奥沙利铂壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束及应用的制作方法

专利名称：：奥沙利铂壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属奥沙利钼靶向制剂的制备与应用，具体涉及奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的制备及其应用。
背景技术：
：化学疗法是目前治疗癌症的一种重要手段。然而大多数化学治疗药物都缺乏体内特异的生物分布，由此导致对正常的细胞及器官造成毒副作用，从而使它们的临床应用受到限制。此外，肿瘤细胞对药物的耐药性以及多药耐药性也成为导致肿瘤化疗失败的一个很重要的因素。钼类药物是一种具有光谱抗癌活性的化疗药物，也被称为DNA烷化剂。奥沙利钼是第三代钼类抗肿瘤药物，它通过使DNA交叉连接及抑制DNA合成达到杀死癌细胞的目的。然而奥沙利钼本身缺乏对肿瘤组织的靶向性，在肿瘤组织中的药物分布量很少，而且与红细胞之间的有高度隔离，使得其治疗效力大大降低，同时也导致了高发性的药物毒副反应如末梢的感觉神经病变以及血小板减少症等，从而限制了奥沙利钼的临床应用。此外，在治疗过程中肿瘤组织对奥沙利钼耐受性的产生也成为导致其化疗失败的一个主要原因。因此，开发具有靶向性的新型药物传递系统就显得尤为重要。过去十几年里已有关于脂质体、纳米颗粒等作为药物载体的报导，值得一提的是近年来新发展起来的聚合物胶束，被认为是一种具有很大潜力的新型药物载体。聚合物胶团(polymericmicelles,PMs)由两亲性的聚合物在水性环境中自发形成，它以疏水性嵌段作为内核，亲水性嵌段作为外壳，具有独特的核-壳结构。其内核可为难溶性药物提供储库，亲水性外壳可使得它在水性环境中很好地分散，并可对其进行理化性质修饰从而得到我们所期望的特性。聚合物胶束由于其疏水性表面以及较小的粒径(IO-IOOnm)，可以逃避单核巨噬细胞的吞噬。聚合物胶团自身可通过“增强的渗透及滞留效应”(enhancedpermeabilityandretentioneffect)即EPR效应实现被动靶向，将药物聚集到肿瘤组织。聚合物胶团还可以通过配体修饰，实现对肿瘤组织的主动靶向。目前，已有将聚合物胶束作为奥沙利钼药物载体的报道。Cabral等制备了聚乙二醇和聚谷氨酸的嵌段共聚物[PEG-b-P(Glu)]，用其包裹奥沙利钼得到的载药胶团，其体内抗肿瘤活性结果显示，与游离药物相比，该载药胶团大大提高了药物的抗肿瘤活性，并且具有很好的对肿瘤组织的分布，其在肿瘤组织中的药物浓度与游离药物相比提高了20倍。由于奥沙利钼具有一定的水溶性，用聚合物胶束进行包裹还存在一些困难，关于这方面的报道并不是很多。壳聚糖是一种具有低毒、高生物相容性、可体内降解的阳离子型载体材料。将硬脂酸(stearicacid,SA)嫁接到壳聚糖(chitosan，CS0)的主链上，得到两亲性壳聚糖-硬脂酸嫁接物(stearicacid-graftedchitosanoligosaccharide，CSO-SA)。研究发现壳聚糖_硬脂酸嫁接物可在水性介质中通过自聚集形成胶束，并具有快速细胞摄取的功能。本发明采用壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束包封第三代钼类抗肿瘤药物奥沙利钼，制备奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束细胞内给药制剂，通过提高肿瘤细胞内的药物浓度，提高细胞毒性并逆转多药耐药，为提高奥沙利钼的临床抗肿瘤效力提供可能。
发明内容本发明的一个目的是提供一种奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束，是为分子靶标位于细胞内的奥沙利钼，提供一种靶向给药载体材料，由壳聚糖-硬脂酸嫁接物、奥沙利钼、卵磷脂和水所组成，其中壳聚糖-硬脂酸嫁接物占总重量的0.5%、奥沙利钼占总重量的0.009-0.02%、卵磷脂占总重量的0-0.2%、水占总重量的99.27-99.49%；壳聚糖-硬脂酸嫁接物由平均分子量1.5kD51kD的低分子量壳聚糖，与CltlC22的脂肪酸化学嫁接形成，壳聚糖-硬脂酸嫁接物中壳寡糖的氨基取代度为50%。当壳聚糖-硬脂酸嫁接物浓度超过临界胶束浓度时，在水性介质中可自发形成嫁接物胶束，胶束具备被细胞快速摄取的功能。本发明的嫁接物胶束的组成已为专利“表面修饰疏水改性壳寡糖聚合物给药胶团及其制备方法”(专利号ZL200610051601.0)所涵盖。本发明的奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束通过以下制备方法获得首先采用专利号ZL200610051601.0的方法合成壳聚糖-硬脂酸嫁接物取壳聚糖0.5g,精密称量，加30mL去离子水80°C下搅拌溶解，称取硬脂酸0.825g和碳二亚胺(EDC)5.5g，搅拌溶解溶于17mL无水乙醇溶液中，加热至80°C。在400rpm磁力搅拌条件下将上述乙醇溶液加入壳聚糖溶液中，80°C恒温搅拌反应4小时，冷却至室温(25°C)，将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析3天。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳聚糖_硬脂酸嫁接物。