专利名称：一种快速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法
技术领域：
本发明属于微生物遗传学相关领域。
背景技术：
质粒是独立于染色体外具有独立复制能力的且对细菌生存非必需的小型共价闭合环状双链DNA分子，普遍存在于细菌细胞内。由于在提取基因组时易受到质粒DNA的干扰，消除质粒后就能得到纯度较高的基因组，这对于研究细菌的遗传学和分子生物学有重要意义；同时，人们在研究带有质粒的菌株时，总希望得到相应的质粒消除菌，完全消除质粒的细菌与质粒存在的原始菌株比较，可以观察研究质粒的遗传学功能，完全消除质粒的细菌还可以作为基因工程菌，广泛应用于分子生物学研究。虽然某些质粒可自然丢失，但频率很低，仅为10_2 10_8，而绝大多数质粒需要借助物理、化学方法处理来提高质粒消除率。目前，质粒消除的方法有化学处理法、物理法和高温处理法以及外源质粒替换消除法。常用的化学处理试剂有十二烷基硫酸钠、吖啶橙、溴化乙锭、库马霉素、新生霉素、利福平等提高质粒消除率。Hohn等利用吖啶橙来消除大肠杆菌细胞的F质粒，吖啶橙通过迅速抑制质粒的复制而达到质粒消除目的，但吖啶橙仅对大肠杆菌有效。库马霉素和新生霉素可抑制大肠杆菌细胞内的DNA回旋酶活性，而DNA回旋酶可催化超螺旋形成双链闭合环状的DNA，Novick等人报道利用库马霉素可有效地消除金黄色葡萄球菌青霉素酶质粒。Danilevskaya等人发现库马霉素对大肠杆菌来源质粒如pBR322、pMB9的消除均有较好效果；另外将温度提高5-7°C可达到消除质粒的目的，Carlton等将细胞在高温条件培养至对数期后期，再稀释后转接至新鲜的培养基中高温重新培养至对数期后期，经多次稀释高温培养，部分细胞的质粒消失。利用质粒的不相容性原理，将亲缘关系密切的质粒转化到细胞内，由于亲缘相近的质粒不能稳定共存于同一个宿主菌中，使得细胞在增值过程中将其中一个质粒丢失，也可达到消除目标质粒的目的。还有一种新的方法即 电击法，也可有效地消除质粒。当细胞处于电场中时，电位差达到某一临界值，细胞膜局部就会被击穿，形成瞬时的孔洞可以使质粒从细胞中排出，待电场消失后，损伤的细胞膜又可以自我修复。因此电击法可用于消除细菌中的质粒，同时，电击缓冲液的碱金属离子浓度也是影响电击效率的一个重要因素，碱金属离子通过与细胞膜结合从而促进细胞膜的击穿，使得胞内质粒更容易泄露出来。电击法有比常规质粒消除法如溴化乙锭、高温培养法等处理法效果好，而且还有质粒消除率高、操作简单等优点。虽然国外有报道利用电击法消除大肠杆菌质粒，但是该报道并未考虑到电击缓冲液对质粒消除的作用，而且消除率比较低。本专利通过在电击前加入电击缓冲液，并采用优化的电击条件，提高了质粒消除率，而且准确率高，菌株更稳定。用电击结合特殊电击缓冲液的方法快速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒，国内外还没未见相关报道。本专利提供的方法可快速有效地消除大肠杆菌看抗生素抗性质粒
发明内容
针对目前现有的大肠杆菌消除质粒方法需要使用大量有毒的化学试剂如溴化乙锭、吖啶橙等，或者需要经过多次传代，才能够有效消除质粒，而且化学法和高温诱导法消除率均比较低。利用细胞处于电场中时，当电位差达到某一临界值，细胞膜局部被击穿，形成瞬时的孔洞，孔径大小可以使大分子质粒从细胞中排出，因此，电击法可用于消除细菌中的质粒。电击缓冲液的碱金属离子浓度也是影响电击效率的一个重要因素，碱金属离子通过与细胞膜结合从而促进细胞膜的击穿，使得胞内质粒更容易泄露出来。本发明的目的在于提供一种快速有效消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法。该方法经济有效、方便快速，而且消除率高。即本发明提供一种将大肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌的方法。本发明提供一种特殊的电击缓冲液促进抗生素抗性质粒的消除。