专利名称：一步半双抗原夹心免疫检测法的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫检测领域，具体地说，本发明涉及一种新型的一步半双抗原夹心 检测法(下面简称一步半法)。
背景技术：
免疫检测是应用免疫学技术测定样本中待测物质的方法。在临床检验中主要通过 抗原抗体反应检测样品中的抗体或抗原性物质。根据检测原理的不同，免疫检测可以分为 间接法、夹心法(包括双抗原夹心法和双抗体夹心法)、捕获法、竞争法等。双抗原夹心法检抗体是免疫检测中检测抗体的一种常用方法。其基本原理是，利 用抗原抗体之间的特异性结合作用，通过形成“包被抗原-抗体-标记抗原”的夹心复合 体，并利用相应的结果呈现技术对检测反应体系中形成的该夹心复合体的量进行一定形式 的测定。例如，HIV、HBV表面抗原抗体、TP、HTLV等项目均可采用该方法对受检样品中的抗 体进行检测。进一步，根据抗原标记物及底物的不同，双抗原夹心法可具体应用在酶联免疫 检测(ELISA)，发光免疫检测等具体检测技术领域。以ELISA检测法为例，常用ELISA双抗原夹心法的检测步骤可简单分为两步法和
一步法。两步法的基本步骤1)将特异性抗原包被于固相载体。2)加受检样本，保温反应。 受检样本中的抗体(如果有)与包被抗原结合，形成“包被抗原-抗体”复合物。洗涤除去 其他未结合物质。3)加酶标抗原，保温反应。上述“包被抗原-抗体”免疫复合物上的抗 体与酶标抗原结合，形成“包被抗原_抗体_酶标抗原”复合物。彻底洗涤未结合的酶标抗 原。此时固相载体上带有的酶量与样本中受检抗体的量成正相关。4)加底物显色。固相上 的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知样本中是否存在待检测抗体。若将上述两步法中的步骤2)和3)合并，即同时加入酶标抗原和受检样本，一起做 保温反应，则为一步法检测。与两步法相比，一步法中受检样本和酶标抗原一并加入，省略 了两步法2)中加入了受检样本后的洗板过程，更加简便省时。但是，一步法由于为了缓解 钩状效应，需要把包被抗原和标记抗原的使用浓度都提高很多，容易造成检测结果具有较 高的假阳和本底，从而导致检测的特异性不好。
发明内容
本发明通过对传统双抗原夹心一步法和两步法的改进，创造出一种既提高检测的 灵敏度并改善特异性和本底，又能减少原有一步法技术的钩状效应，且操作简便，实用可靠 的新一代一步半双抗原夹心免疫检测法。本发明区别于以往的一步法和两步法，在加入受检样本，充分反应第一预定时间 后，不移除未结合的受检样本，直接加入标记抗原，再反应第二预定时间，然后，彻底洗涤未 结合的受检样本和标记抗原，通过标记物显示结果，完成检测。本发明一步半法的具体过程，以ELISA双抗原夹心法为例，(i)将特异性抗原包被于固相载体，如果是采用试剂盒，则不需要此步骤，而是直接在预先包被有包被抗原的固相 支持物上加入受检样本；(ii)加入受检样本，保温反应；当样本中存在受检抗体时，样本中 的受检抗体与包被抗原结合，形成“包被抗原-抗体”复合物；(iii)反应适当时间后，不需 洗涤除去该反应中其他未结合的样本，继续加酶标记抗原，保温反应，“包被抗原_抗体”复 合物上的抗体与酶标记抗原结合；(iv)反应适当时间后，彻底洗涤未结合的受检样本和酶 标抗原，加底物显色，通过测量反应体系颜色的深浅，测知样本中是否存在受检抗体，从而 完成检测过程。在传统的一步法中，受检样本和标记抗原是同时加入，即反应体系中同时存在游 离的标记抗原和受检抗体，受检抗体部分与包被抗原形成“包被抗原-抗体”复合物，部分 与标记抗原形成“标记抗原-抗体”复合物。尤其当反应体系中受检抗体的含量很高时， 受检抗体与游离的标记抗原形成的“标记抗原-抗体”复合物严重影响了 “包被抗原-抗 体-标记抗原”夹心结构的形成，从而形成钩状效应，甚至造成假阴的漏检现象。本发明中涉及的一步半双抗原夹心免疫检测法，在包被有特异性抗原的固相支持 物上先加入受检样本，充分反应适当时间。此时，该反应体系中的受检抗体(如果有)将与 固相化的包被抗原充分结合，形成“包被抗原-抗体”复合物。然后不移除反应中未与包被 抗原结合的受检样本，加入标记抗原，进一步形成“包被抗原-抗体-标记抗原”复合物，进 而完成后续检测。