一种ercc1基因多态性扩增检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于生物技术领域，具体涉及一种ERCCl基因多态性扩增检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 铂类药物是对具有生物活性的含铂化合物药物的总称，是最常用的肿瘤化疗药物 之一，包括顺铂、卡铂和奥沙利铂等。其药理学机制主要是通过引起肿瘤细胞内DNA的交联， 形成链内/链间DNA加合物抑制细胞，阻碍DNA合成与复制，从而抑制肿瘤细胞的生长。但因 治疗过程中伴发严重的胃肠道反应、肾及神经毒性，临床往往因为患者无法耐受而被迫终 止铂类药物的治疗，同时也发现相当一部分患者对铂类药物产生耐药性。对铂类药物的抵 抗可通过以下机制发生:减少药物积聚、通过共辄结合解除药物毒性，提高对铂类药物诱导 产生的DNA加合物的耐受性，或者提高DNA修复能力。科学研究证明铂类药物的疗效和副作 用存在显著地个体差异：患者本身遗传特征的差异是主要的原因之一，主要涉及DNA修复相 关基因和解毒酶相关基因的多态性及表达量。经大量研究证实，ERCCl基因是铂类药物疗效 检测主要革巴标之一(Evans WE1Relling MVjPharmacogenomics:translating functional genomics into rational therapeutics·Science[J]·1999，286:487-491)〇
[0003] 切除修复交叉互补基因 l(excision repair cross-complementing rodent repair deficiency ,complementation group I，ERCC1)是核苷酸外切修复家族中的重要 成员。核苷酸切除修复(NER)是最重要的细胞修复，在NER途径中，ERCCl基因发挥了重要作 用，对肿瘤细胞的影响表现为对铂类药物的敏感性的高低不同。ERCCl基因多态性可以改变 ERCCl的DNA修复能力，其第118密码子OT突变后，能够影响ERCCl基因表达的蛋白质水平， 其中T等位基因 ERCClmRNA水平更高，则会有更强的DNA修复能力。可导致患者铂类药物化疗 的敏感性下降，疗效降低。因此，检测ERCCl基因第118密码子OT基因多态性具有很强的临 床实用价值（Shirota Yl ,Stoehlmacher J，Brabender J ERCCland thymidylate synthase mRNAlevels predict survival for colorectal cancer patients receiving combination oxaliplatin and fluorouracil chemotherapy.J Clin Oncol.2001Dec I; 19(23):4298-304)。 【实用新型内容】
[0004] 本实用新型的目的：提供一种ERCCl基因多态性扩增检测试剂盒，能较好的应用于 ERCCl基因第118密码子OT基因多态性检测，体积小，便于运输携带和使用，克服了目前对 ERCCl检测特异性不强，检测成本高且方法较复杂的不足之处。
[0005] 为实现上述目的，本实用新型采用以下技术方案：
[0006] 一种ERCCl基因多态性扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：盒体 (1 )、衬垫(2 )，所述的衬垫(2)置于盒体（1)内，衬垫(2)上设有容器孔装有DNA提取试剂的可 立冻存管(3)，装有PCR反应液的可立冻存管(4)、装有阳性对照1的可立冻存管(5)、装有阳 性对照2的可立冻存管(6 )、装有阳性对照3的可立冻存管(7 )、装有阴性对照的可立冻存管 (8)。试剂盒结构如图1所示。
[0007] 上述的装有DNA提取液和PCR反应液的可立冻存管为2ml可立冻存管，装有阳性对 照1、阳性对照2、阳性对照3、阴性对照的可立冻存管均为0.5ml可立冻存管。