一种将人肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌的方法，其步骤如下:A、制备感受态细胞:(I)从LB平板上挑取含抗生素抗性质粒pK19mobsacB(Schafer A, Tauch A,Jager W，et al.Small mobilizable mult1-purpose cloning vectors derived fromthe Escherichia coli plasmids pK18 and pK19 !selection of defined deletions inthe chromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene，1994，145 (I):69-73)的大肠杆菌单菌落，例如大肠杆菌SCS110、JM109、DH5 a菌株单菌落(Stratagene，Heidelberg,Germany)，接种到含有5ml的LBG培养基中培养过夜；(2)在无菌条件下，将细菌转移至预冷、无菌1.5ml的离心管中；
(3)4000g离心IOmin回收菌体，该步骤在4°C下进行；(4)用Iml预冷的15%甘油重悬细胞沉淀；(5)4°C以4000g离心IOmin后弃掉液体，回收菌体；(6)重复步骤4、步骤5各一次；(7)最后将菌体重悬于原体积1/10的10%甘油中，并分装至1.5ml离心管中，每管90 iil，并冷冻保存，备用；B、电击消除:(I)将感受态细胞置于冰上融化后，加入10 U I特殊电击缓冲液后混匀，并置于冰上放置IOmin ；(2)将感受态细胞全部转移至Imm的电击杯中，1.8KV/5ms电击一次；(3)电击后立即加入Iml的SOC培养基，37°C温育30min ；(4)将感受态细胞分别涂布至LBG平板和卡那霉素抗性平板中；(5)将平板倒置后于37°C培养，24h后LBG平板和卡那霉素抗性平板均长出单菌落；C、挑取质粒消除菌:(I)用灭菌的牙签，将LBG平板上长出的菌落，分别接种到LBG固体平板和卡那霉素抗性平板中的相应位置，过夜培养；(2)将在LBG平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的菌落挑出，再分别接种到LBG固体平板和卡那霉素抗性平板中的相应位置，过夜培养；(3)挑出只在LBG平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的单菌落；(4)挑出单菌落后，提取质粒。质粒提取方法参见分子克隆中碱裂解方法(Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.Molecular Cloning:A laboratory manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press.New York, 1989.),琼脂糖凝胶电泳检测质粒是否消除；所述的大肠杆菌包括大肠杆菌SCS110、JM109、DH5 a。可消除的抗生素抗性质粒包括以大肠杆菌为宿主的质粒pK19mobsacB。本发明提供一种特殊的电击缓冲液促进质粒消除，该电击缓冲液配方为:KC10.5MCaCl2 0.15MMgCl2 0.25MK+、Ca2+、Mg2+这几种带正电荷配体，均可与带负电荷的细胞膜结合，从而促进细胞膜的击穿，使得胞内质粒更容易泄露出来。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:(I)本发明提供一种将大肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌的方法，目前大肠杆菌消除质粒方法需要使用大量有毒的化学试剂如溴化乙锭、吖啶橙等，或者需要经过多次传代， 才能够有效消除质粒，不仅耗时长，而且化学法和高温诱导法消除率均比较低。电击法有比常规质粒消除法效果好，而且还有质粒消除率高、操作简单等优点。(2)本发明提高一种特殊的电击缓冲液，电击缓冲液的碱金属离子浓度是影响电击效率的一个重要因素，碱金属离子通过与细胞膜结合从而促进细胞膜的击穿，使得胞内质粒更容易泄露出来。利用电击缓冲液可进一步提高质粒消除率。
图1为碱裂解法分别抽提大肠杆菌SCSI 10、JM109、DH5 a菌株质粒pK19mobsacB和消除质粒后的的大肠杆菌SCS110、JM109、DH5a菌株的1%琼脂糖凝胶电泳图。M:Lambda DNA/HindlIIMarker ；1:从大肠杆菌SCSllO提取后并经EcoRI酶切后的pK19mobsacB ；2:从人肠杆菌JM109提取后并经EcoRI酶切后的pK19mobsacB ；3:从大肠杆菌DH5 a提取后并经EcoRI酶切后的pK19mobsacB ；4:消除质粒后的大肠杆菌SCSllO ;5:消除质粒后的大肠杆菌JM109 ；6:消除质粒后的大肠杆菌DH5 a ；
