奥沙利铂药物组合物及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及奥沙利铂类结肠癌治疗药物和应用，由TOP2B抑制剂和奥沙利铂组成。实验证明抑制CCDC88A能够提高结直肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性。同时，这种敏感性的增加与TOP2B的表达降低也有关，用TOP2B的抑制剂也能提高对奥沙利铂结直肠癌细胞的敏感性，本发明的CCDC88A和TOP2B可以作为奥沙利铂的增敏剂，以这两个基因作为靶点设计药物，联合奥沙利铂，可以提高奥沙利铂的疗效。
【专利说明】奥沙利铂药物组合物及应用
[【技术领域】]
[0001]本发明涉及奥沙利钼类结肠癌治疗药物和应用，特别涉及CCDC88A和T0P2B抑制剂和奥沙利钼的药物组合物及应用。
[【背景技术】]
[0002]奥沙利钼作为第三代钼类药物，广泛用于结直肠癌辅助治疗的一线方案。奥沙利钼发挥细胞毒性作用的机制是在细胞内通过代谢产物与DNA交联形成DNA复合物，从而终止肿瘤细胞的复制、导致细胞凋亡。研究表明只有40%患者从中获益，但是仍然有一部分患者治疗失败。其主要的原因是对于奥沙利钼化疗药物原始或获得性的耐药性。这种耐药性的产生包含化疗药物的运输、DNA修复、DNA损伤耐受和凋亡等多个因素的参与。如何提高奥沙利钼为主的结直肠癌化疗敏感性成为当前临床研究和基础研究的热点问题。
[0003]CCDC88A (Gene ID: 55704)，属激酶调节蛋白，它的 C 端含有 GEF (Guaninenucleotide Exchange Factor)结构域，能够与G蛋白I型α亚基(Gia )结合,释放G3 Y亚基，从而活化细胞内激酶，进而调控细胞内信号通路，在肿瘤细胞生长和转移过程中起重要作用。有研究表明CCDC88A在进展期结直肠癌中的表达有明显升高并且影响结直肠癌患者预后。目前发现(XDC88A主要通过调控EGFR和ΡΙ3Κ信号通路调控肿瘤细胞生长和转移。CCDC88A在细胞内通过GEF结构域结合Gi a，同时其C端与EGFR结合，形成Gi a -GIV-EGFR复合物，EGFR发生磷酸化，进而导致下游PI3K，AKT和PLC Y磷酸化，促进细胞迁移；当(XDC88A的1685位氨基酸发生突变(F1685A)后，不能和G蛋白结合，EGFR磷酸化水平下降，但是SRC和ERK磷酸化水平升高，也可以促进细胞分裂和增殖。EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平除了与肿瘤细胞的转移有关之外，还与肿瘤细胞对药物的抗性有关，在钼类耐药的肿瘤细胞中均发现EGFR和PI3K磷酸化水平比非耐药细胞要高。既然CCDC88A可以激活与化疗耐药相关的EGFR和PI3K通路，因此，有理由认为(XDC88A可以促进肿瘤细胞的耐药，从而影响肿瘤的预后。
[0004]T0P2B (Gene ID: 55704)属于T0P2家族成员，这个家族还有T0P2A。T0P2是机体内重要的核酶，具有调整DNA拓扑结构的作用，它参与了 DNA的复制、转录、翻译及染色体的分离、损伤修复等过程。T0P2A在增殖细胞和肿瘤细胞等含量较高，其浓度与细胞的增殖状态紧密相关，快速增殖细胞是静止细胞表达的数倍，GcZG1其含量较低，在S期开始增加，G2/M期表达达到高峰。T0P2B的表达无细胞周期性差异，其浓度在细胞周期中保持相对恒定。因此推测T0P2A和T0P2B的功能，T0P2A可能负责在DNA复制后期解开两个相互交联的染色质单体以及重组细胞分裂后期DNA ;而T0P2B负责DNA复制、转录等过程。由于T0P2在细胞代谢中的重要作用，因此其成为肿瘤靶点被应用到恶性肿瘤的治疗中。这些抗T0P2的靶向药物按照其作用方式可以分为两种:T0P2毒剂和Τ0Ρ2催化抑制剂。Τ0Ρ2毒剂的代表药物有依托泊苷(Etoposide, VP16)和阿霉素(Adriamycin, ADM),其作用方式是通过提高可切割复合物的稳态浓度使T0P2从酶变成生理毒剂，形成T0P2-药物-DNA复合物，使细胞基因组DNA断裂，从而导致细胞变异或启动一系列事件导致细胞死亡。这些药物是目前临床上常用抗癌药物，是淋巴瘤、肺癌等恶性肿瘤的首选药物。T0P2催化抑制剂的代表药物有新生霉素、阿柔比星等，其作用方式通过抑制催化反应中的某一步骤或阻滞T0P2的某一特定功能，进而抑制T0P2的总体催化活性。
