专利名称：用于细胞培养的载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于细胞培养的载体及其制备方法，属于生物材料领域。
背景技术：
石墨烯是一种新型的碳纳米材料，具有独特的二维平面结构，已被应用于柔性透明电极、增强材料等领域；同时在生物医学领域，石墨烯近年来也备受关注，已被用于细胞成像、药物输运、生物分析、干细胞工程及肿瘤治疗方面研究。海绵状三维多孔石墨烯材料首先由沈阳金属所成会明等发现，其合成方法通常为，以泡沫镍为催化剂，有机气体如甲烷为碳源，采用化学气相沉积法(CVD)制备含有催化剂的三维多孔石墨烯材料，然后腐蚀去除催化剂后得到海绵状三维多孔石墨烯材料。这种方法制备的石墨烯材料具有优良的电学、力学性能，可进一步应用于生物芯片、植入材料等 生物医学领域。组织器官中的细胞均在三维环境中生长，因此在目前二维平面的细胞培养皿或石墨烯衬底上培养细胞时，受平面生长环境的限制，细胞的活性、形貌和生长状态等与体内环境下相比有很大改变，因此探索将海绵状三维多孔石墨烯应用于细胞培养具有重要的价值；并且，由于细胞培养对材料的杂质含量和加工过程有很高的要求,如何制备具有高导电率、超轻多孔、良好生物相容性的三维多孔石墨烯也是亟待解决的难题。
发明内容
针对上述提到的现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于细胞培养的载体及其制备方法，该细胞培养载体实现了细胞的三维培养，模拟细胞的体内生长环境，有利于维持细胞的生长状态和活性，促进细胞生长。为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案
一种用于细胞培养的载体，所述载体为三维多孔石墨烯支架。进一步的，所述三维多孔石墨烯支架的外表修饰有生物活性分子，所述生物活性分子可以是多聚赖氨酸或层粘连蛋白。优选的,所述三维多孔石墨烯支架的孔径为20-500微米,密度为2-20 mg/cm3。将所述的三维多孔石墨烯支架固定于透明聚苯乙烯或玻璃材料基底上，并在三维多孔石墨烯支架的周围固定液池壁，形成培养池，用于细胞培养；所培养的细胞至少为肿瘤细胞、原代神经细胞和神经干细胞中的一种或几种。如上所述的用于细胞培养的载体的制备方法，它包括以下步骤
(a)应用化学气相沉积工艺在金属泡沫支架上制备三维多孔石墨烯支架；
(b)将含有金属泡沫支架的三维多孔石墨烯浸泡在酒精和水的混合溶剂中5-20min ；采用真空抽气去除三维多孔石墨烯支架表面吸附的空气；
(c)在封闭容器中，采用用酸性腐蚀液去除金属泡沫支架,然后依次采用1，0.1，0.01，O. 001 mol/L的盐酸或硝酸溶液各洗涤I次，再以去离子水洗涤数次；得到用于细胞培养的载体三维多孔石墨烯支架。优选的，步骤(b)中真空抽气后压力小于IOkPa,并保持至少30分钟。优选的，所述金属催化剂为泡沫镍、泡沫铜、泡沫金铜合金或泡沫镍铜合金。与现有技术相比，本发明的优点至少在于
(1)本发明提供的细胞培养载体，在三维多孔石墨烯支架结构上培养细胞，由于三维多孔石墨烯材料的多孔结构具有超高孔隙率，为细胞生长提供充足空间，实现细胞的三维培养，模拟了细胞的体内生长环境，有利于维持细胞的生长状态和活性，促进细胞生长；而且经本方法处理的三维多孔石墨烯能够保持本征石墨烯优良的力学、电学、电化学性能，满足调控细胞生长和分化等需求；