若受检抗体含量很高，对比传统一步法，在反应初期，由于受检样本与标 记抗原不是同时加入，样本中的受检抗体与包被抗原的初期反应未受到标记抗原的影响， 实际延长了受检抗体与包被抗原的单独反应时间，使得更多的受检抗体得以与包被抗原充 分反应，因此本发明的一步半检测法中标记抗原与“包被抗原-抗体”复合物结合而形成 “包被抗原-抗体-标记抗原”夹心复合物的概率明显提高。换而言之，由于采用了一步半 法，可以有效的减少钩状效应的不利影响。后续的实施例的实验数据中则进一步证明此效 果受检抗体含量较高的受检样本，采用一步法由于钩状效应检出假阴结果，而采用本发明 中的一步半法检出为阳性。与传统两步法相比，本发明的一步半法在特异性方面有明显提高。这主要是在受 检抗体与包被抗原反应中，传统两步法采用多种缓冲液加一定的惰性蛋白充当样稀，而在 本发明的一步半法中采用受检样本作为天然样稀。根据实验结果显示(详见实施例部分)， 将受检样本作为天然样稀能有效的消除非特异性结合。这主要是由于受检样本中存在多种 天然蛋白，而且浓度很高。非特异性结合在天然状态下具有动态不稳定性，容易受到这种 “天然样稀”的复杂蛋白成分的影响，从而使得非特异性结合的降低，天然样稀对比传统两 步法中的人工样稀对非特异性结合的影响更显著，实际降低了一步半法的本底，即采用一 步半法相较传统两步法本底更低。但同时对于特异性反应，由于抗原抗体的特异性结合力 比较牢固，所以对于阳性样品，其血清中的复杂蛋白成分对于灵敏度的干扰不大，具体可见 实施例数据。进一步，由于本发明的一步半法具有更优本底，所以在后续反应体系中可以提高 标记抗原的用量，从而大大提高检测结果的灵敏度，这使得一步半法具有比两步法更高的 灵敏度。此外，与传统两步法相比，本发明的一步半法中间节省了移除受检样品的过程，实 际延长了受检抗体与包被抗原的反应时间。综合反应时间，特异性，以及本底优势，本发明的一步半法较传统两步法具有更高的灵敏度。本发明的一步半法同样适用于发光免检检测，其原理一致。以化学发光免疫检测 法为例，将上述ELISA —步半双抗原夹心法中的标记物或者标记物和底物进行相应替换， 通过对光信号的强度进行测量，从而完成对受检样品中受检抗体含量的检测。本发明以HIV的ELISA双抗原夹心法和化学发光法为例，与传统一步法和两步法 做对照，采用国家参考品以及临床标本为实验对象，进行了相关试验，根据实施例1的实验 结果显示本方法在HIV项目上较以往的传统方法，有显著的效果改进。具体参看实施例1。为进一步推广验证一步半法，本发明在TP、HTLV、HBV项目上也进行了上述HIV的 ELISA双抗原夹心检测和化学发光检测的类似实验，根据实施例2-4的数据，采用本发明后 检测效果同样具有显著改善。因此，本发明提供一种一步半双抗原夹心免疫检测法，其包括如下步骤，(1)在预先包被有包被抗原的固相支持物上加入受检样本，在预定温度下，保温反 应第一预定时间；(2)不移除未结合的受检样本，直接加入标记有标记物的标记抗原，在预定温度 下，保温反应第二预定时间；(3)移除未结合的受检样本和标记抗原，通过标记物显示检测结果，完成检测。在一个方案中，其采用酶联免疫检测，包括如下步骤，(11)在预先包被有包被抗原的固相支持物上加入受检样本，在预定温度下，保温 反应第一预定时间，让样本中的抗体(如果有)与包被抗原结合，形成“包被抗原-抗体”复 合物；(12)不移除未结合的受检样本，直接加入酶标记抗原，在预定温度保温反应第二 预定时间，让“包被抗原_抗体”复合物上的抗体(如果有)与酶标记抗原结合；(13)移除未结合的受检样本和酶标记抗原，加底物反应第三预定时间，终止酶反 应，完成检测过程。在另一个方案中，其采用发光免疫检测，包括如下步骤，(21)在预先包被有包被抗原的固相支持物加入受检样本，在预定温度下，保温反 应第一预定时间，让样本中的抗体(如果有)与包被抗原结合，形成“包被抗原-抗体”复 合物；(22)不移除未结合的受检样本，直接加入酶标记抗原，在预定温度保温反应第二 预定时间，让“包被抗原_抗体”复合物上的抗体(如果有)与酶标记抗原结合；(23)移除未结合的受检样本和酶标记抗原，加发光底物反应第三预定时间，终止 酶反应，测定发光强度，完成检测过程。再一个方案中，其采用发光免疫检测，包括如下步骤，(31)在预先包被有包被抗原的固相支持物加入受检样本，在预定温度下，保温反 应第一预定时间，让样本中的抗体(如果有)与包被抗原结合，形成“包被抗原-抗体”复 合物；(32)不移除未结合的受检样本，直接加入发光标记抗原，在预定温度保温反应第 二预定时间，让“包被抗原-抗体”复合物上的抗体(如果有)与发光标记抗原结合；(33)移除未结合的受检样本和发光标记抗原，通过发光标记物显示检测结果，完成检测过程。