一种适度延缓植物衰老和提高逆境抗性的融合基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体说是用分子生物学技术人工获得一种适度延 缓植物衰老和提高逆境抗性的融合基因及其在转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002] 我国是一个农业大国，但是随着人口的逐年增长，耕地面积的不断减少和农业可 利用资源的日趋紧张，粮食供给面临着巨大挑战，因此提高和稳定粮食产量、改善粮食品质 就成为我国当前国家重大战略发展的需求(周建军等，2014)。
[0003] 延缓衰老与农作物的增产和品质改良密切相关，对于粮食作物和多数经济作物来 说，伴随着产量器官的发育和品质性状的逐渐形成，功能叶片中的同化产物和衰老叶片中 积累的营养物质不断向产量器官转运。作物过早衰老必定影响产品产量和品质，某些杂交 水稻在发育后期叶片和功能早衰导致结实率低，严重影响了杂交水稻产量潜力的进一步发 挥（Gan等，1997)。绿叶类作物的叶片衰老进程不仅影响到产量和品质等要素的形成，而且 还会直接影响到采收产量、采后品质和货架寿命。据报道，目前我国的蔬菜采后损失率高达 10%-50% (张学杰和肖岩，2009)。对于花弁植物而言，叶片和花器官的衰老进程直接影响到 其观赏价值和销售价格。综上所述，改善植物的衰老进程几乎可W影响到所有主要作物的 产量和品质。
[0004] 衰老是叶片发育的最后一个阶段，是一个主动的生理过程，大量的衰老相关基 因（senescence-associated genes, SAGs)表达水平增加，参与衰老过程的调节和控 巧1|。衰老过程中，细胞内的代谢活动极其活跃，积累在叶片中的大量同化产物，包括可 降解的细胞结构，被高效有序地降解和转化，并转运到新生器官，特别是巧粒和果实中 (Buchanan-Wollaston 等，2005 ;Lim 等，2007 ;Lin 等，2004)。叶片衰老受到内部信号巧口 叶龄相关信号和内源激素的水平等）和各种环境因子巧日温度，光照，逆境等）的协调控制。 植物内源激素是影响叶片衰老的主要因子之一，叶片衰老进程的调控与细胞分裂素密切相 关。汤日圣等（1998)发现，外施苯基脉型细胞分裂素（4-PU-30)对杂交水稻叶片具有显著 的保绿和延缓衰老效果，同时还提高了叶片光合速率，促进巧粒灌浆和干物质积累，增加粒 重和产量。刘文大等（2001)采用不同浓度的GAs、BA、PP333喷施天堂草和马尼拉草草坪发 现，H种生长调节剂均可使草坪草衰老延缓，延长绿色期，增强抗寒能力。叶片衰老也是受 外界环境因子影响的高度程序化过程，病害、遮荫、高温、干旱和水溃等逆境都可能导致植 物的早衰。下四兵等（2004)研究表明，在水稻灌浆期间高温促使水稻剑叶的衰老加快，同 时巧粒灌浆加速，有效灌浆期缩短，巧粒充实度降低。文汉和憂凡（2000 )发现，干旱导致水 稻抽穗后剑叶面积和叶绿素含量下降，叶片易早衰，千粒重降低，产量下降。
[0005] 近年来，随着分子生物学技术的发展，很多衰老相关基因被克隆（Quirino等， 2000)，通过分子遗传手段延缓某些植物叶片衰老的成功显示出诱人的前景。Gan和 Amasino (1995)在烟草叶片衰老过程中特异性表达细胞分裂素合成途径的关键基因-异戊 帰基转移酶（IPT)基因显著延缓了转基因烟草植株的衰老，其中剧-货带基因烟草的 种子产量和干重提高了 50%;袁政等（2002)将融合基因剧导入青菜，转基因植株 表现出衰老延迟的生理现象，增加青菜采收产量的同时，也可保持商品的新鲜程度，为绿叶 类蔬菜的耐储存育种提供了新的思路。张晓等（2008)利用基因枪法将Zea分-攻墙4合基 因导入冷季型草坪草高羊茅，转基因植株的抗寒性明显提高，延缓了植株的衰老。下在松等 (2007)将玉米的WC基因转入水稻可W显著提高水稻光合速率，特别是逆境条件下的水稻 光合速率，在一定程度上延缓了衰老。
