表达信号肽替换的呼吸道合胞病毒f蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达信号肽替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法，所述的耐热疫苗株分类命名为rTS?tF/RSV，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201625。该疫苗株在感染动物或细胞后，可高效表达呼吸道合胞病毒的截短F蛋白，自带的tPAs可增强截短F蛋白的分泌表达及免疫原性。该毒株可用于制备呼吸道合胞病毒亚单位耐热活疫苗。CCTCC NO: V20162520160419
【专利说明】
表达信号化替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐热 疫苗株及制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及一种表达信号肤替换的呼吸道合胞病毒F 蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。
【背景技术】
[0002] 呼吸道合胞病毒（RespiratoiT syn巧tial vi;rus，RSV)是引起婴幼儿下呼吸道感 染的重要病原，导致支气管炎和肺炎，严重时可致患者死亡，给婴幼儿的健康和生命安全带 来巨大威胁。接种疫苗是预防病毒性疾病的有效手段。为了有效预防RSV感染性疾病，人们 一直在研制RSV疫苗，但是目前仍没有疫苗获得许可上市。因此，研发安全有效的RSV疫苗是 预防RSV感染的首要任务。位于RSV病毒粒子表面的糖蛋白--融合蛋白（fusion protein， 巧是其主要的保护性抗原，也是研制RSV亚单位疫苗的首选组分之一。
[0003] 随着分子生物学技术的不断进步，新型基因工程疫苗的研发不断取得突破，其中 基于新城疫病毒载体的新型多联活疫苗是研发热点之一，许多病原的免疫原性基因已经在 新城疫载体内成功表达，并取得了较好的免疫保护效果，如传染性法氏囊病毒的VP2蛋白、 H5亚型禽流感病毒的HA蛋白、狂犬病毒的G糖蛋白、严重急性呼吸综合征病毒的CoV蛋白、人 类免疫缺陷病毒的Gag蛋白等。此类疫苗具有可诱导全身性免疫(体液免疫、细胞免疫和粘 膜免疫）、高鸡胚生长特性、生产成本低廉、免疫方式简便(饮水、气雾、点眼/滴鼻等方式）、 安全(毒株间发生重组及毒力返强可能性极小)等优点。但现有的新城疫病毒载体疫苗均是 W非耐热型新城疫病毒为骨架构建的。
[0004] 疫苗的免疫原性主要依靠抗原数量和抗原递呈效率。理论上来说，定位于细胞质 的抗原能更有效地诱导免疫反应。组织型纤溶酶原激活因子信号序列(tPAs)是一个特异的 蛋白分选信号，它直接把表达的抗原分选至内质网。与巧As融合后，日本乙型脑炎病毒和牛 病毒性腹泻病病毒的包膜蛋白在转染后的细胞中的表达水平显著高于野生型蛋白，且主要 定位于细胞质和细胞膜上，可引发更强的体液免疫和细胞免疫。
[0005] 鉴于RSV对婴幼儿的高危害性，人们投入了大量的精力来研制RSV疫苗。但是由于 该病毒感染的高危人群是免疫系统发育还不成熟的婴儿，再加上易出现疫苗增强性疾病， 所W研发该病毒疫苗困难重重。虽然如此，人们还是尝试了多种方案，其中包括减毒活疫 苗，亚单位疫苗，病毒载体疫苗，病毒样颗粒(Virus L化e ^dicle，VLP)疫苗、DNA疫苗等。
[0006] 因此，如何提供一种具有耐热、稳定性强、冷藏条件要求低的表达信号肤替换的呼 吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法是本领域技术人员亟待解决的技 术问题。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中的不足，本发明进行了深入研究，提供了一种表达信号肤替换的 呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。
[000引本发明一方面设及一种表达信号肤替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐 热疫苗株，其特征在于所述的耐热疫苗株分类命名为rTS-tF/RSV，于2016年4月19日保藏于 武汉大学中国典型培养物保藏中屯、，保藏号为CCTCC N0:V201625。
[0009] 本发明另一方面还设及表达信号肤替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐 热疫苗株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
[0010] 1.1信号肤替换的猪圆环病毒2型化P基因的扩增
[0011] 将呼吸道合胞病毒Long株在化P-2细胞上进行增殖，接种5天后，反复冻融收获细 胞培养液。将收获的细胞培养液进行截短F基因的PCR扩增，获得截短的F蛋白；W引物自延 伸的方法扩增获得tPAs序列；将截短F基因序列和巧As序列通过重叠 PCR的方式进行连接， 再进行PCR扩增，扩增引物为:上游引物5^ -CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCT TGCCACCATGGATGC-3'，下游引物5' -GGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAATTT GTGGTTG-3/ ;对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接；
