专利名称：：双抗原夹心法乙型肝炎病毒e抗体体外诊断试剂盒及制备方法
技术领域：
：本发明涉及免疫医学分析领域，具体地，本发明涉及乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒及制备方法。
背景技术：
：乙型肝炎病毒(H印atitisBVirus)属嗜肝性病毒家族，可引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化，而且和肝癌的发生密切相关。它是目前世界上传染最为广泛的致命病毒之一。据统计，全世界有超过35亿的人群是乙肝携带者或发病者[Zucherman丄N.，etal.，/i)2/"e"，2000，41(2):130136]。中国是乙型肝炎的高发区和流行区，约有1.2亿乙肝患者[张建营主编，病毒性肝病研究进展，第一版，中国科学技术出版社，1992]。而且，每年在全球范围内约有100万人因感染HBV而死亡[ParkinD.M.，etal.，Ca/7cer5^zv，1999，33:533]。目前尚无治愈乙型肝炎病毒慢性感染的有效方法，因此疫苗接种和早期诊断是预防的重要手段，对病毒的感染的动态检测也能为乙肝发展、治疗和预后提供重要的信息。由乙肝病毒所表达的蛋白主要有乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)等三种抗原[张建营主编，疯泰丝i^薪薪^^遂展，第一版，中国科学技术出版社，1992]。为抵抗乙肝病毒，人体免疫系统会相应产生针对这三种抗原的抗体，它们分别是乙肝表面抗体、乙肝核心抗体和乙肝E抗体，并分泌到体液中(血液是主要的抗体存在场所)。由于乙肝病毒的核心抗原无法分泌到血液中，所以在传统的乙肝病毒感染筛査免疫学检测时，只检测乙肝病毒表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝病毒E抗原，乙肝E抗体和乙肝核心抗体等共五项，业内称为"乙肝两对半"。乙肝病毒的基因组是一个小巧而高效的系统，仅有3.2kb，仅拥有4个主要的开放阅读框架，但是却承担着近十种蛋白的表达任务[GalibertF.,MandratE.，etal.，淑wre，1979，281:646650:MandratE.，KayA.，Kz>o7.，1984，49:782792]。其基因组一般分为前S区、S区、CORE区(/7re-c/c)和相应的启动子等部分，其中CORE区负责表达两种蛋白乙肝病毒核心蛋白和乙肝病毒E蛋白。也就是说，HBeAg和HBcAg共用基因组的同一区段。越来越多的研究证明，HBeAg是HBcAg经蛋白酶分解后的产物。HBcAg的分子量为21000道尔顿，HBeAg的分子量为14000道尔顿。乙肝病毒E抗体(anti-HBe)是特异性抗乙肝病毒E抗原(HBeAg)的抗体。一般认为，anti-HBe的出现是患者体内HBV复制减弱或停止的表征，预示着患者较好的自愈或治疗效果[志芳俊夫，游^^^X学，1978，8(1);王鹰，度学^验遂參染,吉，1997，4(11):167;唐清斌，翁—銜度学腐学叛，1996，24(4):314315;任建林等，源*安度辟丈学学叛，1999，20(2):226228:武淑环，王立兴，ZL^^^举iT凝^^刀。因此anti-HBe的检测是"乙肝两对半"检测中的重要一项，是临床医生判断患者治疗效果的重要依据。"乙肝病毒E抗体"的检测方法有很多种，从最初的琼脂糖凝胶免疫双扩散法(AGD)、对流免疫电泳(CIEP)、补体结合试验(CF)、被动血凝试验(PHA)、反向被动血凝试验(RPHA)、免疫黏附血球凝集试验(IAHA)等敏感度较低的方法[刘锡光，胡宗汉等主编，錄泰丝^^实验參箭，第一版，人民卫生出版社，1986],到后来的基于免疫吸附原理(IA)的放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、金标试纸测定(GIA)、化学发光免疫测定(CLIA)和时间分辨荧光免疫吸附测定(TRFIA)等高敏感度的方法。目前临床常规测定方法都是基于IA的方法，由于RIA方法的使用较复杂和有放射性风险的原因，基本上已经被淘汰。