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【发明内容】
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[0005]为了增加奥沙利钼对于结肠癌细胞的敏感性，提供一种以(XDC88A和T0P2B作为新的靶点的奥沙利钼药物组合物。
[0006]用MTT法检测17种结直肠癌细胞系对奥沙利钼敏感性，确定了奥沙利钼对17株细胞的半致死浓度(IC50)和奥沙利钼不敏感细胞株。通过筛选针对(XDC88A mRNA的4个靶点的siRNA，选择干扰效率最高的序列设计shRNA，其碱基正向序列如SEQ ID NO:1所示，其碱基反向序列如SEQ ID:2所示。
[0007]然后构建慢病毒，感染DLDl细胞，RT-PCR和wetern blotting检测干扰效率，选取干扰效率最高的shRNA慢病毒感染DLDl细胞，联合奥沙利钼，用MTT法检测两者联用对DLDl细胞的生长抑制效果发现:(XDC88A表达降低后，导致T0P2B基因表达下调，使用T0P2B的抑制剂阿霉素可以增加结直肠癌细胞对奥沙利钼的敏感性。
[0008]抑制CCDC88A的能够提高结直肠癌细胞对奥沙利钼的敏感性。同时，这种敏感性的增加与T0P2B的表达降低也有关，抑制T0P2B也能提高对奥沙利钼结直肠癌细胞的敏感性。
[0009]为实现上述目的，发明一种奥沙利钼药物组合物，由(XDC88A和/或T0P2B的抑制剂联用奥沙利钼组成。通过Real-time PCR及Western blotting检测肿瘤耐药相关基因T0P2B mRNA和蛋白表达，发现其表达量在(XDC88A被干扰之后，明显降低。用T0P2B抑制剂和奥沙利钼处理结直肠癌细胞，两者联用时抑制率显著提高。
[0010]进一步的，所述的T0P2B抑制剂优选为阿霉素或依托泊苷。
[0011]上述的药物组合物中奥沙利钼的浓度为3μΜ~10μΜ ；Τ0Ρ2Β抑制剂的浓度为3μΜ~24μΜ。优选为下述3种方案:
[0012]a.浓度为3μΜ的奥沙利钼和浓度为6μΜ的Τ0Ρ2Β抑制剂。
[0013]b.浓度为3μΜ的奥沙利钼和9μΜ的Τ0Ρ2Β抑制剂。
[0014]c.浓度为3μΜ的奥沙利钼和浓度为24μΜ的Τ0Ρ2Β抑制剂。
[0015]所述奥沙利钼药物组合物能够用于D2、HCT116、HUTU80、SW48、SW480、SW620、SW837、CAC0-2、C0115、CX-1、C0L0205、DLD1、GP2D、GP?、或 HCT15 等结直肠癌抑制药物中，尤其能够提高DLDl对于奥沙利钼的敏感性。
[0016]本发明相对于现有技术而言，具有如下优点:
[0017]确定了抑制CCDC88A能够提高结直肠癌细胞对奥沙利钼的敏感性，这种敏感性的增加与Τ0Ρ2Β的表达降低有关，用Τ0Ρ2Β的抑制剂阿霉素联合奥沙利钼处理结直肠癌细胞，也能提高对结直肠癌细胞的增殖。
[0018]本发明的(XDC88A和Τ0Ρ2Β可以作为奥沙利钼的增敏剂，以这两个基因作为靶点设计药物，联合奥沙利钼，可以提高奥沙利钼的疗效。[【专利附图】
【附图说明】][0019] 图1显示了 CCDC88A对4个siRNA干扰效率；
[0020]图2显示了(XDC88A对shRNA慢病毒干扰效果；
[0021]图3显示了(XDC88A干扰之后提高了 DLDl细胞对奥沙利钼的敏感性；
[0022]图4显示了(XDC88A干扰导致T0P2B蛋白表达下降；
[0023]图5显示了 (XDC88A干扰导致T0P2B mRNA表达下降；
[0024]图6显示了 T0P2B抑制剂阿霉素提高DLDl细胞对奥沙利钼敏感性。
图中I表不:未作任何处理2表不:3 μ m奥沙利钼3表不:6 μ m阿霉素4表不:3 μ m奥沙利钼+6 μ m阿霉素5表不:9 μ m阿霉素6表不:3 μ m奥沙利钼+9 μ m阿霉素7表不:24 μ m阿霉素8表示:3 μ m奥沙利钼+24 μ m阿霉素。
[【具体实施方式】]
[0025]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0026]实施例1:结直肠癌细胞株培养