[001 ^ 1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
[0013] W超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5/- GAATCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTCATC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTG CAGCTGCGCGATC-3/ ;扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒PTS09-C;对PCR产物进行回收纯化， 测定其浓度，待克隆连接；
[0014] 1.3重组质粒pTS-tF/RSV的克隆连接
[0015] 采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的截短F基因片段和耐热载体片段进行克 隆连接(连接序列为CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT);连接产物转化D册α感受态细 胞，转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养，鉴定为阳性的菌液进 行质粒提取；
[0016] 1.4重组病毒rTS-tF/RSV捶救恢复
[0017] 采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒pTS-tF/RSV与Ξ个分别表达NP、P和L蛋 白的辅助质粒共转染BHK-21细胞;转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF 鸡胚。接种后5天，收获鸡胚尿囊液，分离得到表达信号肤替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重 组新城疫耐热疫苗株。
[0018] 本发明还设及上述表达信号肤替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐热疫 苗株在制备重组病毒中的应用。
[0019] 本发明还设及上述表达信号肤替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐热疫 苗株在制备呼吸道合胞病毒亚单位耐热活疫苗中的应用。
[0020] 本申请公开了一种表达信号肤替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐热疫 苗株，该疫苗株具有显著的耐热特性，可极大降低对冷链系统的依赖，节省保存运输成本和 提高疫苗热稳定性。该毒株在感染动物或细胞后，可高效表达呼吸道合胞病毒的截短F蛋 白，自带的tPAs可增强截短F蛋白的分泌表达及免疫原性。该毒株可用于制备呼吸道合胞病 毒亚单位耐热活疫苗。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明表达信号肤替换的呼吸道合胞病毒截短F蛋白的重组耐热新城疫病 毒全长质粒的构建示意图。其中dS09-C为亲本株的基因组结构，rTS-tF/RSV为在rTS09-C 基因组中插入了信号肤替换的截短F蛋白后的结构，详细标注了插入序列的整体序列组成。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，W下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述掲示 的技术内容加 W变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对W下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均在本发明的保护范围内。
[0023] 实施例1
[0024] 第一步、重组全长质粒pTS-tF/RSV的构建与鉴定
[0025] 1.1信号肤替换的猪圆环病毒2型化P基因的扩增
[0026] 将呼吸道合胞病毒Long株在化P-2细胞上进行增殖，接种5天后，反复冻融收获细 胞培养液。将收获的细胞培养液进行截短F基因的PCR扩增，获得截短的F蛋白（删除信号肤 和跨膜区）。W引物自延伸的方法扩增获得巧As序列。将截短F基因序列和巧As序列通过重 叠 PCR的方式进行连接，再进行PCR扩增，扩增引物为:上游引物5/ -CAGCTATATTAAGGATTAAGA AAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGATGC-3'，下游引物5' -GGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTT TTCTTAATTATTATTAATTTGTGGTTG-3'(下划线部分为用于In-fusion克隆连接的互补序列）。 琼脂糖凝胶电泳检测目的条带约1.化b，与预期的1681bp相符(删除自身信号肤和跨膜区的 F基因长度为1512bp，分别在F基因前端和后端引入了基因起始序列和基因终止序列，同时 在F基因前端引入了 Kozak序列和巧As序列）。对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定 DNA浓度，待进行克隆连接。