ELISA方法因使用方便和价格便宜，是使用最多的方法；金标试纸法由于其使用便利和快速，其市场使用量越来越大；化学发光免疫测定法和时间分辨荧光免疫测定法因其敏感度更高和易于自动化使用，也受到了临床欢迎。根据免疫吸附(IA)方法的原理，因测试项目和所用原材料质量的关系又分为夹心法、间接法、竞争法(包括中和竞争法)和捕获法等多种测定方法。所有的这些测定方法中，模式最好的为夹心法。而竞争法是最差的模式。[沈彩霞，度^^庙i^学，第一版，上海同济大学出版社，1987:177;杨利国等编著，^^ig#/^i^^，第一版，南京大学出版社，1998]中和竞争法的优点是对中和用HBeAg的纯度要求不高，当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。但其主要缺点也很明显灵敏度低，特异性差，批间差异大和结果不方便判读，以及结果不准确等。这些缺点导致临床使用上的诸多问题。比如由于灵敏度低，当患者体内已经产生了乙肝E抗体，中和竞争法试剂盒却测不出来，这就不能给医生在判断治疗效果和制定后续治疗方案时提供正确及时的信息；由于特异性差，经常会有假阳性的结果，从而造成检测阳性率高于实际阳性率[程炳立，抗-HBe检测方法的问题探讨，302医院免疫室];由于该方法的结果判读所用的CUTOFF值可以由技术人员随意调整，导致产品的批件差异大，而且，不同厂家产品所测结果也不一致。同样，中和竞争法也受测定操作习惯的影响，当样本加入和标记抗体加入的时间差不平等竞争，导致同一样本在不同次测定中的结果不一致[徐卫平，陈晓爱:李鑫，^^^^"^^与/廢^t，2007，4(10):960:];由于结果不方便判读，结果不准确，致使检验人员无法直观正确地判断一份样本是阴性还是阳性，而必须寻求其它检测指标来辅助判断。所有以上缺点，让这种检测试剂盒丧失了检测的基本功能。双抗原夹心法测乙肝E抗体却可以克服这些问题。一是夹心法的灵敏度高，可以比竞争法提前检测出血液中出现的抗体；二是样本中的抗体与标记抗原不竞争包被抗原，从而不会出现因加样时差不同而导致的结果不一致；三是结果判读的CUTOFF值无法因人为原因而随意改变，保证了不同批次产品或不同厂家产品对同一样本检测结果的可比性。四是阴阳性的显色差别明显，几乎可以依靠目测来判读阴阳性结果。目前，临床上乙肝E抗体的测定采用的是中和竞争法。从分析原理上来说，乙肝E抗体的检测同样也可以使用双抗原夹心法。但是，自从乙肝E抗体检测试剂盒诞生到如今，却一直采用中和竞争法这种模式很差的方法，这和所用的一种最重要的原料乙肝病毒E抗原的品质有关[黄作美、黄光华和陈江萍，J:;^,学，1997，20(2):100102;赵祥胜和刘瑜等，^举^度学^V吉，2000，24(2):110111:梁宝铎，曾真，赵祥胜，^举度学澄邀森吉，1985，18(4):232;]。在20世纪七、八十年代，"乙肝两对半"试剂盒被研发成功，并应用于临床检验使用。当时，用于这些试剂盒生产的抗原类原料都是从乙肝患者的血液或肝脏中提出，来源稀少，而且质量不稳定。随着临床上对"乙肝两对半"试剂盒的需求量大幅增加，这些抗原类原料的来源问题成为限制试剂盒产量和成本的关键。随着生物工程技术的发展，基因工程重组技术被应用到这些抗原的生产上来，并成功构建了重组的HBeAg和HBcAg[朱秋萍，谷淑燕，C力i/ese/.fx/.C7i/z.K>o7.，1998，12(3):276278;景新，朱既明，疯毒学叛，1989,5(3):201210;EdmanJ.C.，etal.#a^/re，1981，291:503506;马贤凯等，J:潜^资学i^吉，1984，4(2):129130]。但是，研究人员发现，重组的HBeAg的质量远不如HBcAg的质量，并找到了原因。因为HBeAg和HBcAg的同源性，而且HBeAg是HBcAg的一部分，使用大肠杆菌表达的HBeAg，因为缺少人体内病毒可以表达的有关蛋白酶，无法对HBcAg进行准确的分解和三维结构的折叠，这就造成了HBeAg中总是存在着朋cAg的活性成分，而且，HBeAg也不稳定。[DavidR.Milich，etal，//卿膽7.