专利名称：促红细胞生成素的纯化的制作方法
促红细胞生成素的纯化本文记述了使用羟磷灰石层析(hydroxyapatite chromatography)纯化促红细胞生成素(EPO)的方法。另外描述了用于去除宿主细胞蛋白质的方法和用于改变EPO组合物的同工型分布的方法。
背景技术：
促红细胞生成素(EPO)是一种刺激红细胞产生的人糖蛋白。其作用和治疗应用例如在 EP 0 148 605、EP 0 205 564、EP 0 209 539 和 EP 0 411 678，以及在 Huang, S. L.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, Lai，P. H.等人，J.Biol· Chem. 261(1986)3116-3121 和 Sasaki, H.等人，J. Biol. Chem. 262(1987) 12059-12076 中详
细描述。EPO仅以非常低的浓度存在于健康人血浆中。从患有再生障碍性贫血患者的尿中分离人 EPO 是已知的(Miyake, T.等人，J. Biol. Chem. 252 (1977) 5558-5564)。描述了一种七步法，其包括离子交换层析、乙醇沉淀、凝胶过滤和吸附层析。EP 0 148 605和EP 0 205 564 记述了在 CHO 细胞中生产重组人 ΕΡ0。Nobuo, I.等人，J. Biochem. 107 (1990) 352-359 描述了用于纯化重组生产的EPO的方法。用于生产和纯化促红细胞生成素的另外方法是已知的，尤其在下列文献中描述EP 0 148 605、EP 0 205 564、EP 0 255 231, EP 0 830 376、EPO 267 678、EP 0 228 452、EP 1 127 063、EP 0 209 539、EP 0 358 463、EPl 010 758、 EP 0 820 468、EP 0 984 062、EP 0 640 619、EP 0 428 267、EPl 037 921 和 Lai， P. H.等 A, J.Biol. Chem. 261(1986)3116-3121 ；Broudy, V. C.等人，Arch. Biochem. Biophys. 265(1988)329-336 ；Zou, Z.等人，Journal of Chrom. 16 (1998) 263-264 ； Inoue, N.等人，Biol. Pharm. Bull. 17 (1994) 180-184 ;Qian，R. L.等人，Blood 68(1) (1986)258-262、Krystal, G.等人，Blood 67(1) (1986)71-79 ；Lange, R. D.等人，Blood CellslO (2-3) (1984)305-314 ；Sasaki, R.等人，Methods Enzymo 1. 147(1987)328-340 ； Ben Ghanem, A.等)κ, Prep. Biochem. 24(1994) 127-142 ；Cifuentes, Α.等)κ, J. Chrom. A 830(1999)453-463 ；和 Gokana，Α.等人，J. Chromat. A 791(1997) 109-118。EP 1 394 179记述了用于生产不含动物蛋白的促红细胞生成素的方法。EP O 986 644的主题是通过用病毒启动子进行内源基因活化而生产促红细胞生成素。EP 1 428 878 中记述了用于生产重组糖蛋白、特别是促红细胞生成素的方法。EP 1 492 878中记述了用于生产所需特性的促红细胞生成素糖原同工型的方法。发明概述重组促红细胞生成素的生成和纯化需要若干步骤，特别是层析步骤。本发明的第一方面是生产促红细胞生成素的方法，包括至少一个应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤，且包括下列步骤i)将含有0. 5mM至20mM钙离子浓度的含促红细胞生成素溶液与含有羟磷灰石的固定相接触，所述固定相已用含有0. 5mM至20mM相同钙离子浓度的溶液平衡，ii)将含有低于0. 5mM钙离子浓度的溶液通过含有羟磷灰石的固定相，和
