评估奥沙利铂化疗后结直肠癌复发风险的试剂盒及其用图【专利说明】评估奥沙利铂化疗后结直肠癌复发风险的试剂盒及其用途[
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][0001]本发明涉及药物检测试剂盒，具体涉及评估奥沙利铂化疗后结直肠癌复发风险的试剂盒及其用途。[【
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】][0002]结直肠癌是最为常见的恶性肿瘤之一，中国地区的发病率上升趋势十分明显，位居全部恶性肿瘤第三位，严重威胁人类健康。[0003]随着分子分析方法的发展，各种新的诊治方法和新的药物不断涌现，结直肠癌的治疗效果有明显改善。然而，虽然传统的临床病理因素可以为结直肠癌患者提供一定的疗效信息，但这些风险因素对结直肠癌预后影响的程度不能很好地被量化和整合，因此对于患者个体，目前的治疗方法以及用药选择仍然严重依赖传统的组织病理学和临床检查，对疗效的评价准确性并不高。对此，临床研究者提出了各种预后及疗效个体化预测工具，以期通过简单有效的预测方法为结直肠癌患者术后化疗用药提供参考，从而提高化疗用药的准确性，改善病人生活质量。这些预测工具包括了基因拷贝数变异分析。[0004]目前关于基因拷贝数变异与肿瘤预后相关性的研究已经报道了基因组16pl3.3、1ρ36、以及4q22.I_4q35.2等位点的拷贝数变异与II-III期结直肠癌的预后复发相关(MampaeyE,FieuwA,VanLaethemT,etal.Focuson16pl3.3LocusinColonCancer.PLoSOne.2015Jul29；10(7):e0131421；MayrhoferM,KultimaHG,BirgissonH,etal.Ip36deletionisamarkerfortumourdisseminationinmicrosatellitestablestageII-IIIcoloncancer.BMCCancer.2014Nov24；14:872；SmithDH，ChristensenIJ，JensenNF，etal.AnexplorativeanalysisofERCCl_19ql3copynumberaberrationsinachemonaivestageIIIcolorectalcancercohort.BMCCancer.2013Oct21；13:489；BrosensRP,BeltEJ，HaanJC，etal.Deletionofchromosome4qpredictsoutcomeinstageIIcoloncancerpatients.CellOncol(Dordr).2011Jun；34(3):215-23)。然而，作为美国国家综合癌症网络指南（NCCN)建议的III期结直肠癌患者在经根治性切除术后辅助化疗的一线药物奥沙利铂，目前却并没有有效的预测工具提供给临床医生用于区分奥沙利铂辅助性化疗法中可能获益较多或获益较少的患者群体，从而对CRC患者进行个性化药物治疗。这一现实严重限制了奥沙利铂在III期结直肠癌术后辅助化疗中疗效的提升，35%的III期结直肠癌患者无法从术后奥沙利铂辅助化疗中获益（UncuD,AksoyS，CetinB，etal.ResultsofadjuvantF0LF0XregimensinstageIIIcolorectalcancerpatients:retrospectiveanalysisof667patients.Oncology.2013;84(4):240-245)^因此，结直肠癌的临床治疗急需一种能够简便准确地进行预后及奥沙利铂疗效预测的方法，为结直肠癌患者术后用药提供重要参考。[0005]蛋白激酶在肿瘤的发生、进展以及肿瘤细胞代谢和耐药性的产生等生理过程中发挥着重要的作用，因此可作为评测肿瘤预后以及化疗疗效的评测指标。本发明在98份III期结直肠癌术后奥沙利铂辅助化疗患[0006]者肿瘤组织中检测626个蛋白激酶基因的拷贝数，发现其中9个蛋白激酶基因拷贝数变化与结直肠癌疗效密切相关。根据功能聚类将9个基因分为以下几组：[0007][0008][0009]其中，BRD2属于BET(bromodomainsandextraterminaldomain)蛋白家族，具有转录调控因子活性，参与多种肿瘤基因如c-MYC、BCL2和SP1的转录（FuLL，TianM,LiX,etal.InhibitionofBETbromodomainsasatherapeuticstrategyforcancerdrugdiscovery.Oncotarget.2015Mar20;6(8):5501-16;Minghuaffu,XiayuLi,XiaolingLi,etal.SignalingTransductionNetworkMediatedbyTumorSuppressor/SusceptibilityGenesinNPC.CurrGenomics.2009Jun;10(4):216-222)〇[0010]PTK2属于蛋白酪氨酸激酶家族的FAKsubfamily。参与多个信号通路包括PI3K/AKT、MAPK/ERK以及GTPase-activatingproteins的活化（SunL，LiuL，LiuX，etal.MGrl-Ag/37LRPinducescelladhesion-mediateddrugresistancethroughFAK/PI3KandMAPKpathwayingastriccancer.CancerSci.2014Jun；105(6):651-9；HeckerTP，DingQ，RegeTA，etal.OverexpressionofFAKpromotesRasactivitythroughtheformationofaFAK/p120RasGAPcomplexinmalignantastrocytomacells.Oncogene.2004May13;23(22):3962-71),在肿瘤的增殖和转移过程中发挥重要作用。[0011]DNAJC6属于进化保守的DNAJ/HSP40家族，通过激活ATPsae来调控分子伴侣的活性。G0功能分析显示其具有蛋白酪氨酸磷酸酶的活性。