具体实施例方式实施例1:大肠杆菌SCS110、JM109、DH5a含有抗生素抗性质粒pK19mobsacB，属于革兰氏阴性菌，因pK19mobsacB质粒上有一个卡那霉素抗性基因,含有pK19mobsacB质粒的大肠杆菌SCSI 10、JM109、DH5 a均可在含卡那霉素的抗性平板上生长。一种将人肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌的方法，其步骤如下:A、制备感受态细胞:(I)从LB平板上挑取含抗生素抗性质粒pkl9mobsacB(Schafer A, Tauch A,Jager W,et al.Small mobilizable mult1-purpose cloning vectors derived from theEscherichia coli plasmids pK18 and pK19 !selection of defined deletions in thechromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene, 1994,145 (I):69-73)的大肠杆菌单菌落，例如大肠杆菌SCSllO菌株单菌落(Stratagene, Heidelberg, Germany),接种到含有5ml的LBG培养基中培养过夜；(2)在无菌条件下,将细菌转移至预冷、无菌1.5ml的离心管中；(3)4000g离心IOmin回收菌体，该步骤在4°C下进行；(4)用Iml预冷的15%甘油重悬细胞沉淀；(5) 40C以4000g离心IOmin后弃掉液体，回收菌体；(6)重复步骤4、步骤5各一次；
(7)最后将菌体重悬于原体积1/10的10%甘油中，并分装至1.5ml离心管中，每管90 iil，并冷冻保存，备用；B、电击消除:(I)将感受态细胞置于冰上融化后，加入IOii特殊电击缓冲液后混匀，并置于冰上放置IOmin ；(2)将感受态细胞全部转移至Imm的电击杯中，1.8KV/5ms电击一次；(3)电击后立即加入Iml的SOC培养基，37°C温育30min ；(4)将感受态细胞分别涂布至LBG平板和卡那霉素抗性平板中；(5)将平板倒置后于37°C培养，24h后LBG平板和卡那霉素抗性平板均长出单菌落；C、挑取质粒消除菌:(I)用灭菌的牙签，将LBG平板上长出的菌落，分别接种到LBG固体平板和卡那霉素抗性平板中的相应位置，过夜培养；(2)将在LBG平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的菌落挑出，再分别接种到LBG固体平板和卡那霉素抗性平板中的相应位置，过夜培养；(3)挑出只在LBG平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的单菌落；(4)挑出单菌落后，提取质粒。质粒提取方法参见分子克隆中碱裂解方法(Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.Molecular Cloning:A laboratory manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press.New York, 1989.),琼脂糖凝胶电泳检测质粒是否消除；所述的大肠杆菌包括大肠杆菌系列菌:大肠杆菌SCS110、大肠杆菌JM109、大肠杆菌DH5a。可消除的质粒包括广泛的以大肠杆菌为宿主的pKltoobsacB等含有pBR322复制起始位点的质粒。结果如下:
将带有外源质粒pK19mobsacB的感受态大肠杆菌SCS110、大肠杆菌JM109、大肠杆菌DH5 a分别和特殊电击缓冲液混合后电击，经过电激后恢复培养30分钟，涂卡那霉素平板和LBG平板上，37°C培养24h后，大肠杆菌SCSllO卡那霉素平板上长出37个单菌落，LBG平板上长出454个单菌落，质粒消除率达到91.9% ;大肠杆菌JM109卡那霉素平板上长出54个单菌落，LBG平板上长出597个单菌落，质粒消除率达到91%。大肠杆菌DH5 a卡那霉素平板上长出31个单菌落，LBG平板上长出447个单菌落，质粒消除率达到93%。