专利名称：枯草芽孢杆菌及其作为绿霉抑制剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及预防蘑菇上霉菌发生的蘑菇培养和产品。
背景技术：
蘑菇市场每年持续增长。这是由于对蘑菇的烹饪、营养和健康益处的越来越多的 关注。但是蘑菇的商业生产是复杂的程序。其涉及一系列步骤包括培养料制备、培养料巴氏 灭菌、用菌种体接种培养料、孵育以允许具有蘑菇菌丝体的培养料的定殖、扭结(pinning) 和采收。在任何这些阶段的病原体污染可以导致严重的产量损失。本文使用术语“蘑菇(mushroom)”是指不同类型的蘑菇。这包括最常见栽培 的蘑菇双孢蘑菇(Agaricus bisporus)，并且还包括其他类型的蘑菇例如蚝蘑(oyster mushrooms)、褐蘑(crimini mushroom)、波多贝罗蘑 (portobello mushrooms)禾口香 (shitake mushrooms),只提及了一部分。对于成功的大规模蘑菇生产的主要威胁是绿霉。绿霉是由木霉属(Trichoderma) 侵染导致。不同类型的木霉(Trichoderma spp.)可以导致绿霉侵染。鉴定为哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)生物型4的特别致病的菌株是引起20世纪90年代美国绿霉大 流行的原因。当孕育培养的蘑菇植床被木霉霉菌侵染时，非生产性区域出现在外管表面导 致严重的产量损失。培养料侵染可以导致绿孢子形成(sporylation)，所述绿孢子形成可以 转变为蘑菇菌丝体不定殖的黑斑。对于控制绿霉侵染已经做了不同的尝试。例如美国专利第6061951号描述了蘑菇 植床覆盖物。该文所述发明涉及覆盖物的用途，所述覆盖物包括一系列选择用来在孕育培 养时控制(X)2比率和氧气比率的孔或口，以便降低绿霉的比率。尽管该覆盖物可以降低绿 霉侵染的比率，但是不能完全预防。此外，还可能有其他与覆盖植床相关的不利之处，包括 过高的(X)2含量和培养料过度加热。控制绿霉的另一个尝试描述于美国专利第576 号。该专利描述了包含铜绿假 单胞菌O^eudomonas aeruginosa)的组合物的用途，其可以应用于培养料、菌种体或补料 以预防或抑制绿霉的生长。尽管所述假单胞菌属组合物表现出具有一定的抑制绿霉的效 果，但是使用假单胞菌属作为大规模的绿霉灭菌剂是不可行的，因为假单胞菌属与人体中 数种致病状态有关。尽管生物控制剂已经表现出在某些类型植物上的霉菌预防中取得一定成功，在蘑 菇生产中的霉菌控制还是提供了独特的挑战。因为蘑菇和霉菌一样是真菌，所以杀死污染 霉菌的试剂也可能对蘑菇产生不利影响。因此，对于能够控制绿霉而不产生对蘑菇生产的不利影响的试剂，仍然存在未满 足的需求。所述试剂还应该对于人类摄取是安全的。发明概述本发明提供用于预防和/或控制蘑菇生产过程中霉菌污染的试剂、组合物和方 法。在本发明的第一方面中，提供了抑制蘑菇中由木霉导致的绿霉的方法。所述方法包含给予有效量的包含芽孢杆菌(Bacillus spp.)的组合物。所述芽孢杆菌属可以直接应 用到蘑菇培养料内或者可以并入蘑菇菌种体补料中。在优选的实施方案中，所述芽孢杆菌 属配制成可以应用于蘑菇植床的喷雾。所述喷雾的组成可以是水性的。在优选的实施方案 中，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus, subtilis)。在另一优选的实施方案中，所述芽孢杆菌包含菌株J-P13。在又一优选的实施方案中，所述组合物还包含载体。载体的一些实例包括但不限 于微载体珠(microcarrier beads)、颗粒(granules)、微粒(particles)、蛋白胨溶液、油、 蜡、凝胶和水。