iii)将含有低于0. 5mM钙离子浓度的溶液通过含有羟磷灰石的固定相，由此生产促红细胞生成素。在一个实施方案中，与i)中含促红细胞生成素的溶液相比，所生产的促红细胞生成素不含脱氧-EPO类和脱氮-EPO类。在进一步的实施方案中，除了应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤之外，该方法还包括至少一个另外的层析步骤。在进一步的实施方案中， 所有层析步骤均以不同的层析原理为基础，其中各层析原理在该方法中仅使用一次。在进一步的实施方案中，该一个或多个层析原理选自亲和层析、疏水相互作用层析、反相层析、 凝胶渗透层析、阳离子交换层析和/或阴离子交换层析。在进一步的实施方案中，层析步骤的顺序为亲和层析、疏水相互作用层析、在含有羟磷灰石的固定相上的层析、任选的反相层析和阴离子交换层析。在一个实施方案中，除层析步骤之外，根据本发明的方法还包括任选的中间步骤，例如盐沉淀、浓缩、渗滤、超滤、透析和/或乙醇沉淀。本发明的一方面是已用根据本发明的方法获得的促红细胞生成素组合物。本发明的又一方面是用于从促红细胞生成素制品中去除中国仓鼠卵巢(CHO)细胞蛋白质的方法，包括根据本发明的应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤，其中含有促红细胞生成素的馏分的收集受^Onm处的光吸收控制，以15mAU至75mAU的吸收开始，并在峰最大值通过200mAU至40mAU的吸收后终止。在一个实施方案中，含有羟磷灰石的固定相是纯的结晶羟磷灰石。在另一个实施方案中，步骤ii)和/或iii)中用于层析的溶液含有约5mM磷酸盐离子浓度，在另一个实施方案中，为5mM磷酸钠或磷酸钾。本发明的另一方面是用于制备促红细胞生成素组合物的方法，所述组合物是促红细胞生成素同工型的混合物，所述促红细胞生成素同工型中每个促红细胞生成素分子的唾液酸残基数大于6且小于17，并且四触角糖基形式三触角糖基形式双触角糖基形式的比率范围为83 14 2至74 21 6。在一个实施方案中，该比率在该范围内是线性的。因此，本发明的另一方面是促红细胞生成素组合物，其是促红细胞生成素同工型的混合物，所述促红细胞生成素同工型中每个促红细胞生成素分子的唾液酸残基数大于6且小于17，并且四触角糖基形式三触角糖基形式双触角糖基形式的比率范围为 83 14 2至74 21 6。在一个实施方案中，所述比率在该范围内是线性的。在一个实施方案中，该促红细胞生成素组合物的四触角糖基形式具有一个重复单元的四触角糖基形式具有两个重复单元的四触角糖基形式三触角糖基形式具有一个重复单元的三触角糖基形式双触角糖基形式的比率范围为 43 28 12 8 6 2至45 21 7 14 7 6。在一个实施方案中，所述比率在该范围内是线性的。因此，本发明的又一方面是促红细胞生成素组合物，其四触角糖基形式具有一个重复单元的四触角糖基形式具有两个重复单元的四触角糖基形式三触角糖基形式具有一个重复单元的三触角糖基形式双触角糖基形式的比率范围为 43 28 12 8 6 2至45 21 7 14 7 6。在一个实施方案中，所述比率在该范围内是线性的。本发明的又一方面是促红细胞生成素组合物，其是促红细胞生成素同工型的混合物，所述促红细胞生成素同工型中每个促红细胞生成素分子的唾液酸残基数大于6且小于 17，所述组合物已用根据本发明的方法获得。本发明的再一方面是用于生产重组促红细胞生成素的方法，其包括在适宜条件下、在适宜培养基中培养包含编码促红细胞生成素的核酸的宿主细胞以生产促红细胞生成素，并从培养基或细胞中分离促红细胞生成素。在一个实施方案中，在悬浮液中培养该细胞。在进一步的实施方案中，在发酵罐中、特别是在体积为10升至50，000升的发酵罐中培养该细胞。