然后通过下述三种方法分别制备奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束(1)探头超声法取25mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，加入5mL去离子水，冰浴探头超声10次(400w，工作2s停3s)，得5mg/mL的胶束溶液。加入0.5mL药物浓度为5mg/mL的奥沙利钼水溶液。冰浴条件下探头超声50次(400W，工作2s停3s)，得奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束溶液。(2)薄膜分散法取25mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，加入0.5mL药物浓度为5mg/mL的奥沙利钼水溶液中，水浴探头超声(同a)溶解后加入0.75mL无水乙醇溶液。45°C下旋转蒸发除去溶剂，得到载药胶束薄膜，将其用5mL去离子水分散，得奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束溶液。(3)卵磷脂介导薄膜分散法取25mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，加入0.5mL药物浓度为5mg/mL的奥沙利钼水溶液中，水浴超声溶解后加入溶度为10mg/mL的卵磷脂乙醇溶液0.75mL。45°C下旋转蒸发除去溶剂，得到载药胶束薄膜，将其用5mL去离子水分散，得奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束溶液。本发明的另一个目的是提供奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。尤其在在制备抗乳腺癌、大肠癌、肝癌、卵巢癌、白血病药物中的应用。与奥沙利钼溶液剂相比，通过奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束给药，可显著提高肿瘤细胞内的药物浓度，提高细胞毒性并逆转多药耐药。本发明的有益之处是壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束具有聚合物胶束体内的被动靶向和肿瘤细胞的快速摄取功能，通过壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束对奥沙利钼的包封，可大大提高分子靶标位于肿瘤细胞内的奥沙利钼的细胞内药物浓度，提高细胞毒性并逆转多药耐药，为提高奥沙利钼的临床抗肿瘤效力提供可能。附图表说明图1为奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束对不同肿瘤细胞的生长抑制曲线。图2为敏感和耐药肿瘤细胞内药物浓度的经时变化。具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例一1)低分子量壳聚糖的制备取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95%)90g，加至3000mLl.25%(ν/ν)的盐酸水溶液中，5560°C温度条件下，溶涨2小时后，加入5%的纤维素酶(w/w)，在5560°C温度条件下进行降解。控制反应温度和时间，得低分子量壳聚糖。所得降解反应液，使用50Kda和IOKda超滤膜(Biomax-10,MilliporeCo.，USA)超滤分级后，取分子量1050Kda超滤液冷冻干燥。凝胶渗透色谱法测定壳聚糖分子量，采用TSK-gelG3000SW色谱柱，0.lmol/L醋酸钠(ρΗ6·0)为流动相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.OKda的葡聚糖标样制备洗脱曲线，用该洗脱曲线计算壳聚糖分子量。经测定所得壳聚糖的重均分子量为18.OkDa02)壳聚糖_硬脂酸嫁接物合成取上述壳聚糖0.5g，精密称量，加30mL去离子水80°C下搅拌溶解，称取硬脂酸0.825g和碳二亚胺伍005.58，搅拌溶解溶于17!^无水乙醇溶液中，加热至801。在400rpm磁力搅拌条件下将上述乙醇溶液加入壳聚糖溶液中，80°C恒温搅拌反应4小时，冷却至室温(25°C)，将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析3天。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳聚糖_硬脂酸嫁接物。采用2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)法测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度(substitutiondegree,SD)。取同分子量的壳聚糖10mg，置于IOml的容量瓶中，用去离子水定容，即得到lmg/ml的壳聚糖储备液，分别取0、10、50、100、200、300、400、500μ1，用去离子水定容至2.0ml，加入4%碳酸氢纳2.Oml和0.1%三硝基苯磺酸2.0ml，于37°C水浴孵育2h。加入2.Omol/L盐酸2ml，摇勻，超声赶走气泡，利用紫外分光光度计在344nm处测定吸光度，制备标准曲线。