00 Mm孔径的筛用于该目的，其 中剩余的残余水分约为50%。
[0041] 当将生产规模放大时，研宄合适的过滤方法。在这方面，在相对粗的滤器上进行第 一过滤步骤。这防止滤器被堵塞，并且主要旨在分离苔藓和上清液。在澄清过滤过程中的 深度过滤作用不是非常显著。
[0042] 在第一过滤步骤中，采用袋式过滤（Eaton公司；盒类型：TBF-0101-AD10- 050D， 袋式滤器商品号：F5869549;体积13 L)。滤器位于具有弯曲基底面的盒部件上，其中所 述部件在基底面和在部件壁上筛状穿孔。过滤是成功的，但是分离的苔藓中的残余水分非 常高并且无法通过压缩空气（1-3 bar)将其从苔藓中挤出。
[0043] 在通过移除滤饼并用手将其挤出完成过滤后，测定细胞外残余水分。挤出的液体 与保留的苔藓材料的体积比较产生约50%的比例。这伴随着未分开测量的高产物损失。
[0044] 比较例2 : 在规模扩大实验中以与比较例1类似的方式，将具有重组产生的抗体的上清液通过过 滤从产生其的苔藓组织中分离。使用具有弯曲的基底面的可选盒部件，其中这次其仅在部 件的基底面处筛状穿孔。由此应当确保压缩空气将均匀地在滤饼上泄出并且将残余水分从 苔藓残余物中移除。然而，实际情况不是这样。如比较例1中所述测定残余水分，其仍然为 约50% (重量％)。
[0045] 实施例1:大体积过滤 开发新型滤器盒，其旨在在分离的植物细胞中产生更低的残余水分。该新型盒显示于 图1中。滤器盒的特征在于作为滤器材料的平面基座的筛状部件（4)。盒壁不充当过滤面。 所有经过滤的流体必须经过通向出口的平面基底板。在动物细胞的情况下，由于小的过滤 表面，该滤器将非常快地趋于堵塞。然而，在植物细胞的情况下，已观察到不仅过滤可以以 高体积（> 5 L)进行，而且令人惊奇地，其具有产生低残余水分的优点。
[0046] 将该盒装配有Seitz K900滤片（孔径8-20Mm;Pall)。将盒设计用于规模放 大至500 L并可以规模放大至任何培养物上清液的体积。用该滤器盒的测试提供了良好数 据。用500 L培养物液体和低生物质（0.5 g/L)运行的测试以及用100 L的培养物液体与 高生物质（4-7 g/L)的几次测试能够获得在滤饼中0 %的细胞外残余水分(如比较例1中 所测定)。这意味着该模块中的培养物液体的上清液被接连地挤压穿过整个滤饼，然后是滤 器并挤压出滤器盒。抗体的产物损失（以mg/L计）也降至非常低（4%-13% -表1中的步骤 1)。此处的损失仅仅是由于产物在苔藓饼或滤器中的非特定存留，而非由于培养物上清液 被保留在滤饼中。
[0047] 实施例2 :深度和无菌过滤 将实施例1的滤液进一步过滤以进行深度和无菌过滤：对于深度过滤，用Seitz K700 滤片（孔径6 - 12Mm;Pall)和Seitz KS50滤片（孔径0?4-1Mm;Pall)进行过滤。这 些过滤可以在一个盒和一次通过中连续进行，或者在分开的盒中单独进行。选择滤器间的 间隙以使得为苔藓细胞或细胞碎片留有足够空间。按照SUPRAdisc? (Pall)和Supracap? 100 (Pall)系统将滤器安装在两个平行的通道中（Supradisc滤器：300P700S205SP和 200P050S205SP; Supracap 滤器：NP6P7001 和 NP6P0501)。
[0048] 对于无菌过滤，将滤液进一步用Sartopore2滤片（孔径0? 2Mm;Sartorius)过 滤。
[0049] 实施例3 :结果 已开发的滤器盒保证了优化的固体-液体分离。形成基本上无残余水分的固体滤饼， 并且因此保持产物损失低。整个方法确保进一步的纯化步骤可以顺利地进行，而不会堵塞 滤器。
[0050] 图2和3显示了结果。它们显示经过滤纯化悬浮材料通过浊度测量（NTU)的分 析和经过滤的抗体损失的变化，其中分别在深度过滤过程中使用Supradisc系统用于纯化 (图2)和使用Supracap系统用于纯化（图3)。表1概述了产物损失。
[0051] 表1:通过Supradisc和Supracap系统纯化过程中的产物损失
【主权项】