[0027]将CAC0-2、COl 15、CX-1、C0L0205、D2、DLD1、GP2D、GP5D、HCT15、HCTl 16、HUTU80、LS174T、LS180、SW48、SW480、SW620、SW837 等 17 株结直肠癌细胞株置于 37°C、5%C02 培养箱中，含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基中常规培养。
[0028]实施例2 =MTT法检测17种结直肠癌细胞系对奥沙利钼的敏感性
[0029]取对数生长期结直肠癌细胞系，分别接种于96孔板中，1000-5000个/孔，100微升培养基/孔。
[0030]第二天弃培养液，每组细胞加入用培养基稀释的不同浓度(0、3、10、30μπι)的奥沙利钼，每个浓度设3个复孔，并设单独培养基对照孔。将96孔板置于37°C、5%C02培养箱再培养24小时-72小时。
[0031]每孔加入4 mg/ml的MTT试剂10 μ 1，继续在培养箱中孵育4h。
[0032]小心吸取去上清液，每孔加入100 μ I DMSO,放于振荡器上震荡15min。
[0033]酶标仪在490nm波长下测吸光值(A值)。
[0034]根据OD值算出肿瘤细胞抑制率，计算公式为抑制率(IR)= (1-实验组A值/对照组A值)X 100%。SPSS统计软件计算各组结直肠癌细胞系奥沙利钼IC5tl值。
[0035]实施例3: siRNA转染
[0036]DLDl细胞铺于24孔板，当细胞密度达到30%_50%时，将150-100pmolsiRNA与250ul无血清培养基混匀，5ul Lipofectamine 2000和另外250ul无血清培养基混匀，室温放置5分钟后，两者混匀，静置20分钟，然后加入细胞培养板。
[0037]CCDC88A siRNA 序列
[0038]
【权利要求】
1.一种T0P2B和(XDC88A在奥沙利钼敏感性制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的T0P2B和CCDC88A在奥沙利钼敏感性制剂中的应用，其特征在于(XDC88A表达降低后，导致T0P2B基因表达下调，使用T0P2B的抑制剂阿霉素可以增加结直肠癌细胞对奥沙利钼的敏感性。
3.如权利要求1所述的T0P2B和CCDC88A在奥沙利钼敏感性制剂中的应用，其特征在于抑制CCDC88A能够提高结直肠癌细胞对奥沙利钼的敏感性，同时，这种敏感性的增加与T0P2B的表达降低有关，用T0P2B也能提高直肠癌细胞对奥沙利钼的敏感性。
4.如权利要求2所述的T0P2B和CCDC88A在奥沙利钼敏感性制剂中的应用，其特征在于(XDC88A表达降低是通过(XDC88A的干扰序列来实现的，(XDC88A的干扰序列为一 shRNA分子，其碱基正向序列如SEQ ID NO:1所示，其碱基反向序列如SEQ ID: 2所示。
5.一种奥沙利钼药物组合物，其特征在于由CCDC88A和/或T0P2B的抑制剂联用奥沙利钼组成。
6.如权利要求5所述的奥沙利钼药物组合物，其特征在于所述的T0P2B抑制剂为阿霉素或依托泊苷。
7.如权利要求5所述的奥沙利钼药物组合物，其特征在于所述的药物组合物中奥沙利钼的浓度为3μΜ~10 μ Μ, Τ0Ρ2Β抑制剂的浓度为3μΜ~24μΜ。
8.权利要求5~7中任一所述奥沙利钼药物组合物在结直肠癌抑制药物中的应用。
9.如权利要求8所述的奥沙利钼药物组合物在结直肠癌细胞抑制药物中的应用，其特征在于所述的结直肠癌细胞为 D2、HCTl 16、HUTU80、SW48、SW480、SW620、SW837、CAC0-2、COl 15、CX-1、C0L0`205、DLD1、GP2D、GPOT、或 HCT15 中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的奥沙利钼药物组合物在结直肠癌细胞抑制药物中的应用，其特征在于所述的结直肠癌细胞为DLDl。
【文档编号】A61K31/282GK103520723SQ201310332311
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年8月1日 优先权日:2013年8月1日
【发明者】李华光, 张亚杰 申请人:上海锐赛生物技术有限公司