[0006] 另一方面，环境中多种逆境胁迫如干旱、洪溃、冻害、高温和病害等都会严重影响 作物的产量和品质。其中，干旱是我国重大自然灾害之一，也是对作物产量影响最大、区域 最广、发生最频繁的气象灾害(王春己，2007)。近年来受全球变暖的影响，我国干旱灾害不 断加剧，旱灾发生区域从西部、北方逐步扩展到东部、南方，覆盖我国多个粮食主产区。据 统计，1950~2007年，全国农业平均每年因旱受灾2173. 33万hm2,年均因旱损失粮食高 达158亿kg,占各种自然灾害造成粮食损失的60%W上(康蕾和张红旗，2014)。为了减轻 干旱灾害所造成的损失，在加强生态环境动态监测和风险评估、提高水资源利用效率等综 合治理的同时，利用植物基因工程等手段培育新的抗旱品种也是一个有力的手段。
[0007] 近年来，随着对干旱胁迫调控的分子机制认识逐渐加深，许多与干旱相关信号因 子、转录因子、功能基因相继被鉴定克隆，包括心?邸i、心E化?、《//义及转录因子必化； 必恐、/7Z/7等（降云峰，2013 ;Umezawa等，2006)。该些研究不仅为人们在分子水平上了解植 物对干旱的调控机制提供了依据，更为通过基因工程提高作物的抗旱性提供了潜力基因。 化ji等（2002)研究发现在转基因拟南芥中过量表达肌醇半乳糖巧合成酶仿7义?)，可W 引起内源肌醇半乳糖巧和棉子糖含量上升，减少叶片蒸发，提高拟南芥的抗旱能力。Haake (2002)等研究表明，将转录因子做树（能与CRT/DRE结合）转入拟南芥，导致TGGCCGAC元 件W及下游基因的活性增强，提高拟南芥的抗旱和抗寒能力。Pellegrineschi等（2002)将 口思双23基因转入小麦中，在严重水分胁迫条件下，对照小麦都萎慧死亡，而转基因小麦能存 活。Capell等（1998)将燕麦的精氨酸脱駿酶基因（Argininedecarbo;sylase，^沁）转到了 水稻中，在干旱条件下能减少叶绿素损失，避免水稻旱害。Xu等（1997)将大麦的晚期胚胎 发生丰富蛋白（Lea)基因//K心导入水稻，水稻叶片Lea蛋白的表达量很高，第二代转基因 水稻的抗旱性和抗盐性明显提高。在胁迫条件下，转基因水稻具有较高的生长速率，能延缓 由胁迫引起的伤害症状，在胁迫消除后恢复也快。Nelson等（2007)也证明过表达拟南芥中 转录因子恐滿]同源基因一通恐滿]转基因玉米，在干旱胁迫条件下，其叶绿素 含量、光合速率和气孔导度明显高于对照玉米，而叶片温度明显低于对照，对干旱胁迫的耐 受性显著提高。
[0008] 总之，获得适度延缓叶片衰老和逆境抗性相关基因，并利用生物工程技术调控其 在主要经济作物中的表达方式和表达水平，使得转基因植物既能延缓衰老，又不会延长植 物的生长周期，是提高和稳定作物产量、改善作物品质性状的有效手段，具有重大的经济效 益和社会效益。
【发明内容】
[0009] 本发明目的是通过在模式植物拟南芥中的功能分析，提供一种适度延缓叶片衰老 和提高逆境抗性相关基因及其应用，为适度延迟叶片衰老进程，提高作物逆境抗性，改善作 物产量和品质性状提供操作策略和基因资源。
[0010] 本发明通过利用分子生物学技术人工拼接了一个全长为1206 bp的融合基因，命 名为网化?，其核酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示。分析证明该融合基因具有适度延缓叶 片衰老、增强干旱抗性的功能，将该基因转入主要经济作物中，具有提高和稳定作物产量、 改善作物品质性状的潜力。
[0011] 本发明提供的网化織合基因的获取方法，具体操作如下： 第一、W拟南芥cDNA为模板，利用PCR方法设计特异引物扩增网化織合基因的下游部 分，同时在扩增用的上游引物中引入网化織合基因的上游部分，从而获得全长的网化織合 基因片段； 第二、回收PCR扩增产物； 第H、将上述第二步回收的扩增产物，与PMD18-T载体(购自Takara公司）在连接酶催 化下进行连接反应； 第四、将连接产物转化大肠杆菌D册a感受态细胞； 第五、通过抗性筛选，获得该网化織合基因的阳性TA克隆。
[0012] 其中所设计的网化織合基因的PCR扩增引物如下，先利用上游引物2和下游引物 2扩增，然后W该扩增产物为模板利用上游引物1和下游引