从培养基中分离促红细胞生成素包括下列步骤(a)将细胞培养上清液施加到亲和层析材料上，并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分，(b)任选地将(a)的馏分施加到疏水相互作用层析材料上，并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分，(c)用根据本发明的方法，将(a)或(b)的馏分施加到含有羟磷灰石的固定相上， 并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分，和(d)将(c)的馏分浓缩或/和将其通过反相HPLC材料。纯化方法的步骤(a)包括将细胞上清液通过亲和层析材料，所述细胞上清液可任选进行预处理。在一个实施方案中，该亲和层析材料是已与蓝色染料偶联的亲和层析材料。 实例是蓝色琼脂糖凝胶(Blue kpharose)。在一个实施方案中，如果血清含量> 2% (ν/ ν)的培养基用于发酵/其生产，那么在从亲和层析材料中洗脱后，将含有促红细胞生成素的洗脱液通过疏水相互作用层析材料。在一个实施方案中，该疏水相互作用层析材料是丁基琼脂糖凝胶。在步骤(c)中，将来自步骤(a)或步骤(b)(如使用)的洗脱液通过含有羟磷灰石的固定相，并分离含有促红细胞生成素的洗脱液。在一个实施方案中，浓缩用排阻层析、例如膜过滤进行。在这种情况下，使用例如排阻大小为IOkDa的膜已被证明是有利的。 可用根据本发明的方法获得的促红细胞生成素可含有0-2，3_连接的或/和α-2，6_连接的唾液酸残基。本发明的另一方面是用于生产聚乙二醇缀合的促红细胞生成素的方法，其包括下列步骤a)使用活化聚乙二醇试剂共价连接即聚乙二醇化促红细胞生成素，b)通过两个连续的阳离子交换层析步骤纯化聚乙二醇缀合的促红细胞生成素，由此产生聚乙二醇缀合的促红细胞生成素，其中步骤a)中所用的促红细胞生成素用根据本发明的方法获得。本发明的另一方面是药物组合物，其包含已用根据本发明的方法获得的促红细胞生成素。根据本发明的组合物可任选与常规药用稀释剂、赋形剂、辅助剂和载体一起配制成药物制剂。当用反相HPLC (例如在Vydac C4柱上)或/和体积排阻层析(例如在TSK 2000SW Ultrapac柱上)测定时，可用于产生药物制剂的根据本发明的组合物具有至少99 %的纯度，或在另一个实施方案中，具有至少99. 9%的纯度。本发明的又一方面是用于治疗贫血的药物组合物，其包含促红细胞生成素，所述促红细胞生成素已用根据本发明的方法获得。发明详述不同物质能否用层析法彼此分离，首先取决于进行层析的条件，此外取决于良好的柱填充和层析材料(固定相)的选择。除缓冲系统的选择之外，这包括洗脱杂质和产物的方式。本发明记述了用于纯化促红细胞生成素的方法，包括至少一个应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤，并包括下列步骤i)将待纯化的含有第一钙离子浓度的促红细胞生成素溶液与含有羟磷灰石的固定相接触，一定体积的含有第二钙离子浓度的溶液已通过所述固定相，ii)将一定体积的含有比来自i)的溶液更低的钙离子浓度即第三钙离子浓度的溶液通过含有羟磷灰石的固定相，其中在该过程中促红细胞生成素保持与含有羟磷灰石的固定相结合或未从其分离，和iii)将一定体积的含有低于0.5mM钙离子浓度即第四钙离子浓度的溶液通过来自ii)的含有羟磷灰石的固定相，其中促红细胞生成素从含有羟磷灰石的固定相中分离和洗脱。在一个实施方案中，第一和第二浓度和/或第三和第四浓度是不同的。在另一个实施方案中，第三和第四钙离子浓度为第一和第二钙离子浓度的10 %或更少。促红细胞生成素，其在下文中也被称为ΕΡ0，被理解成具有刺激类红前体细胞中的分化和分裂过程并由此提供红细胞的生物能力的蛋白质。该蛋白质优选是人促红细胞生成素，由分子量为约34-38kDa的165个或166个氨基酸(SEQ ID NO 1和2、组成。糖残基占约40%的分子量。EPO的衍生物和片段例如聚乙二醇化ΕΡ0，即聚乙二醇缀合的促红细胞生成素，具有类似的生物学性质并包含通过培养产生EPO的宿主细胞所得的促红细胞生成素，也可用根据本发明的方法制备。人EPO的DNA序列和蛋白质序列尤其在EP 0 205 564 和EP 0 209 539中描述。