(2)本发明在制备用作基底的三维多孔石墨烯支架的过程中，在去除催化剂模板前，首先采用溶剂浸润三维多孔石墨烯支架，避免材料因表面张力和密度的原因漂浮在液体表 面，并抽真空去除材料表面吸附的空气，提高腐蚀液的浸润性，且在封闭环境中进行浸泡处理，有效避免了腐蚀液的挥发及凝结，更易在后续处理过程中去除金属和离子的残余，从而显著提高材料的生物相容性和处理过程的可重复性；有效避免催化剂和腐蚀剂残留在石墨烯支架中，提高了培养细胞的活性和存活率。
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图I是本发明一较佳实施例中含有三维多孔石墨烯支架的培养池的结构示意图； 图2是本发明实施例中的三维多孔石墨烯支架表面培养PC 12细胞，经β-微管蛋白
(Tubulin)免疫荧光染色后的荧光照片；
图3是本发明实施例中三维多孔石墨烯支架的扫描电镜照片。
具体实施例方式针对现有技术中的缺陷与不足，经长期研究和实践，本发明提出了利用三维多孔石墨烯支架作为细胞培养载体的构想及这种用于细胞培养的载体的制备方法。该用于细胞培养的载体为三维多孔石墨烯支架2 ;所述三维多孔石墨烯支架2的外表可以修饰有生物活性分子，所述生物活性分子可以是多聚赖氨酸或层粘连蛋白；所述三维多孔石墨烯支架2的孔径为20-500微米，密度为2-20 mg/cm3。如图I所示，将所述的三维多孔石墨烯支架2固定于透明聚苯乙烯或玻璃材料基底I上，并在三维多孔石墨烯支架的周围固定液池壁4，形成培养池；然后采用丙酮、异丙醇、酒精清洗去除有机物残留，再用大量去离子水浸泡三维多孔石墨烯支架2以进一步去除可溶性有毒物质；在培养池中注入培养基形成液池3，用于细胞培养；所培养的细胞至少为肿瘤细胞、原代神经细胞和神经干细胞中的一种或几种。本发明还提供了一种制作用于细胞培养的载体的制备方法，其主要包括下列步骤首先，采用传统CVD的方法，以孔隙率约为95%的金属泡沫为催化剂，在1000 °C条件下，以甲烷为碳源制备单层或少层石墨烯，制备有金属泡沫的三维多孔石墨烯支架；其次，将含有金属泡沫的三维多孔石墨烯浸泡在酒精和水的混合溶剂中5-20 min，采用真空抽气去除三维多孔石墨烯支架表面吸附的空气；然后，在封闭容器中，采用用酸性腐蚀液去除金属泡沫，最后依次采用1，0.1，0.01，O. 001 mol/L的盐酸或硝酸溶液各洗涤一次，再以去离子水洗涤数次得到三维多孔石墨烯支架。其中，三维多孔石墨烯支架的孔径由泡沫镍的孔径结构决定，密度与材料的层数有关。优选的，三维多孔石墨烯支架层数为五至十层，孔径在100-300微米之间，密度在密度为2-20 mg/cm3。藉由本发明，可同时实现各类细胞在石墨烯表面的三维培养，为进一步石墨烯基生物医学应用提供技术支持。以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步说明。实施例I 采用CVD的方法，以孔隙率95 %、孔径在30-300微米的泡沫镍为催化剂，在900 °〇条件下，以甲烷为碳源生长5-10层石墨烯。将含有催化剂镍的三维多孔石墨烯支架浸泡在含75 %酒精的水溶液中10 min，抽气使压力小于10 kPa，保持30 min，去除三维多孔石墨烯支架表面吸附的空气；然后通入空气至常压后，加入1000倍体积的酸性氯化铁腐蚀液，在密封环境中浸泡24 h以去除催化剂镍；然后依次采用1，0.1，0.01, O. 001 mol/L的盐酸溶液各洗涤I次，再用去离子水洗涤3次。