[0027] 1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
[0028] W超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5/- GAATCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTCATC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTG CAGCTGCGCGATC-3/ (下划线部分为用于In-fusion克隆连接的互补序列）。扩增模板为新城 疫病毒耐热株质粒PTS09-C。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带约18化，与预期的17.8化大小相 符。对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接。
[00巧]1.3重组质粒pTS-tF/RSV的克隆连接
[0030] 按照图1所示的方式，采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的截短F基因片段和 耐热载体片段进行克隆连接。连接产物转化D册α感受态细胞，转化后的细胞在LB平皿上培 养16小时后挑单菌落进行液体培养。对菌液进行截短F基因的PCR鉴定。鉴定为阳性的菌液 进行质粒提取，待酶切和测序鉴定。
[0031] 1.4重组质粒pTS-tF/RSV的酶切与测序鉴定
[0032] 分别WBamHI和Mlul内切酶对全长重组质粒进行酶切鉴定，均得到了与预期相符 的酶切图谱。将酶切鉴定正确的重组质粒pTS-tF/RSV送至测序公司进行序列测定，结果表 明呼吸道合胞病毒的截短F基因插入到了新城疫病毒耐热载体的P和Μ基因之间，tPAs序列 成功替换了F蛋白自身的信号肤序列，且所有序列与预期完全一致，重组质粒pTS-tF/RSV构 建成功。
[0033] 第二步、重组病毒rTS-tF/RSV捶救恢复与鉴定
[0034] 2.1重组病毒rTS-tF/RSV的捶救恢复
[00巧]采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒pTS-tF/RSV与Ξ个分别表达NP、P和L蛋 白的辅助质粒共转染助取-21细胞(已预感染表达T7RNA聚合酶的痘苗病毒）。转染后72小时， 反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF鸡胚。接种后5天，收获鸡胚尿囊液，待进行新城疫 病毒检测。
[0036] 2.2重组病毒的血凝效价和巧光定量PCR检测
[0037] W血凝试验和巧光定量PCR的方法，对收获鸡胚尿囊液进行检测，结果均为新城疫 阳性。初步表明重组病毒rTS-tF/RSV捶救成功。
[003引 2.3重组病毒tF/RSV基因的PCR扩增与测序
[0039] 应用呼吸道合胞病毒截短F基因的特异性扩增引物，对重组病毒dS-tF/RSV的截 短F基因进行RT-PCR扩增，对PCR扩增产物进行序列测定分析，得到1681长的截短F基因序列 (SEQ ID No. 1)，从5/到y端，依次包含了P基因的部分非编码区序列化TR)、P基因的基因终 止序列(GE)、中间序列（IG)、截短F基因的基因起始序列(GS)、Kozak序列、tPAs序列、截短F 基因序列（删除了自身信号肤和跨膜区）、截短F基因的双重终止密码子、截短F基因的GE序 列、IG序列、Μ基因的GS序列和Μ基因的UTR序列。与预期序列100 % -致。
[0040] 第Ξ步、信号肤替换的呼吸道合胞病毒截短F蛋白在重组病中的表 达验证
[0041] 3.1间接免疫巧光法检测信号肤替换的截短F蛋白的表达
[0042] 将重组病毒'了5-1。/35￥和巧509-(：(对照）分别W0.01M0I感染肌Κ-21细胞，24h后 进行间接免疫巧光检测，一抗为NDV阳性鸡血清或RSV阳性兔血清。检测结果表明，重组病毒 rTS-tF/RSV感染的细胞内，使用NDV阳性鸡血清或RSV阳性兔血清作为一抗均能检测到绿色 巧光，而巧S09-C株感染的细胞只在NDV阳性血清作用下检测到巧光。
[0043] 3.2Western Blot法检测信号肤替换的截短F蛋白的表达
[0044] 将重组病毒'了5-1。/35￥和巧509-(：(对照）分别W0.01M0I感染肌K-21细胞，24h后 收集细胞裂解液，W猪圆环病毒2型阳性血清为一抗进行Western Blot检测。检测结果表 明，在60邸a附近出现一条明显的目的条带，与预期的58.68邸a大小相近。表明信号肤替换 的截短F蛋白在重组病毒感染的细胞内正确表达。
[0045] 第四步、重组病毒rTS-tF/RSV的生物学特性鉴定
[0046] 4.1重组病毒的增殖特性测定
[0047] 为比较重组病毒rTS-tF/RSV株与亲本巧509-(：株的生长增殖情况，将两株病毒分 别W100TCID5Q接种BHK-21细胞，接种后24h、4化、7化、9化取上清500μ1，测定病毒TCIDso，绘 制病毒的生长曲线。结果表明，重组病毒rTS-tF/RSV株和亲本rTS09-C株在BHK-21细胞的生 长曲线相似，增殖滴度相近，约为107' *^TCID5〇/ml。
[004引 4.2重组病毒的致病性测定
[0049] 测定重组病毒对鸡胚的最小致死剂量的平均致死时间（MDT/MLD)，结果显示不同 稀释度（10-哇1〇-9)的病毒接种鸡胚后的12化内均不会对鸡胚致死，重组病毒dS-tF/RSV 的MDT/MLD大于12化，表明重组病毒保持了亲本株的低毒特性，外源基因的插入并未改变重 组病毒的致病性。
