专利名称：凝血因子Ⅸ复合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用于制备凝血因子IX复合物的改进方法，具体而言是用DEAE-sepharose Fast Flow(二乙基胺乙基-琼脂糖快胶)凝胶对新鲜冰冻血浆进行离子交换吸附分离的方法。
背景技术：
对乙型血友病和因肝脏疾患引起的凝血功能异常，目前主要采用高纯人血凝血因子IX，或是主要含有K维生素依赖的凝血因子II、VII、IX、X的凝血因子IX复合物(即“凝血酶原复合物”)血浆蛋白制品。由于后者制品中同时含有多种凝血因子，因此还可以用于由于维生素K缺乏而继发的II、VII、IX、X因子水平低下所致出血的治疗，有着较大的应用价值。
目前文献报导的无论是制备单一凝血因子IX，还是制备同时含有凝血II、VII、IX、X因子的凝血酶原复合物的方法，均是将人血浆原料根据制品种类的不同需要通过离子交换树脂进行选择性吸附分离，洗涤除去杂蛋白和/或不需要的因子成分后，收集含有制品所需因子成分的洗脱液再进行相应的后处理。有研究报导，由于这些维生素K依赖蛋白的等电点较低，以采用各种阴离子交换树脂，如可以是含有DEAE(二乙基胺乙基)、PEI(聚乙烯亚胺)、QAE(季氨基乙烷)等基团的如Q-Sepharose Fast Flow树脂、DEAE-Sepharose fast Flow树脂、DEAE-Toyopearl树脂、QAE-Toyopearl树脂、POROS-Q树脂、Fractogel-DMAE树脂、Fractogel EMD-TMAE树脂、及Matrex Cellufine DEAE等树脂进行吸附分离为宜。例如，美国专利5,118,614在制备上述含有II、VII、IX、X因子的凝血酶原复合物(PCC)时，采用含有DEAE的DEAE-hydroxyethyl methacrylate polymer(羟乙基异丁烯酯聚合物)层析交换树脂，用含有0.1摩尔氯化钠和浓度为10毫摩尔pH7.4柠檬酸钠缓冲液平衡后，在用含有0.2摩尔的氯化钠缓冲液洗涤，可以得到纯度60-90％的凝血因子IX复合物。在美国专利5,409,990中，报导了以含有丁基团的亲水乙烯系聚合物的DEAE-sephadex树脂，用含有1摩尔氯化钠浓度为15毫摩尔pH7的柠檬酸钠缓冲液进行平衡和洗涤、洗脱，可以使凝血酶原复合物产品中IX因子的活性为原始的76％。新兴上海血液制品研究所在《中国输血杂志》1998(4)，196中有关研究报告中曾提出，以枸橼酸盐为抗凝剂，用DEAE-sephadex A-50树脂对血浆进行吸附和洗脱分离制备凝血酶原复合物，能有比较理想的效果。《中国输血杂志》1997(2)，63-66中报导了分别以DEAE-sephadex A-50和DEAE-sepharose CL-6B树脂胶对冰冻人血浆进行吸附和洗脱分离后，再经S/D病毒灭活等后处理而得到的改良凝胶吸附法制备凝血酶原复合物，制品中IX因子的活性回收率可基本接近68％。除上述制备凝血因子IX复合物的各种方法外，为制备只含单一凝血因子IX的制品，美国专利5,457,181报导了依次用DEAE-sephadex A-50和DEAE-sepharose CL-6B进行吸附分离，得到高纯人血IX因子制品的方法。《药物生物技术》1999.6(2)，107-109中报导了依次分别用DEAE-sephadex A-50、DEAE-sepharose Fast Flow和DEAE-sepharose CL-6B树脂对人血浆进行吸附和洗脱分离后，得到除去杂蛋白及II、VII、X因子后的高纯人血IX因子制品的方法。