在肝癌中的研究发现DNAJC6通过EMT调控肝癌细胞的转移（YangT，LiXN，LiXG，etal.DNAJC6promoteshepatocellularcarcinomaprogressionthroughinductionofepithelial-mesenchymaltransition.BiochemBiophysResCommun.2014Dec12；455(3-4):298-304.)[0012]EYA4编码一个EYA家族（eyesabsentfamily)蛋白DEYA4具有蛋白磷酸酶活性，能够通过调控基因的转录发挥作用，功能分析显示EYA4参与DNA修复，凋亡能生理过程，提示其可能参与肿瘤的病理过程。研究表明EYA4在多种肿瘤中存在甲基化调控，影响其在肿瘤细胞中的表达（HouX，PengJX，HaoXY，etal.DNAmethylationprofilingidentifiesEYA4geneasaprognosticmolecularmarkerinhepatocellularcarcinoma.AnnSurgOncol.2014Nov;21(12):3891-9;KisielJB，Garrity-ParkMM,TaylorWR，etal.Methylatedeyesabsent4(EYA4)genepromotorinnon-neoplasticmucosaofulcerativecolitispatientswithcolorectalcancer:evidenceforafieldeffect,nflammBowelDis.2013S印；19(10):2079-83.)，KimSJetal.的研究发现EYA4在结肠癌中的表达缺失，并证明其作为一个新的抑癌基因参与了结肠癌的病理过程（KimSJ，TaeCH,HongSN,etal.EYA4ActsasaNewTumorSuppressorGeneinColorectalCancer.MolCarcinog.2015Dec；54(12):1748-57.)〇[0013]WNK1属于Serine/threonine蛋白酶家族的一个亚家族（WNKfamily)。WNK家族包括4个成员，WNK1-4。越来越多的研究证实WNK蛋白激酶家族参与了肿瘤中多种信号通路的级联放大过程，MonizS，JordanP的研究表明WNK在肿瘤细胞周期，肿瘤转移和肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用(MonizS,JordanP.EmergingrolesforWNKkinasesincancer.CellMolLifeSci.2010Apr；67(8):1265-76.)〇[0014]STK32A基因编码的蛋白属于Serine/threonine蛋白激酶家族，参与细胞内WNT3A刺激后的Wnt/beta-catenin信号通路的调控。[0015]STK39基因编码一个Serine/threonine激酶，通过MAPK信号通路参与细胞的应激反应。QiHetal.的研究认为STK39在前列腺癌细胞中的表达存在雄激素依赖，雄激素诱导的STK39/MAPK信号级联反应可能在前列腺癌中发挥重要作用（QiH，LabrieY，GrenierJ,etal.AndrogensinduceexpressionofSPAK,aSTE20/SPS1-relatedkinase,inLNCaPhumanprostatecancercells.MolCellEndocrinol.2001Sep;182(2):181-92.)〇STK39的剪切和失活在TRAIL诱导的宫颈癌细胞凋亡中发挥关键作用（PolekTC，TalpazM,Spivak-KroizmanTR.TRAIL-inducedcleavageandinactivationofSPAKsensitizescellstoapoptosis.BiochemBiophysResCommun.2006Oct27;349(3):1016-24.)。[0016]PPP3R1基因编码的蛋白作为钙调磷酸酶的调节亚基，是一个钙离子依赖，能被钙调磷酸酶激活的蛋白磷酸酶，功能分析系显示PPP3R1与PI3K和MAPK信号通路相关。[0017]NME4属于二磷酸核苷激酶家族，主要作用是合成三磷酸核苷，参与细胞的代谢过程。多项研究表明NME4在不同的肿瘤类型中都存在过表达的现象。SeifertMetal通过RT-PCR和免疫组化检测了结肠癌和胃癌中NME家族的表达发现NME4的表达与肿瘤的TNM分期相关，研究认为NME4参与胃癌和结肠癌的发展（SeifertM,WelterC，MehraeinY,etal.Expressionofthenm23homologuesnm23-H4,nm23_H6,andnm23-H7inhumangastricandcoloncancer.JPathol.2005Apr；205(5):623-32.)〇[0018]因此，本发明通过检测上述9个基因的拷贝数，计算总结得出一套评估奥沙利铂疗效的复发风险评分方法，可以有效地为结直肠癌患者术后用药提供重要参考。进一步的，本发明采用荧光定量PCR技术，采用自行设计并优化的内参和目的引物，整合了实时荧光定量PCR试剂，制成检测试剂盒，方便临床检测使用。[【
发明内容】][0019]本发明的首要目的是找到与结肠癌化疗后复发相关的重要基因，其次是提供一个用于结直肠癌化疗后复发风险评估的方法，然后通过一组重要基因做成检测结肠癌化疗后复发风险评估的试剂盒，能够简便快速地评价患者是否适合进行化疗。[0020]为了实现上述目的，本发明提供一种评估奥沙利铂化疗后结直肠癌复发风险的试剂盒，包括：[0021]a.由序列为SEQIDN0:1的上游引物和序列为SEQIDN0:2的下游引物组成的第一引物对；[0022]b.由序列为SEQIDN0:3的上游引物和序列为SEQIDN0:4的下游引物组成的第二引物对；[0023]c.由序列为SEQIDN0:5的上游引物和序列为SEQIDN0:6的下游引物组成的第三引物对；[0024]d.由序列为SEQIDN0:7的上游引物和序列为SEQIDN0:8的下游引物组成的第四引物对；[0025]e.由序列为SEQIDN0:9的上游引物和序列为SEQIDN0:10的下当前第1页1 2