在优选的实施方案中，所述载体是水。在本发明的另一方面中，提供了芽孢杆菌菌株J-P13的生物纯培养物。在本发明的另一方面中，提供了用于控制或预防植物中或植物生产组分中的木霉 生长的工艺。所述工艺包括应用含有芽孢杆菌、优选地含有芽孢杆菌、更优选地含有芽孢杆 菌菌株J-P13的组合物。在优选的实施方案中，所述植物是蘑菇或蘑菇繁殖组分。在一方面中，包含芽孢杆菌的工艺、组合物是通过喷雾应用。优选地，所述组合物 是水性组合物。在本发明的另一方面，提供了包含枯草芽孢杆菌的抗真菌组合物，其中所述组合 物配制为水性溶液。附图简述从以下描述结合附图，本发明的这些特征和其他特征会变得更加清楚，其中
图1展示了来自SAC区通过空气样品采集的木霉的宏观图像；图2展示了芽孢杆菌的宏观图像，所述芽孢杆菌分离于扭结室外，通过空气样品 采集并且在a) PDA、b) MEA和SMA上涂板；图3展示了具有表现出对绿霉生长抑制的原始J-P13菌落(芽孢杆菌)的空气样 品平板；图4展示了来自扭结室的木霉的显微图像，其中该载玻片是用直接来自培养料的 孢子制作的；图5展示了来自NA分离菌平板的推定的芽孢杆菌培养物的显微图像，其中两者都 进行革兰氏染色。图片A)是在蛋白胨中收获的分离菌培养物的载玻片；图片B)是来 自静止期的分离菌；图6展示了涂布在PDA培养基平板上的绿霉孢子，以及添加到平板上的芽孢杆菌 的环状转移(loop transfer)，以显示所述两种微生物的似真共存；图7展示了纵向分割以测定芽孢杆菌培养物的影响的培养料样品。平板A)只含 有培养料；平板B)含有添加小滴蛋白胨并过夜培养生长的培养料；图8展示了添加到已存在的霉菌的芽孢杆菌培养物的效果；图9A展示了用芽孢杆菌属培养物喷雾约2小时后的测试盘1的结果。9B展示了 对聚集的绿霉生长物喷雾后的测试盘2 ；如9C中所示，测试盘3具有最少的绿霉生长物并 且在开始喷雾后就几乎看不见了；
图10展示了生长在两块PDA平板和一块SMA上以及生长在三个装有约800mL的 蛋白胨的IL烧瓶中的芽孢杆菌的分离菌；
图11展示了覆盖整盘的芽孢杆菌培养物的第二次应用后的测试盘2以及所得到 的观察；
图12展示了芽孢杆菌培养物喷雾的、发现具有绿霉的盘以及48小时后观察的结 果；
图13展示了 A)具有绿霉的盘，以及B)用抑制绿霉使其不会污染盘的剩余部分的 芽孢杆菌培养物喷雾后的盘；
图14展示了 A)盘上生长的霉菌、B)喷雾后的盘以及C)约2天后的盘的连续观 察；
图15展示了 A)盘上生长的霉菌以及B)喷雾后约2天的盘的观察；
图16A展示了包含芽孢杆菌属培养物和绿霉添加物的样品，
图16B展示顶部，图 16C展示倒转的，
图16D展示没有任何进一步绿霉生长的散开的样品；
图17A展示了初始细菌接种，
图17B展示了在具有前置盒(precase)的小容器中 的第一天的培养物，
图17C展示了生长在容器下半部的绿霉，
图17D表明菌丝体在整个样品 各处均能生长，因为绿霉被除根(irradicated)；
图18展示了水中的枯草芽孢杆菌J-P13的生长曲线；
图19用图表表明了添加了具有枯草芽孢杆菌J-P13培养物的18.9-20L蒸馏水瓶 的5至7天生长物后，孕育培养水箱中的细菌浓度；以及图20展示了 100%完全霉菌覆盖的具有10 μ L孕育培养水箱水的验证平板。50% 抑制计算为1. 6Χ IO6CFU/绿霉生长物菌苔。在PDA上使用第5天(A)和第8天(B)后的 水箱水制备以上平板并使其在25. 0°C孵育72小时。详细描述木霉侵染是商业蘑菇生产者主要关心的问题。其可以带来毁灭性的作物损失 甚至作物的完全损失而导致生产关闭。