，1988，141(10):36173624;FlorianSchodel，etal，/.C力e迈.1993，268(2):13321337;PaulT.Wingfield，倫c力e瓜，1995，34:49194932;]基于这些原因，研究人员发现，HBeAg难以实现常规方法的标记，也难以排除制备的抗原包被中的HBcAg的活性。所以，就无法使用双抗原夹心法技术来制备乙肝E抗体诊断试剂盒，从而不得不退而求其次采用了中和竞争法。大分子蛋白和酶的偶联，随着技术的进步和根据所用蛋白和酶的特点，发展了很多方法，如:戊二醛法、过碘酸钠法、对苯醌法、邻苯二马来酰亚胺法等等的化学偶联方法和免疫学偶联方法[MolinS.0.eta1.，/历stoc力e瓜Cc力e瓜，1978，26(12):10531059:NagrenH.，/倫toc力e迈.0^oc力e瓜1974,22(1):10841093;Term認kT.andAvrameasS.，/細u/3oc力e瓜，1977，14:767773;MasonD.Y.，etal.Zazfl7W/7ocj^oc力e迈.5n'Wo丄，^h^M尸5^，1983，113118]。蛋白质的物理化学性质表明当两种蛋白分子发生偶联后，蛋白分子的空间构象、分子间的范德华力和静电力都会对偶联后的两个分子产生影响。多年的实践认为，对含有糖基的酶和大分子偶联时，过碘酸法是效果较好和工艺较简单的方法，并被广泛采用[P.TijssenandE.Kurstak，J/a丄历'oc力e瓜，1984，136:451457;AntoineCuvelieretal.，//厕加丄;1996，17(4):371382]。但是，过碘酸钠法的缺点也是明显的，它需要酶和偶联蛋白的氨基结合，而且是随机地与蛋白上的任何氨基偶联。即使是酶分子自身上的氨基也会偶联。对于HBeAg来说，分子量较小，而且抗原决定簇还有两个，所以其分子的空间结构对HBeAg的活性表现影响巨大。采用过碘酸钠法将HBeAg和酶偶联时，其造成酶与HBeAg的决定簇范围内的氨基与酶结合的几率更大。当酶分子与HBeAg结合后，一方面，酶与HBeAg抗原决定簇上的氨基结合时，会导致该抗原决定簇的失活；另一方面，如果HBeAg和一个以上的酶分子偶联，由于酶的分子量是43000道尔顿，比HBeAg大得多，从而产生空间位阻，导致HBeAg的大部分失活。因此，如果采用不恰当的偶联方式使HBeAg和酶偶联，就会造成HBeAg的失活，表观上反映似乎是HBeAg无法与酶偶联。另外，由于现今所制备的重组HBeAg中混有HBcAg的活性，当酶分子与HBeAg偶联以后，HBcAg的活性依然存在，它仍然会和吸附到固相上的乙肝核心抗体产生免疫反应，从而导致对乙肝核心抗体阳性的样本产生交叉反应。
发明内容本发明解决了HBeAg的标记和HBcAg活性对试剂盒的影响难题，从而制备出基于双抗原夹心法原理的乙肝E抗体体外诊断试剂盒。我们经过査阅很多文献发现发现HBeAg分子上具有2个游离的半胱氨酸残基(Cys)，其中一个在三维结构中被隐藏，只有一个Cys裸露在外[MichaelNassalandAndreaRieger，/.Kz>o/.，1993，67(7)43074315;Birnbaum，F.，etal.，/.f7ro丄，1990，64:33193330;Gallina，A.，etal.:/^Vo丄，1989，63:46454652;MarkA.Baumeister;etal.，#edKz>o7.，2000，60:256263]。根据马来酰亚胺法的原理[KatoK.，etal.，/"ioc力e瓜，1975，78(1):423429;YoshitakeS.，etal.，,A.oc力e迈.，1981，29(12):13871392;KitagawaT.andAikawaT.，/A'oc力e迈.，1976，79(1):233239;ShechterT.，etal.，尸roc^af丄爿cad6"c丄，1978，75:21352140;]，我们开发出MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimideeater的縮写)法，实现一个HBeAg和一个酶的偶联，同时也尽可能地减弱空间位阻效应。