EPO的结构包括两个二硫桥和数条糖链。糖链在下文也被称为糖残基，其与蛋白质主链结合。有些链通过天冬酰胺残基与蛋白质以N-糖苷键结合，而某条链通过丝氨酸残基与蛋白质以0-糖苷键结合。唾液酸(N-乙酰神经氨糖酸)通常掺合到(支链或直链)糖残基的末端。此后糖残基再也不能延伸。唾液酸仅可与fell (β 1-4)GIcNAc的α 2_3键连接(Nimtz，Μ.等人， Eur. J. Biochem. 213(1993)39—56)。术语“触角”(antermarity)或“糖残基的触角”是指糖残基的支化度。如果糖残基例如具有两个臂，那么糖残基是双触角的，即其是双触角糖残基。糖残基可具有重复性部分，即所谓的重复单元。这些是其中序列GIcNAC和半乳糖(N-乙酰乳糖胺)是重复性的区域。糖残基的链长、由此还有蛋白质的分子量随不同的重复单元数目而变化(Nimtz，M.等人，Eur. J. Biochem. 213 (1993) 39-56)。在EPO的情况下，三触角糖残基可包含最大一个重复单元，而四触角糖残基可具有至多两个的重复单元。双触角糖残基不具有重复单元。促红细胞生成素是多重糖基化蛋白。由于糖残基的变化和不同的唾液酸化 (sialidation)度，不同糖基化形式和同工型存在于自然界和生物技术生产中。高比例的重复单元也对体内活性具有积极影响(参见例如EP 0 409113)。促红细胞生成素由十种主要同工型组成。术语“同工型”是指一组具有同一氨基酸序列和相同数量的结合唾液酸残基的EPO分子。同工型具有相同的等电点，但在程度、复杂性和与氨基酸序列结合的糖残基的触角方面不同。例如，术语“ΕΡ0的同工型2”包括一组具有14个唾液酸残基的EPO分子。同工型3具有13个唾液酸，以此类推。此外，具有不在末端的另外的唾液酸的EPO形式很少。因此，同工型1具有15个与糖残基结合的唾液酸， 同工型1 ‘具有16个与糖残基结合的唾液酸。本发明的一方面是用于制备具有促红细胞生成素同工型分布的、高纯度的促红细胞生成素的方法，其中所述方法包括不同层析步骤的组合，组合的方式使得初始的促红细胞生成素同工型分布改变。该方法的不同层析步骤包括应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤和至少一个选自下列的层析步骤i)染料亲和层析、ii)疏水相互作用层析、iii)阴离子交换层析、iv)反相层析和/或ν)凝胶渗透层析。在该方面的一个实施方案中，具有减少的唾液酸残基数的促红细胞生成素同工型被去除或完全分离。在本申请中，术语“完全”意指相应的化合物再也不能用给定的分析方法检测，因为浓度/量低于方法的检测限。在一个实施方案中，每个促红细胞生成素分子多达3个或4个或5个(包括5个)唾液酸残基的促红细胞生成素同工型被去除或完全分离。在一个实施方案中，获得促红细胞生成素，其中该同工型混合物包括具有6至15个唾液酸基团或具有7至15个唾液酸基团的同工型。除各种糖残基和同工型之外，存在更多的EPO形式。在脱氮-EPO和脱氧-EPO形式的情况下，存在还未完全翻译后糖基化并在丝氨酸残基126(脱氧-ΕΡ0)或天冬酰胺残基 24(脱氮-ΕΡ0)上未糖基化的种类。羟磷灰石是基于磷酸钙的无机化合物，其具有经验式Qi5 (PO4) 30H。作为层析固定相，其适于分离蛋白质、酶、免疫球蛋白和核酸。它实际上主要存在于骨和牙釉质中。高PH 值有助于羟磷灰石的形成。羟磷灰石在酸性PH值下溶解。羟磷灰石的各种结合机理用于层析分离中，其中它主要用作吸附剂但也具有离子交换材料的性质。有可能在蛋白质的带正电荷的氨基(例如赖氨酸)和固定相的带负电荷的磷酸基之间形成离子键。此外，蛋白质的羧基(例如天冬酰胺)可与羟磷灰石的钙离子结合。该材料的特征是复合结合可在固定相的磷酸基与溶液中的钙或镁离子和蛋白质的羧基之间发生(M. Kratzel,"Pharmazeutische Bioanalytik，，第 5 章，University ofVienna)。各种羟磷灰石材料是已知的。促红细胞生成素与该基质结合，在一个实施方案中， 在低磷酸盐浓度下被洗脱。