木霉属的多种物种可能是引起在蘑菇生长的任 何阶段中的蘑菇的霉菌污染的原因，所述木霉属的多种物种包括但不限于，哈茨木霉、 T. aggressivum、绿色木霉(T. viride)、Τ. inhamatum、深绿木霉(Τ. atroviride)。本发明提供用于在蘑菇生产的所有阶段中控制和/或预防绿霉的新的试剂。本 发明的生物控制剂包括芽孢杆菌。所述的试剂可以包括例如Bacillus velezensis、解淀 粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽胞杆菌(Bacillus lichenformis)、 Paenibacillus favisporus或另一芽孢杆菌属菌株。提供了在预防和控制绿霉中特别有效 的枯草芽孢杆菌菌株。本发明包括含有一定量的对预防或处理绿霉(哈茨木霉)污染有效的枯草芽 孢杆菌的组合物。有效细菌浓度是任意的，只要抑制绿霉进展。示例性的浓度范围从约 1. 5 X 106CFU/ml 至约 5 X 107CFU/ml，优选地约 5 X 106CFU/ml。细菌组合物可以以来自培养物的悬液或浆的形式提供或者细菌也可以与合适的 载体组合，所述载体例如油、蛋白胨、水或者其他任何对于人体摄取安全的合适的载体。就 经济和容易来说，水是优选的载体。增强细菌效果的或有助于蘑菇生长的其他添加剂可以 包括在细菌组合物中。细菌也可以提供在固体载体的表面或者被包囊。可选择地，细菌可 以冷冻干燥并作为粉末(powder)或粉(dust)应用。组合物可以使用例如浸渍、喷雾或擦的常规方法来应用。所述组合物还可以配制
5成可以应用于表面的包被，所述表面例如外管或蘑菇植床覆盖物。芽孢杆菌属组合物可以应用于蘑菇生产过程的任何阶段。其优选地添加到蘑菇培 养料。可选择地，它可以在与培养料混合前添加到菌种体中或者添加到外管。所述组合物还 可以应用于盘或者蘑菇作物。所述组合物可以用于预防绿霉侵染或处理已经发生的感染。结合附图，证明了枯草芽孢杆菌作为针对哈茨木霉的生物控制剂的效力。包含枯 草芽孢杆菌的组合物显示出既抑制真菌又杀真菌。从空气沉降物平板中分离了细菌菌落，其中它显示出抑制周围绿霉。在相同的平 板上还观察到所述菌落阻止绿霉的生长。一旦纯化和培养该抑制剂，其抗菌产生潜力就通 过对已知木霉孢子的抑制而显示出来。抗真菌活性的证实是通过观察杀真菌或抑制真菌作 用的有(present)/无(absent)测试、直接涂板的带有绿霉污染的材料样品以及使用并入 培养料、补料、菌种体等的合适载体的小盘实验。空气沉降物平板(马铃薯葡萄糖琼脂平板)放置在水平表面至多一小时。记录 了当时环境因素的观测，例如平板位置附近的雇员数量、活动次数，外部刺激物。为了霉菌 孢子的最适复苏，平板被密封并在22-25°C孵育48-72小时。如
图1所示，发育性木霉属 细丝以白色小叶菌丝的形式存在。如图3所示，在一块平板上，细菌菌落在其周边周围有 晕轮，其中木霉属菌丝看上去在所述菌落周围生长而不越过。分离所述菌落并将其再涂 板。如图2所示，分离的菌落是奶油色的，具有不规则边缘、创造式的隆起(creator-form elevation)，不透明，不光滑并且直径约2mm。一星期后，木霉属的存在通过显微观察确认。如图4所示，存在具有短侧枝、短的 膨胀瓶梗(烧瓶形的)的分生孢子梗和通常为绿色的、从球体到椭圆体的光滑的小分生孢 子。如图5所示，抑制细菌菌落是革兰氏阳性的、具有内生孢子，椭圆体，具有单一随机定位 细胞以及偶尔的链(occasional chain)。生化检测表明，所述细菌培养物是过氧化氢酶阳 性的，并且能够在需氧条件下，生长在没有生长因子的最小确定培养基中。该分离菌命名为 J-P13。