制得的三维多孔石墨烯支架干燥后孔径在20-300微米之间，比泡沫镍模板的孔径略有减小，密度约为4-5 mg/cm3。用玻璃基底将三维多孔石墨烯支架捞起，直接采用道康宁3140硅酮粘合剂固定，将液池壁固定于三维多孔石墨烯支架的周围，并在室温条件下固化时间12 h，形成培养池；继而用丙酮处理5 h，随后用异丙醇清洗0.5 h，然后用大量的去离子水清洗，并浸泡120 h。将制得的用于细胞培养的载体浸泡于I mg/mL的多聚赖氨酸PBS溶液中12 h，然后用大量的灭菌PBS缓冲液冲洗。向培养池中注入含15%血清培养基，并浸泡2 h，用于PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株)的培养，培养基为含15 %胎牛血清的DMEM，接种密度为IO5细胞/cm2。培养结果显示生长的细胞胞体丰满、胞浆透明、细胞边缘折光率高，生长状态良好，如图2所示。实施例2
采用CVD的方法，以孔隙率95 %、孔径在100-300微米的泡沫铜为催化剂，在950 °〇条件下，以甲烷为碳源生长10-20层石墨烯。将含有催化剂镍的三维多孔石墨烯支架浸泡在含98 %酒精的水溶液中20 min，抽气使压力至100 Pa，保持30 min，去除三维多孔石墨烯支架表面吸附的空气；然后通入空气至常压后，加入100倍体积的酸性腐蚀液以去除催化剂镍；然后依次采用1，O. I, O. 01 mol/L的硝酸溶液各洗涤I次，再用去离子水洗涤6次。制得的三维多孔石墨烯支架干燥后孔径在100-300微米之间,密度约为5-8 mg/cm3,形貌如图3所示。用玻璃基底将三维多孔石墨支架烯捞起，干燥后直接采用道康宁3140硅酮粘合剂固定，将液池壁固定于三维多孔石墨烯支架的周围，并在室温条件下固化时间24h，形成培养池；继而用丙酮处理2 h，随后用酒精清洗2 h，然后用大量的去离子水清洗，并浸泡24h。将制得的用于细胞培养的载体浸泡于I mg/mL的多聚赖氨酸PBS溶液中12 h，然后用大量的灭菌PBS缓冲液冲洗；向培养池中注入含15%血清的DMEM培养基，可用于PC12细胞培养。实施例3
采用CVD的方法，以孔隙率95 %、孔径在300-500微米的泡沫金铜合金为催化剂，在750°C条件下，以甲烷为碳源生长50-100层石墨烯。将含有催化剂镍的三维多孔石墨烯支架浸泡在含2 %酒精的水溶液中60 min，抽气使压力小于10 kPa，保持30 min，去除三维多孔石墨烯支架表面吸附的空气；然后通入空气至常压后，加入1000倍体积的酸性氯化铁腐蚀液以去除催化剂镍；然后依次采用1，O. I, O. 01，O. 001, O. 0001 mol/L的盐酸溶液各洗涤I次，再用去离子水洗涤3次。制得的三维多孔石墨烯支架干燥后孔径在300-500微米之间，密度约为15-20 mg/cm3。使用组织培养用途的聚苯乙烯(TCPS)基底将三维多孔石墨烯捞起，直接采用道 康宁3140硅酮粘合剂固定，将液池壁固定于三维多孔石墨烯支架的周围，并在室温条件下固化时间48h，形成培养池；继而用酒精处理5 h，然后用大量的去离子水清洗，并浸泡I h。将制得的用于细胞培养的载体浸泡于10 mg/mL的多聚赖氨酸PBS溶液中24 h，然后用大量的灭菌PBS缓冲液冲洗。向培养池中注入含15%血清培养基，并浸泡2 h，用于原代海马神经细胞的培养，培养基为含15%胎牛血清的DMEM，接种密度为IO6细胞/cm2。培养结果显示三维多孔石墨烯支架的生物相容性良好，细胞生长状态、MTT检测结果显示，细胞生长状态均优于其在二维平面石墨烯和TCPS衬底上的生长状态，细胞存活率提高50 %。实施例4