在美国专利5,714,583报导的对IX因子的纯化方法中，也以采用强阴离子交换树脂Q-Sepharose Fast Flow，并用含有不同浓度氯化钠和/或氯化钙Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液分别进行平衡、洗涤和洗脱为例，提出还可以用多种阴离子型交换树脂层析法对由人血浆或重组产品获取的IX因子进行纯化处理。此外，《Vox.Sang》(《血液之声》)198957233-239在对由人血浆制备凝血因子IX复合物进行的半连续方法的研究报告中，对以DEAE-sephadexA-50和DEAE-sepharose Fast Flow不同离子交换树脂进行的批式吸附、搅拌柱层析及普通柱层析的对比研究后提出，以浓度为0.02摩尔，pH6.0的柠檬酸钠缓冲液进行平衡和洗涤，同时用还含有0.4摩尔氯化钠的该缓冲液进行洗脱，搅拌柱层析的方法可以使制品中的IX因子回收率达到68％。
实践中发现，上述许多制备方法中所采用或推荐使用的DEAE-sephadex A-50树脂，由于其机械强度较差，使用寿命短，且胶浆分离困难，回收率低，生产操作困难，使制品的成本较高，质量也难以稳定。为此，《华西药学杂志》2000(3)，177-179在对凝血因子IX复合物的研制报告中，提出对人新鲜冰冻血浆单独采用DEAE-sepharose Fast Flow(二乙基胺乙基-琼脂糖快胶)凝胶进行吸附分离，可以使此步分离后的活性回收率达到高于传统使用DEAE-sephadex A-50树脂回收率的76.42％的水平。
由此可以看出，在制备凝血因子IX复合物的各种吸附分离方法中，由于采用的离子交换介质种类的不同，以及在操作过程中用于平衡、洗涤和洗脱的缓冲液体系和/或具体的指标参数不同，可以对所得制品的纯度及其活性回收率产生显著的影响。
发明内容
在上述技术的基础上，经过进一步的深入研究和筛选，本发明提出了一种在制备含有II、VII、IX、X因子的凝血因子IX复合物(凝血酶原复合物)时，能使直接采用DEAEsepharose Fast Flow(二乙基胺乙基-琼脂糖快胶)凝胶进行离子交换吸附分离获得更加理想效果的具体方法。该方法能够在一方面尽可能地保留II、VII、IX、X因子的活性而达到较高的回收率的同时，又能尽量地除去杂蛋白，提高制品的纯度，以降低其潜在致血栓的副作用。
本发明的凝血因子IX复合物制备的方法，同样是用DEAE-sepharose Fast Flow凝胶对新鲜冰冻血浆进行吸附分离后，收集含有II、VII、IX、X因子的凝血酶原复合物洗脱液。其中，在用DEAE-sepharose Fast Flow进行吸附前，先用浓度为4-7毫摩尔，特别是5-6毫摩尔和pH5.5-6.5，特别是pH～6.0的磷酸盐缓冲溶液，或是枸橼酸盐缓冲溶液中的任何一种，按常规方式对吸附用的凝胶进行平衡后，再加入新鲜冰冻人血浆进行交换吸附，然后用pH5.5-7.0的相同缓冲溶液对吸附凝胶进行洗涤，再用pH6-8的相同缓冲溶液对吸附凝胶进行洗脱，收集含有凝血因子II、VII、IX和X的凝血因子IX复合物。
上述方法中，在所进行的同一个分离处理过程中，对离子交换凝胶进行平衡、洗涤和洗脱所用的缓冲溶液应保持为相同的缓冲液体系。实验结果显示，采用磷酸盐缓冲液体系时可以有更为理想的效果。