分离菌J-P13是基于16S rRNA基因序列鉴定的，并且由圭尔夫大学实验室服务中 心(University of GueIph，Laboratory Services)将 J-P13 与全球基因库数据库(Global GeneBank Database)比较。结果表明，P13培养物匹配多于一种的芽孢杆菌属物种。进一 步研究得出与枯草芽孢杆菌具有0. 936的相似性指数。相似性指数定义作表示未知分离菌 的脂肪酸组成与MIDI数据库匹配相比较的接近程度的数值，其中0. 6至1. 0的SI表明优 秀的匹配，且1.0是最高的。如图6所示以及实施例1中更为详细讨论的那样，当枯草芽孢杆菌培养物被添加 到含有绿霉孢子的平板时，其预防绿霉的生长。当其被添加到正表现出绿霉迹象的培养料 时，如图7所示，所述培养物能阻止培养料中绿霉扩散，从而证明抑真菌活性。实施了进一 步的研究来确定所述培养物是否可以阻止培养容器中存在的绿霉。图8中展示的结果提 示，芽孢杆菌还具有针对木霉属的杀真菌活性。因为孢子容易扩散并且将生产过程中使用的所有设备完全灭菌是很困难的，所以 进行了对照测试，以确定芽孢杆菌属培养物是否可以阻止或减缓扭结室盒上的绿霉的生 长。图9、
图10、
图11和
图12中所示的以及下文实施例4中更为详细讨论的结果表明，所 述培养物能够预防孢子扩散。该结果还证实，所述培养物不仅对蘑菇生长无害，它实际上还可以对蘑菇生长产生有益影响。
图14和
图15表明，所述芽孢杆菌属组合物对实际的扭结 室盒是有效的。将芽孢杆菌属组合物应用于蘑菇菌丝体是安全的。
图16和
图17所示结果证明， 用所述组合物喷雾，菌丝体能够存活。实际上，喷雾后菌丝体可以生长得更厚。进行了实验以确定芽孢杆菌属是否可以生长在水中。
图18展示了芽孢杆菌属分 离菌在蒸馏水中的生长曲线。这些结果表明枯草芽孢杆菌可以在水中存活并生长。这提示 霉菌的有效控制可以通过用含有生物体的水喷雾来实现。所述组合物是非常成本有益的。基于此期结果，来自接种的水瓶的样品被添加到孕育培养水箱。培养物的存活和 生长通过图表形式显示在
图19中。当培养料用水喷雾时，绿霉的流行减少并且可以看到健 康的菌丝体生长。作为进一步测试，来自水箱水的每日样品与绿霉一起涂板，以确定所述细菌是否 仍然有活力并保持其抗真菌性质。图20中所示结果表明，在细菌菌落周围的晕轮中，绿霉 生长被抑制。图中所示结果第一次清楚地表明，枯草芽孢杆菌是用于预防或控制蘑菇生产中绿 霉的有效的生物控制剂。以上公开大体上描述了本发明。应当相信，本领域普通技术人员可以利用之前的 描述，制备和使用本发明的组合物，并且实践本发明的方法。为了更清楚，下文讨论证明所 述组合物和工艺的有效性的一些实验结果。对于这些样品实验的描述只是为了说明本发明 的优选的实施方案，而并不是意图限制本发明的范围。如环境可能提示或使之有利，涉及形 式上的改变和等同替换。本文提及的所有参考文件通过弓I用并入本文。为确定芽孢杆菌是否可以预防绿霉的生长进行了实验。来自分离的菌苔的绿霉孢 子被涂布在PDA平板上以产生生长物的菌苔。来自含有芽孢杆菌的营养琼脂平板的单一菌 落转移物被放置在平板的中心。平板在22-25°C孵育72小时。绿霉生长物的菌苔在芽孢杆 菌属培养物接种位置周边的周围形成。在两微生物之间形成零生长物的晕轮。结果如图6 所示。该结果表明，当芽孢杆菌和绿霉同时接种时，芽孢杆菌能够在周围区域减缓绿霉的生 长。为确定芽孢杆菌培养物是否能阻止已存在的绿霉生长物，进行了进一步实验。扭 结室具有生长在前置盒培养料上的绿霉。尽管绿霉可以从盘下面看见，但其是否遍布盘还 是不确定的。用戴手套的手从盘底的石板中间收集一秸秆(straw)片，其带有绿霉部分、白 色菌丝体以及天然秸秆。