另精密称定嫁接物10mg，置于IOml容量瓶中，去离子水定容。取300μ1，同法操作，测定344nm处的吸光度，按标准曲线计算聚合物的氨基取代度为6.89%采用芘荧光法测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取0.0012mg/ml芘的丙酮溶液0.5ml放入IOml的试管中，50°C下挥干丙酮。配制0.00lmg/mllmg/ml不同浓度的嫁接物溶液，分别取5ml加入到上述试管中(芘终浓度为7X10-7mol/L)，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在374nm和385nm荧光强度，并以测定1375/1385倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶束浓度为0.119mg/mL。采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位。经测定，lmg/mL的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位分别为34.Snm和50.8mV03)奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束制备取25mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，加入5mL去离子水，冰浴探头超声10次(400w,工作2s停3s)，得5mg/mL的胶束溶液。加入0.5mL药物浓度为5mg/mL的奥沙利钼水溶液。冰浴条件下探头超声50(400W,工作2s停3s)，得奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束溶液。lmg/mL壳聚糖-硬脂酸嫁接物浓度的奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径、电位及通过电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)测得的药物包封率和载药量结果见表1。壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的数均粒径为30.4nm,电位为50.3mV，药物包封率为18.1%，药物负载量为1.78%。实施例二1)低分子量壳聚糖的制备取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95%)90g，加至3000mLl.25%(ν/ν)的盐酸水溶液中，5560°C温度条件下，溶涨2小时后，加入5%的纤维素酶(w/w)，在5560°C温度条件下进行降解。控制反应温度和时间，得低分子量壳聚糖。所得降解反应液，使用50Kda和IOKda超滤膜(Biomax-10,MilliporeCo.，USA)超滤分级后，取分子量1050Kda超滤液冷冻干燥。凝胶渗透色谱法测定壳聚糖分子量，采用TSK-gelG3000SW色谱柱，0.lmol/L醋酸钠(ρΗ6·0)为流动相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.OKda的葡聚糖标样制备洗脱曲线，用该洗脱曲线计算壳聚糖分子量。经测定所得壳聚糖的重均分子量为18.OkDa02)壳聚糖_硬脂酸嫁接物合成取上述壳聚糖0.5g，精密称量，加30mL去离子水80°C下搅拌溶解，称取硬脂酸0.825g和碳二亚胺(EDC)5.5g，搅拌溶解溶于17mL无水乙醇溶液中，加热至80°C。在400rpm磁力搅拌条件下将上述乙醇溶液加入壳聚糖溶液中，80°C恒温搅拌反应4小时，冷却至室温(25°C)，将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析3天。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳聚糖_硬脂酸嫁接物。采用2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)法测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度(substitutiondegree,SD)。取同分子量的壳聚糖10mg，置于IOml的容量瓶中，用去离子水定容，即得到lmg/ml的壳聚糖储备液，分别取0、10、50、100、200、300、400、500μ1，用去离子水定容至2.0ml，加入4%碳酸氢纳2.Oml和0.三硝基苯磺酸2.0ml，于37°C水浴孵育2h。加入2.Omol/L盐酸2ml，摇勻，超声赶走气泡，利用紫外分光光度计在344nm处测定吸光度，制备标准曲线。另精密称定嫁接物10mg，置于IOml容量瓶中，去离子水定容。取300μ1，同法操作，测定344nm处的吸光度，按标准曲线计算聚合物的氨基取代度为6.89%采用芘荧光法测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取0.0012mg/ml芘的丙酮溶液0.5ml放入IOml的试管中，50°C下挥干丙酮。