在进一步具体的实施方案中，本发明可以分别应用于HIV、TP、HTLV、HBV表面抗原 抗体检测项目。关于上述检测步骤中提到的各个时间，例如第一时间、第二时间、第三时间，都不 是固定不变的，为了使检测效果达到最佳，这些在检测流程中的时间长短是可以根据实际 情况而有调整的，这并不是本发明的重点，本领域技术人员可以领会。由于本发明的实质在是免疫检测步骤方面的改进，跟其显示结果时所用的标记物 种类无关，虽然实施例以HRP作为标记物来进行一步半检测，但是本领域的技术员可以把 HRP换成其它种类的标记物，例如化学发光标记物来实施一步半检测，这并不超出本发明的 范围，因为标记物的不同只是实验人员的选择不同而已。本发明能弥补一步法检测中所固有的钩状效应，改善一步法的非特异性并降低本 底，并进一步提高两步夹心法检测灵敏度，降低本底的一步半法。该方法不仅结合了一步法 操作简便的优势，同时能够有效的缓解钩状效应的影响，取得了灵敏度显著提高的同时，特 异性和本底均明显改善的突出效果。
具体实施例方式下述各实施例中，在采用的方法中都是先制备包被，然后再进行其它步骤，实际上 如果是采用试剂盒，则不需要此制备包被的步骤，而是直接在预先包被有包被抗原的固相 支持物上加入受检样本。实施例1. 一步半法检测HIV抗体1. 1抗原包被将HIV抗原H67 (深圳市菲鹏生物股份有限公司产品)以一定比例用碳酸盐缓冲 液(50mM，pH9. 51)稀释，IOOul/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司辐照酶标板)， 4°C包被 18-24 小时；次日用 PBSTdOmM PB, 150mM NaCl,0. 05% Tween-20, ρΗ7· 4)洗涤液 洗板二次，拍干；20ul/孔加入封闭液(英科新创(厦门)科技有限公司)，37°C封闭2小时 或者4°C封闭过夜；甩掉孔内液体，拍干，置室温20-25°C、湿度55% -65%、有通风设备的房 间内风干；封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。1. 2检测步骤为了显示一步半法检测的优势，本发明在相同条件下分别做了一步半法，以及一 步法、两步法的检测，具体步骤如下一步半法在包被酶标板中加入50ul待测样本，37°C温育30分钟，不洗板，再加入50ul酶稀 释液(含有20%新生牛血清，以一定比例稀释的H15-HRP、H65-HRP标记缀合物的pH7. 4的 20mM PB缓冲液)，37°C温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干；每孔加入显色剂A、 B(英科新创(厦门)科技有限公司)各50ul，37°C显色15分钟。每孔加50ul终止液(英 科新创(厦门)科技有限公司)终止反应，酶标仪450nm波长(参考波长630nm)空白孔校 零后读取OD值。一步法在包被酶标板中加入50ul待测样本，以及50ul酶稀释液(含有20%新生牛血清，以一定比例稀释的H15-HRP、H65-HRP标记缀合物(深圳市菲鹏生物股份有限公司产品)的 PH7. 4的20mM PB缓冲液)，37°C温育60分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干；跟一步半法 一样加入底物显色，37°C显色15分钟。两步法在包被酶标板中加入50ul样本稀释液以及50ul待测样本，37°C温育30分钟；用 PBST洗涤液洗板五次，拍干；再加入IOOul酶稀释液(含有20%新生牛血清，以一定比例 稀释的H15-HRP、H65-HRP标记缀合物的pH7. 4的20mM PB缓冲液)，37°C温育30分钟；用 PBST洗涤液洗板五次，拍干；跟一步半法一样加入底物显色，37°C显色15分钟。为了在统一条件下将一步半法与一步法和两步法进行比较，本发明中涉及到一步 半法的时间(第一预定时间30分钟，第二预定时间30分钟)均与两步法时间(两步分别 反应30分钟)一致，且反应总时间与一步法(反应1个小时)保持一致，以突出说明一步 半法的优势。在实际情况中，为了使检测效果达到最佳，这些在检测流程中的时间长短是可 以根据实际情况而有调整的，这并不是本发明的重点，本领域技术人员可以领会。