采用CVD的方法，以孔隙率95 %、孔径在100-300微米的泡沫铜镍合金为催化剂，在900°〇条件下，以甲烷为碳源生长1-5层石墨烯。将含有催化剂镍的三维多孔石墨烯支架浸泡在含50 %酒精的水溶液中5 min，抽气使压力小于100 Pa，保持30 min，去除三维多孔石墨烯支架表面吸附的空气；然后通入空气至常压后，加入100倍体积的酸性硝酸铁腐蚀液以去除催化剂镍；然后依次采用O. 1，0.01 mol/L的硝酸溶液各洗涤I次，再用去离子水洗涤3次。制得的三维多孔石墨烯支架干燥后孔径在50-300微米之间，比泡沫镍模板的孔径略有减小，密度约为2-3 mg/cm3。用TCPS基底将三维多孔石墨烯支架捞起，直接采用道康宁3140硅酮粘合剂固定，将液池壁固定于三维多孔石墨烯支架的周围，并在室温条件下固化时间24h，形成培养池；继而用丙酮处理5 h，然后用大量的去离子水清洗，并浸泡48 h。将制得的用于细胞培养的载体浸泡于I mg/mL的多聚赖氨酸PBS溶液中12 h，然后用大量的灭菌PBS缓冲液冲洗。向培养池中注入含15%血清培养基，并浸泡10 h，用于原代海马神经细胞的培养。实施例5
采用CVD的方法，以孔隙率95 %、孔径在100-300微米的泡沫镍为催化剂，在900 V条件下，以甲烷为碳源生长5-10层石墨烯。将含有催化剂镍的三维多孔石墨烯支架浸泡在含75 %酒精的水溶液中20 min，抽气使压力小于10 kPa，保持50 min，去除三维多孔石墨烯支架表面吸附的空气；然后通入空气至常压后，加入1000倍体积的酸性氯化铁腐蚀液，在密封容器中浸泡24 h以去除催化剂镍；然后依次采用1，O. I, O. 01，O. 001 mol/L的盐酸溶液各洗涤I次，再用去离子水洗涤6次。制得的三维多孔石墨烯支架干燥后孔径在100-300微米之间，比泡沫镍模板的孔径略有减小，密度约为4-5 mg/cm3。用玻璃基底将三维多孔石墨烯捞起，直接采用道康宁3140硅酮粘合剂固定，将液池壁固定于三维多孔石墨烯支架的周围，并在室温条件下固化时间12 h，形成培养池；继而用丙酮、异丙醇和酒精各处理I h，然后用大量的去离子水清洗，并浸泡120 h。将培养池中的三维多孔石墨烯支架采用生物亲和分子层粘连蛋白O. lyg/mL修饰120 h，然后用大量的灭菌PBS缓冲液冲洗。采用选择培养基筛选方法，培养得到神经球样小鼠神经干细胞，采用单细胞分散的方法在三维多孔石墨烯支架表面接种细胞，密度为IO4细胞/cm2。两天后MTT及LDH酶活性检测结果显示，该三维多孔石墨烯载体具有良好的生物相容性，与TCPS (对照组)相比，存活率为对照组光吸收值的98%，LDH分析结果是对照组荧光光强的101%，两者表面相对细胞存活率、膜完整性无统计学显著差异；而在去除催化剂模板前，不采用溶剂浸润三维多孔石墨烯支架，以及不经过抽真空去除材料表面吸附的空气制备的三维石墨烯衬底表面细胞存活率仅为 40%，LDH酶活性(反比于细胞膜完整性)为 400%。
实施例6
