一种与秦川牛生长相关的cnv标记的检测方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种检测秦川牛生长性状相关的 SHH基因CNV标记的检测方法与应用。
【背景技术】
[0002] 拷贝数变异（CopyNumberVariations,CNVs)是指基因组DNA中较大片段的缺失 或重复现象。CNVs是基因组上一种亚显微水平的结构变异，涉及的片段大小在lkb到多个 Mb之间，包括拷贝数增加（Copynumbergain)和拷贝数减少（Copynumberloss)。有些 拷贝数变异属于多态性范畴，并不对动植物的表型造成影响，而有些拷贝数变异则通过扰 乱基因序列和改变基因含量来影响基因表达，从而造成表型差异和表型适应。
[0003]目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有：（1)比较基因组杂交（CGH) :CGH可在 全部染色体或染色体亚带水平上，对不同基因组之间DNA序列的拷贝数进行检测，从而发 现拷贝数变异。然而该技术分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出。同时 该技术操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推 广。（2)多重连接探针扩增技术（MLPA) :MLPA是2002年发展起来的一种拷贝数检测方法。 该技术具有较准确的相对定量功能，但是该方法探针制备较为复杂，同时操作步骤繁琐，耗 时长。并且采用毛细管电泳作为分析手段，通量较低、成本较高且属于开放式操作，易于造 成PCR产物的污染。（3)高分辨熔解曲线分析（HRM) :HRM于2003年发明，其通过精确的变 温速率控制以及DNA饱和染料的指示，实现了通过研究PCR产物序列的熔解温度而对PCR 产物进行鉴定。该技术具有快速、廉价、高通量等优点，同时具有以下不足：该方法实现的前 提是突变位点必须是杂合的，从而增加了实验的成本和设计的难度，而且降低了检测的通 量。并且，单个核苷酸的差异对于熔解曲线的影响较小，甚至有些差异几乎不影响熔解曲线 的偏移，造成检测灵敏度较低。（4)实时荧光定量PCR(qPCR):根据qRT-PCR所使用的荧光 化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。PCR反应体系中加入过 量的SYBRGreen染料分子，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，而游离的染料分子 则仅有很低的荧光本底几乎不发光，从而确保信号的增加与PCR产物的增加同步，可通过 检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对目的基因（具有拷贝数变异）及参 考基因（无拷贝数变异）进行相对定量，根据2 方法统计检测样本候选基因的拷贝数。 染料法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝 数，但不适用于大样本的高通量检测。
[0004]分子育种，即分子标记辅助选择（molecularmark-assistselection,MAS)，该 技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改 良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选 择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。
[0005] SHH基因是胚胎发育和多种组织器官形成的重要调节因子，可促进间充质干细胞 向成肌或成骨细胞分化，而抑制脂肪分化，并调控四肢、神经和消化系统的发育，从而影响 经济动物的生长发育。高通量测序发现SHH基因内存在2220bp的拷贝数变异（CNVs)，包含 了该基因部分外显子、内含子和3'UTR重要功能区域，可能改变该基因及其相关靶基因的 功能发挥，进而影响到机体的生长发育。目前，尚未见有关SHH基因该CNVs对秦川牛生长 性状影响的文献报道。因此，研究该基因拷贝数变异并将其与秦川牛重要生长性状关联分 析至关重要，可以为我国秦川牛分子育种提供理论依据，便于中国秦川牛生长性状的标记 辅助选择，快速建立遗传资源优良的秦川牛种群。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种与秦川牛生长相关的CNV标记的检测方法与应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0008] -种与秦川牛生长相关的CNV标记的检测方法，包括以下步骤：以秦川牛基因组 DNA为模板，以引物对P1和引物对P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增秦川牛SHH 基因CNV区域和内参基因BTF3,根据定量结果鉴定秦川牛SHH基因的拷贝数变异。
[0009] 所述的CNV标记是指牛SHH基因候选区域Chr4:118264951-118267170的拷贝数 变异。
[0010] 所述的拷贝数变异是根据l〇g22AAet将定量结果分为三类：插入型，Log22ΛACt>0. 5 ;缺失型，Log22ΛACt〈-0. 5 ;正常型，Log22ΛACt彡 | ±0. 5 |。
[0011] 所述的引物对P1为：
[0012] 上游引物FI:5' -CGCACGCAATGAGACTTTA-3，，
[0013] 下游引物R1 :5，-AATAGCCAGGAGAGGTGAA-3，；
[0014] 所述的引物对P2为：
[0015]上游引物F2:5，-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3，，
[0016] 下游引物R2 :5，-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3，。
[0017] 所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系以20yL计为：50ng/yL模板DNA 1yL，10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各1yL，2XSYBRGreen qPCRMixlOμL，以及去离子水7μL。
[0018] 所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序为：（1)预变性95°C30s;(2)扩增反应： 95°C变性10s，60°C退火30s，39个循环。
[0019] 上述与秦川牛生长相关的CNV标记的检测方法在秦川牛分子育种中的应用。
[0020] 所述的CNV标记应用在早期分子标记辅助选择生长性状优秀的秦川牛品种。
[0021] 所述SHH基因CNV区域不同拷贝数与秦川牛的生长发育显著相关，其中插入型个 体的生长性状显著高于缺失型个体。
[0022] 本发明根据牛SHH基因候选区域Chr4:118264951-118267170的拷贝数变异， 具体地，所述的CNV标记位于牛SHH基因（GenBankAccessionN〇.AC_000161)序列的 7776bp-9995bp区域内，以待测牛的基因组DNA为模版，利用实时荧光定量PCR检测基因组 CNVs，根据log22Λ ^将结果分为三类：LogJaMt>〇. 5则为插入型；L〇g22λ^〈_〇. 5则为 缺失型，Log22 |±0.5|则为正常型。根据牛基因组CNVs的检测结果，如果拷贝数为 插入型，则待测牛表型较为优异；如果拷贝数为缺失型，则待测个体表型较差。根据本发明 的实施例，以牛SHH基因候选区域Chr4:118264951-118267170为候选位点，通过实时荧光 定量PCR技术检测该位点在群体秦川牛群体中的拷贝数变异情况，并与体重和胸围等重要 经济性状进行关联分析；如果检测SHH基因候选位点的拷贝数变异类型为插入型，则待测 牛表型更优异；如果拷贝数变异类型为缺失型，则待测个体表型较差。
[0023] 与现有技术相比，本发明有以下优点：
[0024] (1)本发明提供的秦川牛SHH基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于 母牛的早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择；
[0025] (2)检测牛SHH基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；
[0026] (3)牛SHH基因拷贝数变异位点的检出，为牛生长发育的分子标记辅助选择提供 科学依据。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明中进行qPCR绘制的扩增曲线；
[0028] 图2是本发明中进行qPCR绘制的溶解曲线。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。
[0030] 本发明利用实时荧光定量PCR对秦川牛SHH基因的拷贝数变异进行检测并用于分