在根据本发明方法的一个实施方案中，含有羟磷灰石的固定相由掺合到琼脂糖主链中的羟磷灰石组成。适宜的柱材料例如是羟磷灰石Ultrogel (Biokpra，德国)或HA Biogel HT(Biorad，德国)。有利的是，在约中性的pH进行层析。与纯的羟磷灰石(例如以HA Ultrogel形式可得)相比，嵌入琼脂糖基质中的羟磷灰石具有较高的耐压性。该材料具有非均勻的50 μ m至160 μ m的粒径分布，其中主要部分为70 μ m至90 μ m。表面非常粗糙，颗粒仅在一定程度上呈球形。在不同的实施方案中，用于根据本发明方法的含有羟磷灰石的固定相由在高温和高压下烧结的纯羟磷灰石(例如以来自BioRad的CHT-陶瓷羟磷灰石的形式可得)组成。这是耐压性材料，且由颗粒组成，所述颗粒是相对对称和均勻球形的，且具有相对光滑的表面。对CHT-I型而言，颗粒具有约40 μ m的大小，比表面积为约40m2/g。平均粒径为 20μπι-30μπι。CHT材料2型专门针对较大的分子例如免疫球蛋白开发。CHT-2型的比表面积为19m2/g，因此约为CHT-I型的一半。该颗粒具有与CHT-I型相似的形态。该颗粒也具有40 μ m的大小。因此，在根据本发明方法的一个实施方案中，含有羟磷灰石的固定相是在高温和高压下烧结的羟磷灰石，比表面积为约40m2/g。在进一步的实施方案中，用于根据本发明方法的含有羟磷灰石的固定相由纯结晶羟磷灰石(例如以来自Calbiochem的羟磷灰石i^ast Flow形式可得)。颗粒是菱形的，并且具有50 μ m-100 μ m的大小。
图1显示了促红细胞生成素在含有羟磷灰石的固定相(HA-Ultrogel)上层析的层析图示例。框内区域是分馏的产物峰，其被细分成馏分1-16。馏分17是峰肩，其以单独馏分形式收集。越过峰后各个馏分的纯度几乎线性地下降(参见图2)。采用与实施例4中所述相同的用于纯化促红细胞生成素的层析方法，对所述不同的含有羟磷灰石的固定相进行比较。表1 来自EPO层析的数据的概述
权利要求
1.用于纯化促红细胞生成素的方法，其包括a)提供含有i)促红细胞生成素和ii)第一钙离子浓度的溶液，b)提供包含含有羟磷灰石的固定相的层析柱，c)将含有第二钙离子浓度的溶液施加到b)的柱子上，d)将a)的溶液施加到c)中所得的柱子上，e)将含有第三钙离子浓度的溶液施加到d)中所得的柱子上，和f)通过将含有第四钙离子浓度的溶液施加到e)中所得的柱子上而回收纯化的促红细胞生成素，其中所述第一钙离子浓度和第二钙离子浓度是相等的，所述第三钙离子浓度和第四钙离子浓度是相等的，且低于所述第一钙离子浓度和第二钙离子浓度。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述第三钙离子浓度和第四钙离子浓度为 0. 5mM或更低。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于第一钙离子浓度和第二钙离子浓度为 5mM。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述步骤c)和e)的溶液包含2-丙
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤e)和f)的溶液包含5mM磷酸盐离子浓度，优选为磷酸钠或磷酸钾的形式。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤a) TRIS-HCl、5mM CaCl2、pH 6. 9士0.2。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤c) TRIS-HCl、5mM CaCl2、0. 25M NaCU9% (ν/ν) 2-丙醇、pH6. 9士0. 2。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤e) TRIS-HCl、0. 25M NaCl,9% (ν/ν) 2-丙醇、pH 6. 9士0.2。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤f) TRIS-HCUpH 6. 9 士 0. 2。