采用CVD的方法，以孔隙率90 %、孔径在100-400微米的泡沫镍为催化剂，在900 °〇条件下，以甲烷为碳源生长10-20层石墨烯。将含有催化剂镍的三维多孔石墨烯浸泡在含75%酒精的水溶液中20 min，抽气使压力小于100 Pa，保持30 min，去除三维多孔石墨烯支架表面吸附的空气；然后通入空气至常压后，加入1000倍体积的酸性氯化铁(I mol/L)溶液，在密闭环境中腐蚀120 h去除催化剂镍；然后依次采用1，0.1，0.01, O. 001 mol/L的盐酸溶液各洗涤I次，再用去离子水洗涤6次。制得的三维多孔石墨烯支架干燥后孔径在50-300微米之间，密度约为4-6 mg/cm3。用玻璃基底将三维多孔石墨烯捞起，直接采用道康宁3140硅酮粘合剂固定，将液池壁固定于三维多孔石墨烯支架的周围，并在室温条件下固化时间12 h，形成培养池；继而用丙酮、异丙醇和酒精各处理2 h，然后用大量的去离子水清洗，并浸泡120 h。向培养池中注入含10 %血清的DMEM培养基，并浸泡12 h，用于小鼠骨髓间充质干细胞的培养。需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。以上所述仅是本申请的具体实施方式
，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
权利要求
1.一种用于细胞培养的载体，其特征在于，所述载体为三维多孔石墨烯支架。
2.根据权利要求I所述的用于细胞培养的载体，其特征在于，所述三维多孔石墨烯支架的外表修饰有生物活性分子。
3.根据权利要求2所述的用于细胞培养的载体，其特征在于，所述生物活性分子为多聚赖氨酸或层粘连蛋白。
4.根据权利要求I或2所述的用于细胞培养的载体，其特征在于，所述三维多孔石墨烯支架的孔径为20-500微米，密度为2-20 mg/cm3。
5.根据权利要求I所述的用于细胞培养的载体，其特征在于，该载体所培养的细胞至少为肿瘤细胞、原代神经细胞和神经干细胞中的一种或几种。
6.权利要求I至5任一所述的用于细胞培养的载体的制备方法，其特征 在于，它包括以下步骤 (a)制备含有金属泡沫的三维多孔石墨烯支架； (b)用酒精和水的混合溶剂浸润步骤(a)获得的三维多孔石墨烯支架，采用真空抽气去除三维多孔石墨烯支架表面吸附的空气； (C)在封闭容器中，去除三维多孔石墨烯支架中的金属泡沫。
7.根据权利要求6所述的用于细胞培养的载体制备方法，其特征在于，所述金属泡沫为泡沫镍、泡沫铜、泡沫金铜合金或泡沫镍铜合金。
8.根据权利要求6所述的用于细胞培养的载体制备方法，其特征在于，步骤(b)中真空抽气后压力小于IOkPa,并保持至少30分钟。
全文摘要
本发明公开了一种用于细胞培养的载体，所述载体为三维多孔石墨烯支架；将所述三维多孔石墨烯支架固定于透明聚苯乙烯或玻璃材料基底上，在其周围固定液池壁形成培养池，用于细胞培养；本发明还公开了一种用于细胞培养的载体的制备方法，与现有技术相比，在去除金属催化剂模板前，先采用溶剂浸润三维多孔石墨烯支架，然后采用真空抽气去除支架表面吸附的空气；避免材料因表面张力和密度的原因漂浮在液体表面，更易在后续处理过程中去除金属和离子的残余。本发明采用三维多孔石墨烯支架作为培养载体，实现了细胞的三维培养，模拟细胞的体内生长环境，有利于维持细胞的生长状态和活性，促进细胞生长。
文档编号C12N5/09GK102864119SQ201210364420
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者程国胜, 张琦, 李宁, 宋琴, 徐骏, 杜瑜扬, 唐明亮, 齐琳, 王龙, 姜自云, 刘立伟 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所