1. 用于分离液体上清液和细胞的方法，其包括以下步骤： a) 提供细胞与液体的混合物， b) 用所述混合物充装滤器盒，其中在所述滤器盒中，在平的基底面上提供具有范围为4 Mffl-50Mm的孔径的第一滤器，并且所述滤器盒的壁紧密地与筛状穿孔的平的基底面相连， c) 向所述混合物施加至少0. 5bar的差压，由此将所述混合物的液体部分挤压穿过滤 器，并且含有细胞的滤饼保留在滤器盒中， d) 移除经过滤的液体。
2. 权利要求1的方法，其特征在于所述滤器盒的内体积为至少2L。
3. 权利要求1或2的方法，其特征在于将至少10L的上清液过滤。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于细胞在所述方法中不破裂。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于在移除位置的绝对压力为至少0. 7bar。
6. 权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于差压为至少0. 8bar，优选至少Ibar。
7. 权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于所述滤器盒是高压容器，尤其是设计用 于至少2bar、尤其优选至少5bar的压力的高压容器。
8. 权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于在所述方法过程中温度范围为 (TC-40。。。
9. 权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于所述滤饼不用额外的液体洗涤和/或其 中通过压缩空气将液体从滤饼中排出。
10. 权利要求1-9中任一项的方法，其进一步包括步骤：el)用具有比第一滤器孔径更 小的孔径的第二滤器进一步过滤步骤d)中获得的经过滤的液体，其中所述第二滤器的孔径 范围为IMm_20Mm。
11. 权利要求1-10中任一项的方法，其进一步包括步骤：e2)用具有比第二滤器孔径更 小的孔径的第三滤器进一步过滤步骤d)或el)中获得的经过滤的液体，其中所述第三滤器 的孔径范围为0.3Mm-10Mm。
12. 权利要求10或11的方法，其进一步包括步骤：f)用具有比第三滤器孔径更小的孔 径的第四滤器进一步过滤步骤el)或e2)中获得的经过滤的液体，其中所述第三滤器的孔 径范围为0. 05Mm-2Mm。
13. 权利要求1-12中任一项的方法，其特征在于所述细胞是植物细胞，尤其是苔藓细 胞，优选叶苔细胞，尤其优选小立碗藓细胞。
14. 权利要求1-13中任一项的方法，其特征在于由细胞产生的重组蛋白在液体上清液 中和/或通过过滤液体纯化上清液中的重组蛋白。
15. 工具套装，其具有如权利要求1、2或7中任一项定义的滤器盒和具有范围为4 Mm-50Mm的孔径的第一滤器，优选额外具有如权利要求10-12中定义的第二、第三和/或第 四滤器，特别为了从由细胞形成的滤饼中移除水分。
【专利摘要】本发明涉及用于分离液体上清液和细胞的方法，其包括步骤：提供细胞与液体的混合物，用所述混合物充装第一滤器盒，其中在所述滤器盒中，在筛状穿孔的平的基底面上提供具有4μm-50μm的孔径的滤器，并且所述滤器盒的壁紧密地与筛状穿孔的平的基底面相连，向所述混合物施加至少0.5bar的差压，由此将所述混合物的液体部分挤压穿过滤器，并且含有细胞的滤饼保留在滤器盒中，和移除经过滤的液体。
【IPC分类】C12N5-04, C12P21-00
【公开号】CN104769102
【申请号】CN201380038651
【发明人】T.格罗斯塞, H.尼伊德克雷格, A.沙亚夫
【申请人】格林诺瓦森生物技术股份有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2013年7月19日
【公告号】CA2882100A1, EP2687592A1, EP2875123A1, US20150147811, WO2014013045A1