将该样品纵向分割为两部分；一部分在PDA上直接涂板，第二部分 加入小滴的J-P13培养物，其在蛋白胨中生长过夜，然后在PDA上涂板。平板在22-25°C 孵育72小时。结果如图7所示。第一块平板具有覆盖平板的80%的相当多的绿霉生长物； 伴随来自培养料的其他污染物。第二块平板具有中等的细菌生长物和来自秸秆上绿霉部分 的少许菌丝。该结果表明，芽孢杆菌培养物能够预防绿霉扩散。为了确定芽孢杆菌培养物是否可以阻止或减缓小容器培养中蘑菇菌柄上已存在 的绿霉生长，用剩余菌柄上的绿霉生长物感染收获自实验室中测试盘的蘑菇。将约7ml的 含有芽孢杆菌培养物的蛋白胨溶液直接倾倒在样品上。3天和5天后重复该步骤。所 述的盘始终保持在室温。结果如图8所示。该结果表明所述溶液是有效的。
第一次应用后，可见绿霉呈黄色。第二次应用后，菌柄上没有易见的绿色或黄色的 霉菌。这提示所述细菌培养物是杀真菌的。进行了进一步的实验，以确定芽孢杆菌培养物是否可以阻止或减缓扭结室中盒上 面已存在的绿霉的生长。评价了在农场实际盘上生长的霉菌。芽孢杆菌培养物的菌苔被收获到4块PDA平板和4块SMA平板上。平板在25V 孵育72小时并贮存在约5°C直到约一周后它们被收集到蛋白胨中。使用弯棒将菌落聚 集并转移到每烧瓶800ml的蛋白胨中。总计将两块SMA和两块PDA平板加到两个单独的蛋 白胨烧瓶中。烧瓶1立刻用等量的水和蛋白胨培养物稀释以产生参考培养物浓度。如图9 所示，使用清洁的IL喷雾瓶将烧瓶1喷雾到三个具有已存在的绿霉的测试盘上。测试盘1 是小区域，而盘2是整盘喷雾，但是对盘上存在的绿霉用更大的量进行喷雾，盘3是小角落 区域。标记了测试盘，以便区域不会受到传统环境控制杀真菌处理。几天后，测试盘用第二 烧瓶喷雾。如
图10所示，装有800ml 1 %蛋白胨的烧瓶#3、4和5用72小时收获的细菌培养 物接种，每烧瓶一平板；并且在初始接种的M小时内喷雾到相同的三个测试盘上。
图11展 示了在测试盘2上的效果。
图12展示了接种之前和之后M小时盘上的效果。烧瓶#6和7以每烧瓶一平板接种。接种的数小时内将烧瓶#6喷雾到四个新测试 盘上。烧瓶#7孵育48小时，用同等量的蛋白胨稀释并喷雾到相同的四个新测试盘上。结果表明，用足够的芽孢杆菌培养物可以减缓甚至阻止测试盘上已存在的绿霉。 所有测试盘上的绿霉被最小化。当所述培养物被喷雾到盘内污染的周边时，最少的污染扩散到剩余的盘。对于测 试盘2，整盘用芽孢杆菌喷雾，而不仅是具有绿霉的一集中部分。霉菌没有从聚集的点扩散 出去，表明芽孢杆菌组合物预防孢子扩散。此外，尽管整盘都被喷雾，盘的各处还是获得了 非常好的蘑菇产量。这提示芽孢杆菌对蘑菇生长是无害的。事实上，来自测试盘2的蘑菇 比生长室中的其他盘的更密集。另外，测试盘2上的第二裂开(break)比室的剩余部分来 得更早(约1天)并且尺寸也更大。这表明由于蘑菇由培养基更好地支持，蘑菇生长更快。芽孢杆菌培养物还阻止了第二测试盘试验上的已存在的绿霉。如
图13所示，在稍 早的应用的情况下，绿霉被抑制了足够的时间以允许发生扭结。这表明芽孢杆菌的抗真菌 活性只作用于绿霉并且对商业蘑菇/真菌(双胞蘑菇)没有不利影响，从而允许菌丝体生 长以及蘑菇持续生产。为了确定所述组合物是否可以减少盘上生长的以及可能扩散到产物上的绿霉的 量，还用蛋白胨中的芽孢杆菌培养物测试了扭结室中盘上(与所观察的测试盘相同)的 多种绿霉。盘直接喷雾并连同测试盘一起观察。
图14展示了对盘上两种类型的霉菌生长 物的作用。盘通常被回收。这就允许旧的盘被能在蒸汽灭菌下存活的霉菌孢子污染。因此， 污染可以反复发生。当室内湿度相对高时，例如在扭结室中，喷雾到盘上的芽孢杆菌菌落能 够存活并且霉菌不再反复。另外，当芽孢杆菌喷雾到扭结室中可见污染的盘上时，生长室中 和因而整个农场中污染的盘会减少。为了确定蛋白胨或芽孢杆菌是否抑制初始菌丝体生长，前置盒掺入的48小时 的蛋白胨和培养物溶液。所述培养物用5ml吸液管吹散，其中体积基于样品体积重量而