[(K)加]4.3重组病毒的耐热特性测定
[0051 ] 测定重组病毒在56 °C环境下的HA耐热特性，同时设置非耐热株LaSo化株和耐热株 rTS09-C株为对照。如表1所示，非耐热株LaSo化在56°C耐热处理9min后，HA效价降为0,亲本 株rTS09-C和重组病毒rTS-tF/RSV在56 °C耐热处理150min后仍具有血凝活性。
[0052] 表明重组病毒rTS-tF/RSV的耐热特性与亲本株一致，均为耐热株。（该病毒株已经 保藏，保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中屯、，保藏号为CCTCC N0:V201625)。
[0化3] 表1.重组病毒的HA耐热特性测定结果
[0化4]
[0055] a表示病毒具有血凝活性，b表示病毒没有血凝活性
[0056] W上所述实施例只是本发明的较佳实例，而没有限制本发明的实施范围。因此，凡 是根据本
【发明内容】
的实质所作出的等效修改，都应属于在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 表达信号肽替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐热疫苗株，其特征在于所 述的耐热疫苗株分类命名为rTS-tF/RSV，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养 物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:V201625。2. 表达信号肽替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐热疫苗株的制备方法，其 特征在于包括如下步骤： 1.1信号肽替换的猪圆环病毒2型Cap基因的扩增 将呼吸道合胞病毒Long株在Hep-2细胞上进行增殖，接种5天后，反复冻融收获细胞培 养液。将收获的细胞培养液进行截短F基因的PCR扩增，获得截短的F蛋白；以引物自延伸的 方法扩增获得tPAs序列；将截短F基因序列和tPAs序列通过重叠 PCR的方式进行连接，再进 行PCR扩增，扩增引物为:上游引物5' -CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCC ACCATGGATGC-3'，下游引物5' -GGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAATTTGTGG TTG-3';对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接； 1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增 以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为:上游引物5' -GAATCGGAG TGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTCATC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGCGC GATC-3';扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒pTS09-C;对PCR产物进行回收纯化，测定其浓 度，待克隆连接； 1.3重组质粒pTS-tF/RSV的克隆连接 采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的截短F基因片段和耐热载体片段进行克隆连 接，连接序列为CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT;连接产物转化DH5a感受态细胞，转化 后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养，鉴定为阳性的菌液进行质粒提 取； 1.4重组病毒rTS-tF/RSV拯救恢复 采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒pTS-tF/RSV与三个分别表达NP、P和L蛋白的 辅助质粒共转染BHK-21细胞;转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF鸡胚。 接种后5天，收获鸡胚尿囊液，分离得到表达信号肽替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新 城疫耐热疫苗株。3. 权利要求1所述的表达信号肽替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐热疫苗 株在制备重组病毒中的应用。4. 权利要求1所述的表达信号肽替换的呼吸道合胞病毒F蛋白的重组新城疫耐热疫苗 株在制备呼吸道合胞病毒亚单位耐热活疫苗中的应用。
【文档编号】C12N7/01GK106011086SQ201610424910
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】温国元, 邵华斌, 罗玲, 罗青平, 张媛, 王红琳, 张腾飞, 汪宏才, 张蓉蓉, 卢琴, 艾地云
【申请人】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所