配制0.00lmg/mllmg/ml不同浓度的嫁接物溶液，分别取5ml加入到上述试管中(芘终浓度为7X10-7mol/L)，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在374nm和385nm荧光强度，并以测定1375/1385倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶束浓度为0.119mg/mL。采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位。经测定，lmg/mL的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位分别为34.Snm和50.8mV03)奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束制备取25mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，加入0.5mL药物浓度为5mg/mL的奥沙利钼水溶液中，水浴超声溶解后加入0.75mL无水乙醇溶液。45°C下旋转蒸发除去溶剂，得到载药胶束薄膜，将其用5mL去离子水分散，得奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束溶液。lmg/mL壳聚糖-硬脂酸嫁接物浓度的奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径、电位及通过电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)测得的药物包封率和载药量结果见表1。壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的数均粒径为44.9nm,电位为51.8mV,药物包封率为41.3%，药物负载量为3.97%。实施例三1)低分子量壳聚糖的制备取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95%)90g，加至3000mLl.25%(ν/ν)的盐酸水溶液中，5560°C温度条件下，溶涨2小时后，加入5%的纤维素酶(w/w)，在5560°C温度条件下进行降解。控制反应温度和时间，得低分子量壳聚糖。所得降解反应液，使用50Kda和IOKda超滤膜(Biomax-10,MilliporeCo.，USA)超滤分级后，取分子量1050Kda超滤液冷冻干燥。凝胶渗透色谱法测定壳聚糖分子量，采用TSK-gelG3000SW色谱柱，0.lmol/L醋酸钠(ρΗ6·0)为流动相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.OKda的葡聚糖标样制备洗脱曲线，用该洗脱曲线计算壳聚糖分子量。经测定所得壳聚糖的重均分子量为18.OkDa02)壳聚糖_硬脂酸嫁接物合成取上述壳聚糖0.5g，精密称量，加30mL去离子水80°C下搅拌溶解，称取硬脂酸0.825g和碳二亚胺(EDC)5.5g，搅拌溶解溶于17mL无水乙醇溶液中，加热至80°C。在400rpm磁力搅拌条件下将上述乙醇溶液加入壳聚糖溶液中，80°C恒温搅拌反应4小时，冷却至室温(25°C)，将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析3天。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳聚糖_硬脂酸嫁接物。采用2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)法测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度(substitutiondegree,SD)。取同分子量的壳聚糖10mg，置于IOml的容量瓶中，用去离子水定容，即得到lmg/ml的壳聚糖储备液，分别取0、10、50、100、200、300、400、500μ1，用去离子水定容至2.0ml，加入4%碳酸氢纳2.Oml和0.1%三硝基苯磺酸2.0ml，于37°C水浴孵育2h。加入2.Omol/L盐酸2ml，摇勻，超声赶走气泡，利用紫外分光光度计在344nm处测定吸光度，制备标准曲线。另精密称定嫁接物10mg，置于IOml容量瓶中，去离子水定容。取300μ1，同法操作，测定344nm处的吸光度，按标准曲线计算聚合物的氨基取代度为6.89%采用芘荧光法测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取0.0012mg/ml芘的丙酮溶液0.5ml放入IOml的试管中，50°C下挥干丙酮。配制0.00lmg/mllmg/ml不同浓度的嫁接物溶液，分别取5ml加入到上述试管中(芘终浓度为7X10-7mol/L)，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在374nm和385nm荧光强度，并以测定1375/1385倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶束浓度为0.119mg/mL。采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位。