8确定。所述培养物分布在样品的上层2-3cm各处，用塑料包裹并且在25°C孵育。第二样品 (如
图17所示)添加来自扭结室11的已知的绿霉生长物(收集并用培养物喷雾)。样品 容器要满足，整个纵深的样品随着时间都可以被观察到。
图16展示了初始样品制备、发现 的绿霉和最终菌丝体生长物。菌丝体和芽孢杆菌的混合物表明，菌丝体确实能存活。此外， 喷雾的区域上没有绿霉生长物。菌丝体发育并且甚至可以提示，随培养物发生更厚实的菌 丝体。第二样品显示绿霉没有支配前置盒，并且添加芽孢杆菌没有抑制菌丝体生长。为了确定芽孢杆菌是否能在水中存活，制备了水性溶液。初始测试是为确定芽孢 杆菌水中存活的有/无测试。水样品收集自位于通道的孕育培养水箱、办公室厨房，同时灭 菌蒸馏水样品作为对照。90ml水样品用Iml的M小时蛋白胨溶液接种。同时，IOml水 样品用菌环量的培养物接种。在SMA上涂板，并且对分离菌革兰氏染色。结果表明，芽孢杆 菌确实能够在无添加营养物的水性溶液中生长。因为已确定芽孢杆菌能在无任何补充物的水中存活，所以测定生长曲线。每个20L蒸馏水瓶使用一平板的48小时生长的培养物，所述瓶含有约18. 9-19L 的水。用于培养物收集的优选技术是倒出9ml灭菌蒸馏水，用涂布器收集并用1. Oml微型 吸液管转移到空的灭菌管中。然后该管直接倒入瓶中，并且该管用灭菌蒸馏水清洗以确保 转移了足够的培养物。定时摇动水瓶以确保培养物的适当分布，并且将水瓶保持在22-25°C。约每M小 时收集样品用于稀释以及涂板以测定群落(population)。将标记为第22批的第一瓶尽涂 板，以测定每天每瓶靶生长级。根据之前的天数生长和初始瓶计数，用后续瓶制备靶稀释 液。为了最适菌落复苏，所涂板需要在25°C下36-48小时；可数平板在30-300CFU/mL。如 果计数不在该范围内，那么计数视为估计值。为了比较生长速率，900ml的第22批样品与具 有蛋白胨的第21批一起在已知的25°C下存放在培养箱中。定时进行比较计数，以观察 不同营养物利用度的群落生长以及温度的影响。记录了计数，每天至少记录4个样品。每瓶单独作图，并且如
图18所示生成了平 均生长曲线。利用M小时间隔测量的有活力的培养物计数，芽孢杆菌的倍增率(doubling rate)测定为约7小时。计数用于形成线性(未显示)和对数生长曲线(
图18)，从而展示 了在不同时间点计数的细胞数的图表。鉴于细胞是从固体培养基转移到液体培养基，浓度 具有时间滞后期，从而需要至少4天从转移中复苏。因此，在群落复苏前发生了实质的培 养物死亡。在3至4天后观察到指数的生长速率，表明培养物能够适应新的培养基(蒸馏 水)。细菌继续通过二分裂过程定期分裂。通过将线性图按对数级绘制(
图18)，几乎直的 线表明生长确实是指数的。14天后观察到受限的生长，其中静止期群落指数性减少，从而导致死亡期。增代时 间在指数生长期(第5至第9天)计算；X = 2η · X。，其中X。是初始细胞数目，η是代数，X 是η代后的细胞数目。该增代时间对于使用的培养基以及孵育期的环境条件是特异的。在 温度更高时，如用来自具有log2增长的第22批的更小的可分量所证明的那样，生长速率加 快。蛋白胨样品具有log3增长；但结果是提前7天发生死亡期。进行了实验来测定添加到位于通道的孕育培养水箱的芽孢杆菌将抗真菌特性并 入培养料的效果。为了需要的浓度，初始水瓶可以在7天的孵育后使用。如