10.使用如下顺序的层析步骤生产促红细胞生成素的方法 i)亲和层析、 )疏水相互作用层析、 iii)在含有羟磷灰石的固定相上层析， 其中根据前述权利要求中任一项的方法，进行所述在含有羟磷灰石的固定相上的层析。
11.生产促红细胞生成素的方法，其包括培养含有编码EPO的核酸的细胞并从细胞或培养基中分离促红细胞生成素，其特征在于促红细胞生成素的分离包括下列步骤i)将细胞上清液施加到亲和层析材料上，并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分， )任选地将来自i)的含有促红细胞生成素的馏分施加到疏水相互作用层析材料上， 并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分，iii)使用根据权利要求1至9之一的方法，将来自i)或ii)的含有促红细胞生成素的馏分施加到含有羟磷灰石的固定相上，并回收/收集含有促红细胞生成素的馏分。的溶液包含20mM 的溶液包含20mM 的溶液包含20mM 的溶液包含IOmM
12.生产单-聚乙二醇化促红细胞生成素的方法，其包括下列步骤i)使用分子量为20kDa至40kDa的活化PEG将促红细胞生成素聚乙二醇化， )用采用相同固定相的两个连续的阳离子交换层析步骤，纯化步骤i)中所得的聚乙二醇化促红细胞生成素，iii)回收并由此从第二固定相中生产单-聚乙二醇化促红细胞生成素，其中步骤i)中所用的促红细胞生成素已由根据权利要求1至9中任一项的方法获得。
13.促红细胞生成素，其已由根据权利要求1至12中任一项的方法获得。
14.促红细胞生成素，其特征在于其是促红细胞生成素同工型的混合物，其中每个促红细胞生成素分子具有大于等于6且小于等于17个数量的唾液酸残基，并且四触角糖基形式、三触角糖基形式和双触角糖基形式的比率范围为83 14 2至74 21 6。
15.促红细胞生成素，其特征在于其是促红细胞生成素同工型的混合物，其中每个促红细胞生成素分子具有大于等于6且小于等于17个数量的唾液酸残基，且四触角糖基形式、具有一个重复单元的四触角糖基形式、具有两个重复单元的四触角糖基形式、 三触角糖基形式、具有一个重复单元的三触角糖基形式、双触角糖基形式的比率范围为 43 28 12 8 6 2g45 21 7 14 7 6。
16.药物组合物，其含有根据权利要求13或14或15的促红细胞生成素以及任选地药用稀释剂、辅助剂和/或载体剂。
17.用于在促红细胞生成素中去除CHO细胞蛋白质的方法，其包括根据权利要求1-9中任一项的应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤，其中含有EPO的馏分的收集由280nm波长处的光吸收控制，收集在15mAU至75mAU的吸收时开始，并在峰最大值越过后在200mAU 至40mAU的吸收时终止，并且含有羟磷灰石的固定相是纯的结晶羟磷灰石，该溶液具有5mM 的磷酸盐离子浓度。
全文摘要
在本发明中，记述了用于纯化促红细胞生成素的方法，其包括至少一个应用含有羟磷灰石的固定相的层析步骤。该方法包括下列步骤i)即在促红细胞生成素与含有羟磷灰石的固定相结合的条件下，将含有钙离子的溶液中的促红细胞生成素与用含有钙离子的溶液平衡的含有羟磷灰石的固定相接触，ii)将含有比前述溶液较少钙离子的溶液通过来自i)的含有羟磷灰石的固定相，促红细胞生成素未从含有羟磷灰石的固定相中分离，和iii)将含有低于0.5mM钙离子的另一溶液通过来自ii)的含有羟磷灰石的固定相，由此将促红细胞生成素从含有羟磷灰石的固定相中分离。
文档编号C07K14/505GK102164954SQ200980137210
公开日2011年8月24日 申请日期2009年9月21日 优先权日2008年9月23日
发明者A·施梅尔泽, C·施马尔兹 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司