实验结果显示，上述对交换树脂进行平衡、洗涤和洗脱时，改变所用的缓冲液中的离子强度，对制品的回收率可以产生一定的影响。因此，上述方法中所用的各种缓冲溶液均可以用适当种类和/或含量的碱金属氯化物调节其离子强度。例如，所用平衡缓冲溶液的离子强度可以用0-0.04摩尔的碱金属氯化物进行调节；洗涤缓冲溶液的离子强度可以用0-0.2摩尔的碱金属氯化物进行调节；洗脱缓冲溶液也可以用0.36-0.6摩尔，特别是0.4-0.5摩尔的碱金属氯化物进行调节。所说的用于调节离子强度的碱金属氯化物，一般可以使用如氯化钠、氯化钾——特别是氯化钠——这些最为常用的碱金属氯化物。实验结果显示，使用钠盐和钾盐调等不同盐类调节离子强度时，虽对产物的回收率未发现有明显影响，但一方面钾盐的价格通常高于钠盐，另一方面，若过量的钾盐进入体内会对心脏功能产生较多的不利影响，因此产品的质量控制要求很严，即使将制品中的K+含量控制在符合药政管理的规定和要求范围内，在大量输注该产品时也会发生K+累积，还必须要进行临床K+监测。因此，一般情况下以采用氯化钠调节离子强度为好。
本发明所提出的上述用吸附凝胶对新鲜冰冻血浆进行吸附分离的操作方法，可以适用于在普通柱层析方法、搅拌柱层析方法或批式吸附法等任何一种常规的方法中使用。
本发明的上述方法在对血浆以离子交换树脂进行吸附分离的过程中采用阴离子型DEAE-sepharose Fast Flow凝胶，不仅操作简单，而且所得制品仍保持了凝血酶原复合物的组成特点，并可以尽可能多地保留有效成分II、VII、IX、X因子的活性，明显提高这类相关因子的回收率，大量的实验结果已显示，本发明此步操作的回收率可以达到93.67±2.56％的水平，经进一步后处理后，所得到的最终制品的总回收率也可以达到非常理想的80％以上，且制品中所含各凝血因子的比活性也可比传统方法所得相应制品有数倍至近十倍的提高，同时还使其中各种杂蛋白的含量更低，纯度更高，经体外血栓分析和动物体内血栓非停滞模型实验证实，所得制品能显著地降低产生潜在致血栓副作用的危险性。
以下结合附图所示的试验结果，通过若干实例的具体实施方式
，再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于下述的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1是对本发明方法与传统方法所得制品进行的HPLC对照图谱图2是对本发明方法与传统方法所得制品进行的SDS-PAGE对照图谱图3是对本发明方法与传统方法所得制品进行的IE对照图谱图4是对本发明方法与传统方法所得制品进行的CIE对照图谱具体实施方式
实例1～实例10采用的均为普通柱层析方式，其操作方法为在用预先溶胀好并装柱的DEAE-sepharose Fast Flow凝胶层析柱中，用4-5倍胶样体积的相应磷酸盐缓冲液或枸橼酸盐缓冲液，按常规方式平衡层析交换柱。然后，将新鲜冰冻人血浆在37℃条件下以使纤维蛋白原不致析出的快速方式融化并用相同体系缓冲液调节至pH7.0后，注入层析交换柱并保持各例所列相应的静置时间，完成吸附交换过程。然后用相同体系的适当缓冲液以2.5毫升/分钟流速洗涤层析柱。待洗涤峰结束后，再用以氯化钠调节至所需离子强度的相同体系的缓冲液以2.5毫升/分钟的速度对层析交换柱进行洗脱操作，并收集含有所需凝血因子II、VII、IX和X的凝血酶原复合物的洗脱液。采用磷酸盐缓冲液和枸橼酸盐缓冲液的各例具体操作条件及回收率分别如表1和表2所示。
表1采用磷酸盐缓冲液体系柱层析各例的具体操作条件及回收率
表2采用枸橼酸盐缓冲液体系柱层析各例的具体操作条件及回收率