图18所示，这也是静止期的开始，从而允许发生最适群落。瓶应当优选地保持在15_32°C，其中最适温度是22_25°C。如果温度不在该范围 内，则可能发生孢子形成，从而导致休眠的培养物和活性的缺乏。水瓶在孕育培养前最少 10-12小时至最多72小时添加到孕育培养水箱。孕育培养前的早晨取出孕育培养水箱的样 品，如
图19所示，以根据第I部分进行计数。此外，每个早晨的水箱水样品和绿霉一起涂板，以确定培养物仍然有用；从而确保 抗真菌特性仍然存在(图20)。孕育培养水箱到新鲜的巴氏灭菌的培养料上的喷雾方法是 喷嘴供液管路，因此不是良好分布的。来自水箱的水在培养料各处不是一致的，从而允许在 某些部分中培养物浓度更高，以及在其他部分中浓度极低。理想情况下，水的密度分布是， 每个喷雾喷嘴之间有至少30%的重叠，以及培养料各处充分的吸收和混合以产生均质的混 合物。
图19示出添加到孕育培养水箱的芽孢杆菌确实能存活并且指数性生长。由于孕 育培养箱几乎每天清空，所以计数不是累积的。发现添加两个7天的瓶，水计数是最适浓 度，从而允许如图20所示的所需要的50%绿霉抑制水平的可能性。当将用含有初始瓶的水 的水所喷雾的培养料送到盒时，绿霉减少并且看到良好的菌丝体生长。本发明提供用于控制蘑菇上绿霉的新的组合物、工艺和方法。芽孢杆菌属提供了 控制和/或预防蘑菇的木霉属侵染的有机手段。所述组合物与如铜绿假单胞菌的其他微生 物对照相比，相对安全并且可以被制剂以用于蘑菇生产的任何阶段的容易的应用。此外，不 需要使用控制或预防木霉属扩散的任何刺激性(harsh)化学手段。本发明提供意想不到的 结果，即能够控制一类真菌(木霉属)，同时对另一种真菌(蘑菇)的生长没有不利影响。 因此，提供了对于人类安全的、相对便宜的、不需要使用化学品的并且特异性靶向病原体而 不会对产品造成不利影响的新的生物控制机理。
权利要求
1.组合物，其包含对于预防或控制木霉(Trichodermaspp.)对蘑菇的侵染有效的芽 孢杆菌(Bacillus spp·)。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述枯草芽孢杆菌菌株是J-P13分离菌。
4.如权利要求1所述的组合物，其还包含载体。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述载体选自微载体珠、颗粒、微粒、蛋白胨溶液、 油、蜡、凝胶和水。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述载体是水。
7.枯草芽孢杆菌菌株P13的生物学纯培养物。
8.控制植物中或植物产生组分中的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的工艺，所述 工艺包括应用枯草芽孢杆菌组合物。
9.如前一权利要求所述的工艺，其中所述枯草芽孢杆菌是菌株P13。
10.如权利要求8所述的工艺，其中所述植物是蘑菇。
11.如权利要求8所述的工艺，其中所述组合物通过喷雾应用。
12.如权利要求8所述的工艺，其中所述组合物是水性组合物。
13.包含枯草芽孢杆菌的抗真菌组合物，其中所述组合物配制为水性溶液。
全文摘要
本发明提供用于预防和/或减少蘑菇生产中霉菌的新的生物控制剂。特别地，本发明采用芽孢杆菌(Bacillus spp.)作为天然有机试剂用于控制木霉(Trichoderma spp.)导致的霉菌。
文档编号A01M7/00GK102112597SQ200980106566
公开日2011年6月29日 申请日期2009年2月26日 优先权日2008年2月26日
发明者杰克·维尔德尔恩, 纳德尔·戈施拉吉 申请人:莫纳汉蘑菇有限公司