[0008] 上述的PCR反应液包括DNA聚合酶、UNG酶、引物、探针及Mg2+，所述的探针为TaqMan MGB探针（美国Applied Biosystems公司生产）。
[0009] 优选地，所述的阳性对照包括3组，阳性对照1为含野生型纯合子ERCCl序列的质 粒;阳性对照2为含突变体纯合子ERCCl序列的质粒；以及阳性对照3为等比例混合的阳性对 照1和阳性对照2。
[0010]进一步优选地，所述的检测试剂盒的检测样本为m)TA(乙二胺四乙酸)抗凝全血。
[0011] 根据所述的ERCCl基因多态性检测试剂盒的检测方法，其主要特点是，所述的检测 方法包括样本的基因组DNA提取，以样本基因组DNA为模板的扩增检测，检测结果的分析。
[0012] 优选地，所述的样本处理步骤包括：
[0013] 1.将含Iml样本的离心管充分振荡，12000rpm离心5分钟，弃上清。
[0014] 2.沉淀中加入ImL生理盐水，旋涡振荡器上振荡分散沉淀，12000rpm离心5分钟，弃 上清。
[0015] 3.往沉淀中加入已振荡混匀的DNA提取液50yL，旋涡振荡器上振荡打散沉淀，99 °C 干浴或者水浴10分钟。
[0016] 4. 12000rpm离心5分钟，在不触动管子底部的沉淀物的情况下吸取上清液用于 PCR反应。
[0017] 更优选地，所述的PCR扩增步骤包括：
[0018] 1.样品设置:在仪器软件的相应样本设置窗口内填写各样本的名称。
[0019] 2.荧光通道选择:每个样品选择FAM和VIC 2个通道。参比荧光设置为none。
[0020] 3.反应条件设定:反应体积设定为50yL，反应条件如下:UNG酶反应条件:37 °C加热 5分钟，预变性条件为95°C加热5分钟，变性条件为95°C，15秒，以及退火、延伸及检测荧光条 件为60°C，1分钟，共40个循环。
[0021 ]进一步优选地，所述的四个对照组检测标准如下：
[0022] 阴性对照:FAM通道和VIC通道无明显扩增曲线，且Ct显示为Undet。
[0023] 阳性对照I: VIC通道有扩增曲线，且Ct〈36;FAM通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示 为Undet〇
[0024] 阳性对照2: FAM通道有扩增曲线，且Ct〈36; VIC通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示 为Undet〇
[0025] 阳性对照3:FAM、VIC通道有典型的扩增曲线，且Ct〈36;
[0026] 上述四个条件必须同时满足，否则，本次试验无效。
[0027]进一步优选地，所述的ERCCl的基因多态性位点为第118密码子OT位点。
[0028] 采用了该实用新型检测试剂盒，其优点在于：
[0029] 1.操作简单、快速，本实用新型核酸抽提部分采用煮沸法，操作简单，仅需要一般 实验室所使用的离心机和水浴锅或金属浴即可，在35分钟内便可完成样本核酸的抽提处理 全过程，且扩增部分可一次进行最多96个样本的测试（含3个阳性对照和1个阴性对照样 本)。
[0030] 2.降低耗材的使用以便降低检测成本，采用本实用新型的方法在操作的全过程中 需要的耗材只有核酸抽提所使用的1.5ml离心管、扩增使用的八连管或96孔板以及移液器 吸头。
[0031 ] 3.检测结果准确，降低假阳性结果的出现，在扩增步骤加入阴性对照和阳性对照， 以此可以有效提高对假阳性和假阴性出现的判断。
[0032] 4.对实验污染的有效减少，a.本实用新型采用荧光探针PCR方法，既将核酸的PCR 扩增所用试剂组分一次性加入反应管中并采用荧光PCR仪进行扩增反应，为全封闭反应检 测环境;b.加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)并以dUTP替代dNTP等PCR污染控制措施可有效防 止PCR的污染;c.采用TaqMan MGB探针以提高检测特异性；用于检测ERCCl基因多态性的等 位基因特异性核酸引物和用于检测ERCCl基因多态性的寡核苷酸探针，探针为TaqMan MGB 探针，TaqMan MGB探针与传统的TaqMan探针相比，其在扩增检测过程中可有效降低背景信 号的