实例11～实例20采用的均为批式吸附方法，其操作为用3-4倍胶样体积的相应磷酸盐缓冲液或枸橼酸盐缓冲液，按常规方式对已溶胀好的DEAE-sepharose Fast Flow凝胶进行平衡后，将新鲜冰冻人血浆在37℃条件下以使纤维蛋白原不致析出的快速方式融化并用相同体系缓冲液调节至pH7.0，并加入吸附凝胶，4℃条件下搅拌吸附60分钟完成吸附交换过程，然后抽滤。再用3倍于胶样体积的同体系缓冲液洗涤吸附凝胶后，抽滤。最后用8～10倍于胶样体积且用氯化钠调节至所需离子强度的同体系缓冲液进行洗脱的抽滤操作，收集含有所需凝血因子II、VII、IX和X的凝血酶原复合物的洗脱液。采用磷酸盐缓冲液和枸橼酸盐缓冲液的各例具体操作条件及回收率分别如表3和表4所示。
表3采用磷酸盐缓冲液体系批式吸附各实例具体操作条件及回收率
表4采用枸橼酸盐缓冲液体系批式吸附各实例具体操作条件及回收率
在上述的各实例中，将调节离子强度用的氯化钠改换成氯化钾后，对回收率未发现有明显的影响。
将本发明上述方法收集的产物经后处理后得到的凝血酶原复合物制品，与前述文献报导方法所得相应制品的凝血因子比活性及杂蛋白含量的检测结果对比，如表5所示。
表5 制品的凝血因子比活性及杂蛋白含量对照实验结果
本发明方法所得的凝血酶原复合物制品与按前述文献方法所得制品进行的高压液相层析(HPLC)对照结果，如图1中的两图谱所示，其中A为传统方法制品的图谱，B为本发明方法制品的图谱。由A、B两图谱的峰形对比已清楚地显示出，本发明方法所得制品的纯度高于传统方法的制品。各图谱中的最大吸收峰2(保留时间28分钟)对应的分子量为4-7万，正是凝血因子II、VII、IX、X分子量所在范围；位于最大吸收峰2之前的峰1和之后的峰3分别对应为高分子量蛋白和低分子量蛋白。对两图谱进行的分析显示，本发明方法制品中凝血因子II、VII、IX、X有效成分峰形面积比传统方法制品的增加了16.366％，表明其含量有所提高，而高分子量杂蛋白的峰形面积减少了15.233％，表明其含量有所减少，小分子杂蛋白的含量变化变大。
对由不同方法所得的制品进一步进行的SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺电泳)、IE(免疫电泳)和CIE(交叉免疫电泳)的对照图谱分别如图2、图3和图4所示，各图中的A、B所示的均分别为传统方法制品和本发明方法制品的样品，1为低分子量蛋白标准。这些图谱同样也已清楚地显示出本发明方法的制品中的杂蛋白含量明显少于传统方法的制品，纯度显著提高。
对经本发明上述方法所的得的制品与按前述文献报导方法所得的相应制品中的活化凝血因子含量进行检测的对照结果，如表6所示。
表6 制品中活化凝血因子含量的对照结果
表6的结果显示，本发明方法制品中的活化凝血因子的含量远远低于传统方法的制品，表明按本发明制备方法得到的凝血酶原复合物制品可以显著降低在使用中潜在的血栓危险性。
通过体外血栓性分析和体内模型试验，可以表明制品潜在的致血栓性大小。其中，体外血栓性分析包括非活化的部分凝血活酶时(NAPTT)实验和凝血酶生成时(TGt50)实验。对经本发明方法所得到的上述制品与用传统方法所得的相应制品进行的此两项实验的对比实验结果如表7所示，其中表内的NAPTR为非活化的部分凝血时比率，即样品NAPTT值/空白NAPTT值的比值。
表7NAPTT实验和TGt50实验的结果
以鼠非停滞模型对上述不同方法的制品进行的体内实验研究，也同样证实了其不同的潜在血栓危险性。将本发明方法的制品和传统方法制品输入鼠体内后的SFMC(可溶性纤维蛋白单体复合物)、FDP(纤维蛋白降解产物)、D-Dimer(D-二聚体)和t-PA(组织纤溶酶原激活剂)各项指标含量动态变化情况的实验结果，分别如表8～表11所示，其中以25％的白蛋白为阴性对照。