而且，我们在实现了HBeAg与酶分子的偶联后，采用亲和纯化方法除去其中有HBcAg活性的偶联分子，以尽可能地消除将来对乙肝核心抗体的交叉反应，从而提高试剂盒的特异性。所以，本发明将蛋白质偶联技术和IA法有效结合，提供了一种灵敏度高、特异性好、结果判读准确、生产和使用方便的双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒。该试剂盒适宜替代现有的中和竞争法的试剂盒，在临床上具有广泛用途。本发明提供的基于双抗原夹心法的乙肝E抗体体外诊断试剂盒包括1)已包被于固相载体的重组HBeAg;2)已进行酶标记的重组HBeAg;3)底物液，例如应用于ELISA的显色底物液，或应用于CLIA的酶促化学发光底物液。所述试剂盒可以应用于酶联免疫吸附法(ELISA)和酶促化学发光法(CLIA)等基于酶免疫吸附的方法。在根据本发明的试剂盒中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。其中用于ELISA的微孔板为透明的，用于CLIA的微孔板为不透明的。在根据本发明的试剂盒中，所述的酶为辣根过氧化酶或碱性磷酸酶。在根据本发明的试剂盒中，应用于ELISA的显色底物液包含显色液A:柠檬酸0.86g，柠檬酸三钠L735g溶于去离子水中，定容至100ml，加入1120250叱混匀；显色液B:①柠檬酸0.8256g、柠檬酸三钠1.6656g和蔗糖6g溶于去离子水中，定容至96ml，②四甲基联苯胺(TMB)0.026g溶于4mlDMSO，将①和②混匀。在上述试剂盒中，优选地，所述TMB是3，3，5，5-四甲基联苯胺、3，3，5,5-四甲基联苯胺硫酸盐、或3,3，5，5_四甲基联苯胺盐酸盐。在根据本发明的试剂盒中，应用于CLIA的酶促化学发光底物液包含反应液A:12.lgTris，2.95ml浓盐酸，5g鲁米诺，lg苯丙荧蒽，0.5mlTween20，定容到1000ml。反应液B:7.3g柠檬酸三钠，4.4g柠檬酸，1.2ml30%的双氧水，定容到1000ml。另外，本发明提供了制备本发明试剂盒的方法，其包括1)将重组HBeAg包被于固相载体；2)将重组HBeAg进行酶标记；3)底物液的配制；4)组装为成品试剂盒。根据本发明，优选地，所述的步骤l)将重组HBeAg包被于固相载体包括以下步骤a)包被采用pH9.650mM的碳酸盐缓冲液(1.6g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠溶于1000ml蒸馏水中)稀释C-HBeAg至适当浓度，包被于固相载体上；b)封闭对于一些固相载体可以先用生理盐水洗涤。配制封闭液，使用0.2gNaH2P042H20、2.9gNa2HP0412H20、20g水解酪蛋白和0.5mlTween-20，溶于1000ml蒸馏水中。所述封闭液的pH值为7.2左右。然后将该封闭液负载于固相载体上；在上述方法中，优选地，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。根据本发明，优选地，所述的步骤2)将重组HBeAg进行酶标记采用MBS法，包括以下步骤a)将8mg辣根过氧化物酶(服P)溶于0.1M的PB(pH7.0)lml中；b)用0.l迈l二甲基酰胺溶解8迈gMBS，加入到服P溶液中，室温反应1小时；c)离心去除沉淀后，用G25凝胶柱层析去除过量的MBS，缓冲液为pH5.00.05M醋酸盐缓冲液；d)将已处理的酶液浓縮；e)把10mgHBeAg单体加入到酶液中，室温反应1小时；f)将反应液过凝胶层析柱，将偶联物和未偶联物分离，收集偶联物；g)将偶联液过已偶联单克隆anti-HBc抗体s印harose-4B亲和柱，收集穿过峰。h)将穿过峰浓縮，浓縮到适当体积后加入等量甘油，冷冻保存。在上述方法中，优选地，所述的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。