所述宿主细胞为解淀粉芽抱杆菌。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0019] 本发明提供了一种DNA片段，该DNA是一启动子，具有很强的特异表达活性，在不 需要添加诱导物的条件下即能实现外源基因的高表达，特别是为解淀粉芽抱杆菌表达外源 基因提供了有效的工具。
【附图说明】
[0020] 图1是实施例2中生长对数后期的解淀粉芽抱杆菌提取总RNA电泳图（1，2:生长 对数后期的解淀粉芽抱杆菌提取总RNA)。
[0021] 图 2 是实施例 3 中扩增 Pseutoi的 PCR产物电泳图（M;marker DNA;l，2:Pseut〇^PCR 扩增产物）。
[002引 图3是实施例4中扩增bgaB基因PCR产物电泳图（M;marker DNA;l，2:bgaB基因 PCR扩增产物）。
[002引 图4是实施例4中扩增biobrick的PCR片段电泳图（M ;marker DNA山 2:biobrick的PCR扩增产物）。
[0024] 图5是实施例5中融合PCR扩增Pseutoi+samyQ信号肤片段电泳图（M ;marker DNA ; 1 :Pseut〇i+samyQ信号肤PCR扩增产物）。
[0025] 图6是实施例4bgaB基因表达质粒pBE-P43-bgaB构建示意图。
[0026] 图7是实施例4表达质粒地E-P,wt〇i-bgaB构建示意图。
[0027] 图8是实施例5中MTG表达质粒地E-Pwutoi-MTG构建示意图。
[002引图9是实施例7带有Pwutoi启动子的bgaB基因表达质粒的解淀粉芽抱杆菌转化子 的bgaB酶活曲线。
[0029] 图10是实施例7带有Pseutni启动子的MTG表达的SDS-PAGE电泳胶图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[003U W下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DM片段 酶切、连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》（第S版）（Sambrook J，Russell DW，Janssen K，Argentine J.黄培堂等译，2002,北京；科学出版社）。
[0032] 从一株解淀粉芽抱杆菌培养的生产对数后期阶段提取细菌RNA。对细菌RNA进行 转录组测序建库，去掉核糖体RNA，对mRNA进行反转录建立cDNA文库。对细菌全转录组进 行分析，根据代表基因转录水平的标准化数据RPKM值判断其表达量水平较高的基因，然后 分析其启动子区。将所选的启动子接入载体，测定启动子在解淀粉芽抱杆菌中的活性。
[003引实施例1
[0034] 细菌的培养
[0035] 将解淀粉芽抱杆菌（-80°C )甘油管取出划线于LB固体平板上37°C培养20-2化， 挑取单菌落于10血的1 %终浓度葡萄糖的LB培养基，37°C，200巧m培养至0Dew8. 5~ 10扣2000型全波长分光光度计，日本化tachi公司）。
[0036] 实施例2
[0037] 细菌总RNA的提取、转录组文库的建立及测序
[0038] 收集实施例1中1血细胞于lOOOOg快速离屯、Imin用于提取细菌总RNA，如 图1。具体的提取方法参考天根生化科技有限公司的细胞细菌总RNA提取试剂盒。用于 RNA-Seq测序文库制备的样品经Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测合格，经 过 DP^Jasel (RNase Rree)处理混入的 DNA 分子，用 I^ibo-Zero (Gram-Positive Bacteria) kit扣SA)去掉占总RNA绝大多数的rRNA，纯化得到的mRNA。将mRNA先打断为合适大小的 片段，W片段化的mRNA为模板，加入反转录酶和随机引物，合成双链cDNA，然后用试剂盒 QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)纯化合成的 cDNA。补平 cDNA 的粘性末端，然后 在一条链上加上一个腺嚷岭核巧酸，W该个突出的A配对含有突出的T的一级接头序列。在 分别能配对一级接头两端的引物存在的条件下进行PCR扩增，经过多次循环，将P