1.3检测结果将上述三种方法的包被抗原稀释比例以及抗原-HRP标记缀合物的稀释比例分别 调试到各自的最佳条件(本领域的技术人员应该能够领会，在此不赘述)来比较检测效果。由于HIV抗体ELISA检测的现有技术是两步法(一步法存在钩状效应导致的漏检 风险，所以基本上HIV项目很少使用)，我们首先用一步半法和两步法同时检测了 HIV抗体 国家参考品(批号20061201，购自中国药品生物制品检定所)，包括20份阳性Pl P20(其 中2份HIV-2型阳性)、20份阴性附 N20及6份最低检出限样品Sl S6，同时对照检测 了 10份本实验室的临床阳性血清Il 110，10份本实验室的临床假阳血清Jl J10，这 10份血清以前用HIV确认试剂盒检测皆为阴性。最终检测结果如表1所示。表1 一步半法以及两步法检测HIV抗体国家参考品的结果
权利要求
一步半双抗原夹心免疫检测法，其特征在于，包括如下步骤，(1)在预先包被有包被抗原的固相支持物上加入受检样本，在预定温度下，保温反应第一预定时间；(2)不移除未结合的受检样本，直接加入标记有标记物的标记抗原，在预定温度下，保温反应第二预定时间；(3)移除未结合的受检样本和标记抗原，通过标记物显示检测结果，完成检测。
2.根据权利要求1所述的一步半双抗原夹心免疫检测法，其特征在于，本发明的一步 半双抗原夹心免疫检测法作为酶联免疫检测时，包括如下步骤，(11)在预先包被有包被抗原的固相支持物上加入受检样本，在预定温度下，保温反应 第一预定时间，样本中的抗体(如果有)与包被抗原结合，形成“包被抗原_抗体”复合物；(12)不移除未结合的受检样本，直接加入酶标记抗原，在预定温度保温反应第二预定 时间，“包被抗原_抗体”复合物上的抗体(如果有)与酶标记抗原结合；(13)移除未结合的受检样本和酶标记抗原，加底物反应第三预定时间后终止酶反应， 完成检测过程。
3.根据权利要求1所述的一步半双抗原夹心免疫检测法，其特征在于，本发明的一步 半双抗原夹心免疫检测法作为发光免疫检测时，包括如下步骤，(21)在预先包被有包被抗原的固相支持物上加入受检样本，在预定温度下，保温反应 第一预定时间，样本中的抗体(如果有)与包被抗原结合，形成“包被抗原_抗体”复合物；(23)不移除未结合的受检样本，直接加入酶标记抗原，在预定温度保温反应第二预定 时间，“包被抗原_抗体”复合物上的抗体(如果有)与酶标记抗原结合；(24)移除未结合的受检样本和酶标记抗原，加发光底物反应第三预定时间后终止酶反 应，测定发光强度，完成检测过程。
4.根据权利要求1所述的一步半双抗原夹心免疫检测法，其特征在于，本发明的一步 半双抗原夹心免疫检测法作为发光免疫检测时，包括如下步骤，(31)在预先包被有包被抗原的固相支持物上加入受检样本，在预定温度下，保温反应 第一预定时间，样本中的抗体(如果有)与包被抗原结合，形成“包被抗原_抗体”复合物；(32)不移除未结合的受检样本，直接加入发光标记抗原，在预定温度保温反应第二预 定时间，“包被抗原_抗体”复合物上的抗体(如果有)与发光标记抗原结合；(33)移除未结合的受检样本和发光标记抗原，通过发光标记物显示检测结果，完成检 测过程。
5.本发明一步半双抗原夹心免疫检测法在对HIV抗体检测、TP抗体检测、HTLV抗体检 测或HBV表面抗原抗体检测方面的应用。
全文摘要
一步半双抗原夹心免疫检测法，包括如下步骤，在包被有包被抗原的固相支持物上加入受检样本；在预定温度下保温，充分反应第一预定时间后，不移除受检样本，直接加入标记抗原；再反应第二预定时间，然后，彻底洗涤未结合的样本和标记抗原，加底物反应第三预定时间，检测显示结果，完成检测。本发明相较传统一步法，本发明中标记抗原与“包被抗原-抗体”复合物结合而形成“包被抗原-抗体-标记抗原”夹心复合物的概率明显提高，可以有效的减少钩状效应的不利影响。与传统两步法相比，本发明在特异性方面有明显提高。这主要是在受检抗体与固相抗原反应中，传统两步法采用多种缓冲液加一定的惰性蛋白充当样稀，而在本发明中受检样本作为天然样稀，天然样稀能有效的消除非特异性结合。
文档编号G01N21/75GK101968483SQ20091015921
公开日2011年2月9日 申请日期2009年7月27日 优先权日2009年7月27日
发明者何志强, 孙兴宝, 孙婧, 崔鹏, 王红, 王蓉娥, 胡鹏, 范凌云, 郑焕巍, 颜文豪 申请人:深圳市菲鹏生物股份有限公司