表8 输入不同制品后鼠体内SFMC含量的动态变化结果
表9 输入不同制品后鼠体内FDP含量的动态变化结果
表10输入不同制品后鼠体内D-Dimer含量的动态变化结果
表11 输入不同制品后鼠体内t-PA含量的动态变化结果
比较分析后发现，输入25％白蛋白后的各项指标变化不大，而输入高剂量的本发明方法制品和传统方法制品后，各项指标分别出现了不同程度的增值，而传统方法制品组的各项指标在0-80分钟内的动态变化均高于本发明方法制品组，表明了传统方法制品在体内比本发明方法的制品更易处于高凝状态，预示了发生血栓的潜在危险性更大，而该实验结果则显示出本发明方法的制品能显著地降低进入体内后发生血栓的潜在危险性。
权利要求
1.凝血因子IX复合物的制备方法，用阴离子型的二乙基胺乙基-琼脂糖快胶对新鲜冰冻血浆进行离子交换吸附分离，其特征在于用二乙基胺乙基-琼脂糖快胶吸附前，先用浓度为4-7毫摩尔和pH5.5-6.5的磷酸盐缓冲溶液或枸橼酸盐缓冲溶液中的一种按常规方式对吸附用的凝胶进行平衡后，再加入新鲜冰冻人血浆进行交换吸附，然后用pH5.5-7.0的相同缓冲溶液对吸附凝胶进行洗涤，再用pH6-8的相同缓冲溶液对吸附凝胶进行洗脱，收集含有凝血因子II、VII、IX和X的凝血因子IX复合物。
2.如权利要求1所述的凝血因子IX复合物的制备方法，其特征在于所用的缓冲溶液为浓度为5-6毫摩尔的磷酸盐缓冲液。
3.如权利要求1所述的凝血因子IX复合物的制备方法，其特征在于所用的缓冲溶液为浓度为5-6毫摩尔的枸橼酸盐缓冲液。
4.如权利要求1至3之一所述的凝血因子IX复合物的制备方法，其特征在于所用的平衡缓冲溶液和洗涤缓冲溶液的pH均为6.0。
5.如权利要求1至3之一所述的凝血因子IX复合物的制备方法，其特征在于所用的各种缓冲溶液中可以用碱金属的氯化物调节其离子强度。
6.如权利要求5所述的凝血因子IX复合物的制备方法，其特征在于所用的平衡缓冲溶液的离子强度用0-0.04摩尔的氯化钠进行调节。
7.如权利要求5所述的凝血因子IX复合物的制备方法，其特征在于所用的洗涤缓冲溶液的离子强度用0-0.2摩尔的氯化钠进行调节。
8.如权利要求5所述的的凝血因子IX复合物的制备方法，其特征在于所用的洗脱缓冲溶液用0.36-0.6摩尔的氯化钠进行调节。
9.如权利要求8所述的凝血因子IX复合物的制备方法，其特征在于所用的洗脱缓冲溶液的离子强度为0.4-0.5摩尔。
10.如权利要求1至3之一所述的凝血因子IX复合物的制备方法，其特征在于用吸附凝胶对新鲜冰冻血浆进行的吸附分离操作，可以采用普通柱层析方法、搅拌柱层析方法或批式吸附法中的任何一种。
全文摘要
本发明涉及凝血因子IX复合物的制备方法,用DEAE－sepharose Fast Flow对新鲜冰冻血浆进行离子交换吸附分离前,先用浓度为4－7毫摩尔和pH5.5－6.5的磷酸盐缓冲溶液或枸橼酸盐缓冲溶液中的一种按常规方式对吸附用的凝胶进行平衡后,再加入新鲜冰冻人血浆进行吸附,然后用pH5.5－7.0的相同缓冲溶液对吸附凝胶进行洗涤,再用pH6－8的相同缓冲溶液对吸附凝胶进行洗脱,收集含有凝血因子II、VII、IX和X的凝血因子IX复合物。
文档编号C07K14/745GK1336178SQ0110874
公开日2002年2月20日 申请日期2001年8月16日 优先权日2001年8月16日
发明者余蓉, 杨继虞, 李晓红 申请人:四川高维系统工程技术有限公司, 余蓉, 杨继虞