经测定，lmg/mL的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位分别为34.Snm和50.8mV03)奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束制备及其理化性质测定取25mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，加入0.5mL药物浓度为5mg/mL的奥沙利钼水溶液中，水浴超声溶解后加入溶度为lOmg/mL的卵磷脂乙醇溶液0.75mL。45°C下旋转蒸发除去溶剂，得到载药胶束薄膜，将其用5mL去离子水分散，得奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束溶液。lmg/mL壳聚糖-硬脂酸嫁接物浓度的奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径、电位及通过电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)测得的药物包封率和载药量结果见表1。壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的数均粒径为95.7nm,电位为51.8mV，药物包封率为47.2%,药物负载量为3.50%。4)奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束在抗肿瘤治疗中的应用采用大肠癌(SGC-7901)细胞、卵巢(SK0V3)癌细胞、肝癌(BEL-7402)细胞、白血病(K562)细胞、乳腺癌(MCF-7)细胞和耐阿霉素乳腺癌(MCF-7/Adr)细胞为模型细胞，以游离药物作对照，通过四唑盐比色法(MTT法)考察奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束对肿瘤细胞的细胞毒性，评价奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的抗肿瘤活性。细胞以含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液培养在培养瓶中，置于37°C培养箱中，通入5%C02(相对湿度为95%)，2天换一次培养液，并于倒置显微镜下观察细胞生长状态，待细胞生长至近融合时，用胰蛋白酶消化，将细胞按10000/孔的密度接种于96孔培养板中，培养24h，待细胞贴壁生长后，吸去培养液，用PBS冲洗一遍，然后加入新鲜的培养液，同时分别加入不同浓度的奥沙利钼载药胶团及游离奥沙利钼溶液，每个浓度设3个平行孔，并设阴性对照孔，继续培养48h后，每孔中加入5mg/mlMTT水溶液20μ1，再培养4h，吸去孔内培养液，每孔中再加入DMSOlOOy1溶解紫色结晶产物，37°C振摇30min后，用酶标仪在570nm测定吸光度。细胞毒性结果见表2和图1。结果显示，通过嫁接物胶束介导可显著增加奥沙利钼药物对肿瘤细胞的毒性，并可以实现逆转耐药，其逆转倍数约为5.72倍。图IA中，SGC-7901细胞()游离药物和()实施例三载药胶束；SK0V3细胞(■)游离药物和(□)实施例三载药胶束；BEL-7402细胞(▲)游离药物和(Δ)实施例三载药胶束；Κ562细胞(·)游离药物和(〇)实施例三载药胶束。图IB中，MCF-7细胞(■)游离药物和(口)实施例三载药胶束；MCF-7/Adr细胞(·)游离药物和(〇)实施例三载药胶束。LogC表示药物浓度的对数。5)奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束的细胞内经时药物浓度测定当MCF-7和MCF-7/Adr细胞成对数生长时，把他们按100，000/孔的密度接种在24孔培养板中，继续培养24小时，待细胞贴壁生长后，向其中加入奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束胶团(恒定药物浓度为20μg/ml)，并以同浓度的游离药物作对照，于37°C分别孵育2h、4h、6h、8h、12h后，弃去原培养液，用冰PBS(pH7.4)冲洗3次，终止药物的摄取和除去粘附在细胞膜上的药物。向细胞中加入50μ1胰酶，将粘附在培养板上的细胞消化下来，然后向其中加入950μ1PBS，收集细胞悬液，用电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)测定各时间点细胞内奥沙利钼的浓度。细胞悬液中蛋白浓度校正取上述细胞悬液20uL，加入96孔培养板中，加入200uL的BCA工作液，37°C下放置30min以上。用酶联检测仪在570nm处测定吸光值。根据已知浓度的牛血清白蛋白制作标准曲线，并用该曲线计算细胞悬液中的蛋白浓度。细胞内的药物浓度经时测定结果见图2。结果显示，通过嫁接物胶束介导可显著增加肿瘤细胞内的药物浓度；在短时间内，细胞内药物浓度随着孵育时间的延长而增加。与肿瘤细胞共孵育12h后，MCF-7细胞中以嫁接物胶束形势给药的细胞内药物浓度与以游离药物形式给药相比提高了4.57倍；MCF-7/Adr细胞中以嫁接物胶束形势给药的细胞内药物浓度与以游离药物形式给药相比提高了4.77倍。