挑出只在LBG平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的单菌落，碱裂解法提取质粒，以观察该菌株是否含有质粒，质粒的琼脂糖电泳图如图1，泳道M为Lambda DNA/HindIII Marker ;泳道I为从大肠杆菌SCSllO提取后并经EcoR I酶切后的pK19mobsacB ；泳道2为从大肠杆菌JM109提取后并经EcoR I酶切后的pKltoobsacB ;泳道3为从大肠杆菌DH5a提取后并经EcoR I酶切后的pKltoobsacB ;泳道4为消除质粒后的大肠杆菌SCSllO ；泳道5为消除质粒后的大肠杆菌JM109 ;泳道6为消除质粒后的大肠杆菌DH5 a ;从图中可以看出，大肠杆菌SCS I 10、JM109、DH5 a质粒均完全消除。
权利要求
1.一种快速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，其特征在于:将大肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌，并采用特殊的电击缓冲液促进抗生素抗性质粒的消除，电击缓冲液的碱金属可促进细胞膜的击穿，使得胞内质粒更容易泄露出来，提高质粒消除率。
2.如权利要求1所述的将大肠杆菌进行电击后获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌，其步骤如下: A、制备感受态细胞: (1)从LB平板上挑取含抗生素抗性质粒的大肠杆菌单菌落，接种到含有5ml的LBG培养基中培养过夜； (2)在无菌条件下，将细菌转移至预冷、无菌1.5ml的离心管中； (3)4000g离心IOmin回收菌体，该步骤在4°C下进行； (4)用Iml预冷的15%甘油重悬细胞沉淀； (5)4°C以4000g离心IOmin后弃掉液体，回收菌体； (6)重复步骤4、步骤5各一次； (7)最后将菌体重悬于原体积1/10的10%甘油中，并分装至1.5ml离心管中，每管90 iil，并冷冻保存，备用； B、电击消除: (1)将感受态细胞置于 冰上融化后，加入IOul特殊电击缓冲液后混匀，并置于冰上放置 IOmin ； (2)将感受态细胞全部转移至1_的电击杯中，1.8KV/5ms电击一次； (3)电击后立即加入Iml的SOC培养基(2%(W/V)蛋白胨，0.5% (W/V)酵母抽提物，0.05% (W/V)氯化钠，2.5mM氯化钾，IOmM氯化镁，20mM葡萄糖)，37°C温育30min ； (4)将感受态细胞分别涂布至LBG平板和卡那霉素抗性平板中； (5)将平板倒置后于37°C培养，24h后LBG平板和卡那霉素抗性平板均长出单菌落； C、挑取质粒消除囷: (1)用灭菌的牙签，将LBG平板上长出的菌落，分别接种到LBG固体平板和卡那霉素抗性平板中的相应位置，过夜培养: (2)将在LBG平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的菌落挑出，再分别接种到LBG固体平板和卡那霉素抗性平板中的相应位置，过夜培养； (3)挑出只在LBG平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的单菌落； (4)挑出单菌落后，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒是否消除；
3.如权利要求1所述的采用特殊的电击缓冲液，该电击缓冲液配方为: KCl 0.5MCaCl2 0.15MMgCl2 0.25M K+、Ca2+、Mg2+这几种带正电荷配体，均可与带负电荷的细胞膜结合，从而促进细胞膜的击穿，使得胞内质粒更容易泄露出来，可提高质粒消除率。
全文摘要
一种快速消除大肠杆菌抗生素抗性质粒的方法，主要用于将大肠杆菌中的抗生素抗性质粒快速有效地从大肠杆菌中消除掉。通过采用将大肠杆菌进行电击的方法获得消除抗生素抗性质粒的大肠杆菌，并采用特殊的电击缓冲液促进抗生素抗性质粒的消除，提高质粒消除率。细胞处于电场中时，电压达到某一临界值，细胞膜局部被击穿，形成瞬时的孔洞，孔径大小可以使质粒从细胞中排出，电击结束后，损伤的细胞膜又可以自我修复；电击缓冲液的碱金属通过与细胞膜结合从而促进细胞膜的击穿，使得胞内质粒更容易泄露出来。最终的质粒消除率可达到93％。
文档编号C12R1/19GK103160493SQ201110422779
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者张震宇, 刘合栋 申请人:江南大学