Hsa-miR-3200-5p在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物检测技术领域，是microRNAs在制备早期筛查或诊断 Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是目前全球死亡率最高的恶性肿瘤。美国每年大约有17万人死于肺癌，占整 体癌症死亡人数的30%。随着经济的快速发展和空气污染的日益加重，我国的肺癌发病率 也呈现逐年上升的趋势，已经成为我国城市人口癌症死亡的首要原因。据统计，肺癌患者的 五年生存率仅为5-15%，其主要原因在于难于早期发现，大部分患者就诊时已经发生了不 同程度的转移。如死于肺癌的患者的尸检中，有90 %左右都会出现脊柱转移病灶，肺癌的转 移成为患者生存期短预后差的重要原因，且转移病灶的巨大疼痛也使得患者的生存质量严 重下降，加速了患者的死亡进程。虽然国际上对于肺癌转移的治疗已由原先的消极对症转 为以外科手术为主辅以化疗、放疗、靶向治疗等多学科协作的综合性模式，患者的生存期和 生存质量在一定程度上得到了提高，但由于缺乏简便有效的早期筛查方法以及对肺癌发生 和转移机制认知不足、治疗方式的局限，肺癌仍然是造成患者死亡率居高不下的重要原因。 目前国际上对于肺癌高危人群的筛查主要应用低剂量CT扫描，但由于相对较高的成本和 辐射制约了其在临床上的广泛应用。基于以上原因，早期发现与肿瘤发生和转移进程相关 的分子诊断标记物便可以为肿瘤治疗赢取一定的时间，成为控制肿瘤发展的重要途径。为 了达到这一目的，首先要找出相较于正常体细胞，在肺癌中发生特异性表达改变并与转移 等多种肿瘤发展进程密切相关的肿瘤"靶点"，即找到与肝细胞中著名的甲胎蛋白（AFP)有 相似点的肿瘤标记物。
[0003] "肿瘤靶标"这一概念早已被广泛认可并进行了大量的研宄，这一概念的核心是找 到仅在肿瘤中特异性表达而在正常组织中不表达或局限性表达的分子，通过"生物导弹"直 击肿瘤，对正常组织造成最小化的破坏。这一概念的出现和随之进行的大量研宄正逐渐使 肿瘤独有的特征具现化，并有可能最终"无所遁形"，也使得人类在与肿瘤的斗争中掌握了 一定的主动权。对肿瘤的早期发现和有效治疗都有重大意义。
[0004] TATA-box转录因子Brachyury是T-box转录因子家族的成员之一，其同源体 在诸多多细胞生物体内表达，如秀丽线虫、非洲爪蛙、老鼠、人类等胚胎中表达（参见 文献 Papaioannou VE, Silver LM, et al. The T-box gene family. Bioessays 1998 ； 20:9-19. Kispert A，Herrmann BGj et al. Homologs of the mouse Brachyury gene are involved in the specification of posterior terminal structures in Drosophila，Tribolium，and Locusta. Genes Dev 1994 ；8:2137-50. Herrmann BG，Labeit S，et al. Cloning of theTgene required in mesoderm formation in the mouse. Nature 1990 ;343:617-22)。T-box蛋白主要在中胚层的形成和分化中具有重要作用，在胚胎发育 晚期则在大部分组织中关闭表达仅集中于脊索区表达，并在脊柱形成后随着脊索的退化消 失而在大多数正常成人组织中不表达，仅在睾丸中有表达、脾和小肠中有低水平表达的限 制性表达方式（参见文献 Duane H. Hamilton, Ph. D·，Postdoctoral Fellow, et al. Cancer vaccines targeting the epithelial-mesenchymal transition:tissue distribution of Brachyury and other drivers of the mesenchymal-like phenotype of carcinomas. Semin Oncol. 2012Jun ;39(3) :358-66.)。然而，在已知的人类多种肿瘤组织和细胞系 中，Brachyury却呈现出高水平的表达，这些肿瘤组织和肿瘤细胞系是：小肠、胃、肾、膀 胱、子宫、卵巢、睾丸、脑和淋巴组织，肺组织、结肠组织和前列腺组织来源的细胞系（参见 文献 Palena C, Polev DE, et al. The human T-box mesodermal transcription factor Brachyury is a candidate target for T-cell-mediated cancer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2007 Apr 15 ； 13 (8):2471-8. Park JC1Chae YK, et al. Epigenetic silencing of human T(brachyury homologue)gene in non-small-cell lung cancer. Biochem Biophys Res Commun. 2008 Jan 11 ;365 (2) : 221-6.)。以上研宄结果都提不了 Brachyury 可以应用于多种来源的肿瘤诊断和治疗中。然而，如何应用肿瘤组织中高表达的Brachyury 对人群进行早期无创性的肿瘤筛查或进行临床诊断却没有具体有效的方法和研宄。作为转 录因子，Brachyury具有强大的启动或抑制下游基因转录的作用，因此，通过检测其下游被 调控的某些易检测分子如外分泌蛋白质或miRNA的表达量便可以作为Brachyury表达水平 的指标。
[0005] microRNA是仅有20-24bp的非编码短链核苷酸片段，在外周血中具有稳定的表达 谱，且无性别差异，而肿瘤患者的microRNAs表达谱则发生显著变化（参见文献Chen X，Ba Y, et al. Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 20080ct;18(10):997-1006.)由 于microRNAs出细胞时被脂质微泡（Micro vesicle)保护，因此能够保持稳定，易于检测， 在冰冻组织、福尔马林固定组织、石蜡组织，体液如外周血、痰液、唾液、胸膜积液中都能够 进行检测，且由于microRNA片段较短，大大降低了检测成本，因此，其作为无创性肿瘤早 期诊断标记物的研宄日益增多（参见文献Du M, Liu S et al. Clinical potential role of circulating microRNAs in early diagnosis of colorectal cancer patients. Carcinogenesis. 2014 Sep 19.Jeong HC. Clinical Aspect of MicroRNA in Lung Cancer. Tuberc Respir Dis(Seoul). 2014Aug ；77 (2):60-4.)
[0006] 根据文献检索，国际上对于miR-3200-5p的功能及表达未见报道，仅在一篇针对 核因子Kappa B(NF- κ B)下游micorRNAs表达谱的研宄中发现miR-3200-3p可能为NF- κ B 的靶基因。在肺癌发生发展和诊断中的作用亦未见报道。
[0007] 目前的研宄尚未见与肿瘤特异性靶标相关联的microRNAs作为肿瘤（包括肺癌 等）早期诊断的标记物，也尚未有用于检测这一系列microRNAs在血清中含量的试剂盒来 针对部分存在Brachyury过表达的肿瘤（包括肺癌等）患者进行筛查。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于寻找到与Brachyury高表达肺癌相关的肿瘤分子标记物，本发 明的另一目的在于提供某一 microRNA在制备早期筛查或临床诊断Brachyury阳性肿瘤试 剂或试剂盒中的应用。
[0009] 本发明的主要技术方案：为了寻找被Brachyury调控的microRNAs，本发明人 在肺癌细胞H1299和作为正常人体对照细胞293T中利用慢病毒感染技术转入外源性 Brachyur