表1不同方法制得的奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束理化性质<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PI代表数均粒径的分散指数表2奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束对不同肿瘤细胞的IC5tl值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>IC50表示半数细胞致死浓度。权利要求一种奥沙利铂壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束，其特征在于，由壳聚糖-硬脂酸嫁接物、奥沙利铂、卵磷脂和水所组成，其中壳聚糖-硬脂酸嫁接物占总重量的0.5％、奥沙利铂占总重量的0.009-0.02％、卵磷脂占总重量的0-0.2％、水占总重量的99.27-99.49％；壳聚糖-硬脂酸嫁接物由平均分子量1.5kD～51kD的低分子量壳聚糖，与C10～C22的脂肪酸化学嫁接形成，壳聚糖-硬脂酸嫁接物中壳寡糖的氨基取代度为1％～50％。2.根据权利要求1所述的一种奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的制备方法，其特征在于，先根据CN100417417C的公开的方法获得壳聚糖-硬脂酸嫁接物，再通过三种方法分别制备奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束(1)壳聚糖_硬脂酸嫁接物制备取壳聚糖0.5g，精密称量，加30mL去离子水80°C下搅拌溶解，称取硬脂酸0.825g和碳二亚胺(EDC)5.5g，搅拌溶解溶于17mL无水乙醇溶液中，加热至80°C。在400rpm磁力搅拌条件下将上述乙醇溶液加入壳聚糖溶液中，80°C恒温搅拌反应4小时，冷却至室温(25°C)，将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析3天。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳聚糖-硬脂酸嫁接物；(2)奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束制备A.探头超声法取25mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，加入5mL去离子水，冰浴探头400w超声10次，得5mg/mL的胶束溶液，加入0.5mL药物浓度为5mg/mL的奥沙利钼水溶液，冰浴条件下探头400W超声50次，得奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束溶液；B.薄膜分散法取25mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，加入0.5mL药物浓度为5mg/mL的奥沙利钼水溶液中，水浴超声溶解后加入0.75mL无水乙醇溶液，45°C下旋转蒸发除去溶剂，得到载药胶束薄膜，将其用5mL去离子水分散，得奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束溶液；C.卵磷脂介导薄膜分散法取25mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，加入0.5mL药物浓度为5mg/mL的奥沙利钼水溶液中，水浴超声溶解后加入溶度为lOmg/mL的卵磷脂乙醇溶液0.75mL，45°C下旋转蒸发除去溶剂，得到载药胶束薄膜，将其用5mL去离子水分散，得奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束溶液。3.根据权利要求2所述的一种奥沙利钼壳聚糖_硬脂酸嫁接物胶束的制备方法，其特征在于，步骤B和C中，水浴超声的条件同A。4.根据权利要求1所述的一种奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。5.根据权利要求4所述的一种奥沙利钼壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，在制备抗乳腺癌、大肠癌、肝癌、卵巢癌、白血病药物中的应用。全文摘要本发明提供一种奥沙利铂壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束，由0.5％壳聚糖-硬脂酸嫁接物、0.009-0.02％奥沙利铂、0-0.2％卵磷脂和水所组成。通过(1)探头超声法(2)薄膜分散法，(3)卵磷脂介导薄膜分散法分别制备获得。壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束具有聚合物胶束体内的被动靶向和肿瘤细胞的快速摄取功能，通过壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束对奥沙利铂的包封，可大大提高分子靶标位于肿瘤细胞内的奥沙利铂的细胞内药物浓度，提高细胞毒性并逆转多药耐药，提高奥沙利铂的临床抗肿瘤效力。可在制备抗肿瘤药物中的应用。文档编号A61P35/00GK101797220SQ20101014112公开日2010年8月11日申请日期2010年4月6日优先权日2010年4月6日发明者杜永忠,胡富强,袁弘申请人:浙江大学