根据本发明，优选地，所述的步骤3)是配制应用于ELISA的显色底物液，包括以下步骤a)显色液A(100ml，PH4.7)的配制柠檬酸0.86g和拧檬酸三钠1.735g溶于去离子水中，定容至100ml，加入1120250ML混匀；b)显色液B(100ml，PH4.7)的配制①柠檬酸0.8256g、柠檬酸三钠1.6656g和蔗糖6g溶于去离子水中，定容至96ml，②TMB0.026g溶于4mlDMSO，将①和②混匀；优选地，所述TMB为3，3，5，5-四甲基联苯胺、3，3，5，5-四甲基联苯胺硫酸盐、或3，3，5，5-四甲基联苯胺盐酸盐。更优选地为3，3，5，5-四甲基联苯胺。根据本发明，优选地，所述的步骤3)是配制应用于CLIA的酶促化学发光底物液，包括以下步骤a)反应液A的配制12.lgTris，2.95ml浓盐酸，5g鲁米诺，lg苯丙荧蒽，0.5mlTween20，定容到1000ml。b)反应液B的配制7.3g柠檬酸三钠，4.4g柠檬酸，1.2ml309&的双氧水，定容到1000ml。具体地，上述试剂盒可以包括已包被HBeAg的微孔板、酶标记HBeAg、显色液底物液或酶促化学发光液、终止液、洗液。已包被HBeAg的微孔板为24、48或者96孔的微孔板条；标记HBeAg的酶为辣根过氧化物酶，标记方法为MBS法；显色液B的底物为TMB，或酶促化学发光液A的发光剂为鲁米诺及其衍生物和苯并荧蒽；洗液为Tris-HCl。在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括包被用HBeAg的纯度和活性、标记用HBeAg的纯度和活性、固相载体(如无色透明的微孔板)的吸附能力和变异系数、辣根过氧化物酶的RZ值和酶活性等等。然后对HBeAg的包被方法进行了研究，用不同HBeAg的浓度、不同的包被缓冲液、不同的包被时间和温度、不同的封闭进行了实验。选择出最适合的包被缓冲液、封闭液、包被温度和时间，以及最合适的HBeAg的蛋白浓度。对于HBeAg单体和HRP偶联方法，试用了多种偶联方法，最终确定了MBS法；对该方法又经过反复探索和对比实验最终确定了产率高、成本低、去除了HBcAg活性的干扰和质量可靠的标记方案；同时针对这种酶标记HBeAg，还摸索了最合适的酶标记稀释液的配方，对此酶标记物和稀释液进行了长期的考察试验，配制出了能使酶标记HBeAg长期保持活性和热稳定性的稀释液。最后，通过多次的棋盘方阵滴定实验确定了酶标记HBeAg和固相化的HBeAg的最适比例。利用本发明的试剂盒进行测试，灵敏度高、特异性好、结果准确，临床适用性强，可以准确地反映出乙肝患者体内E抗体的量。根据该试剂盒测定出的E抗体的有无或数量多少，可以准确反映被测定的患者目前乙型肝炎病毒在体内的活动情况、所采用的治疗方案是否起到了抑制病毒的作用、以及处在恢复期的患者的预后情况。并且，本发明的检测系统是酶联免疫吸附法，在国内大多数医院都具有这个测定技术和平台。而且本方法的使用比较粗放，对环境的要求低，在一般的检验实验室都可以开展。更为重要的是，中和竞争法的乙肝E抗体诊断试剂已经在国内使用了20多年，所有已经开展过该项目的应用单位都可以直接使用该试剂，无需增加任何新的条件。具体实施例方式下面描述本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实现本发明的最佳方式。应当理解，这些实施方案仅仅是示例性的，不应当用于限制本发明的范围。实施例1制备本发明的双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒(ELISA法)一、微孔板的制备(1)包被0.05MPH为9.6的碳酸盐缓冲液为包被稀释液，与HBeAg混合均匀后负载于微孔板上。具体地，所述包被方法包括Na2C031.6gNa跳2.9g蒸馏水1000ml缓冲液完全溶解混匀后，加入2mg的HBeAg混匀，然后向微孔板的每个孔加入HBeAg的稀释液O.lml。37。C放置12小时。(2)洗板使用生理盐水为洗涤液。将微孔板内的HBeAg稀释液甩掉后，用生理盐水洗涤2次。最后排干微孔板。(3)封闭0.01MpH为7.2的磷酸盐缓冲液(PB),含有水解酪蛋白和表面活性剂的溶液，负载到微孔板上。具体地，所述封闭方法包括NaH2P042H200.2gNa2HP0412H202.9g水解酪蛋白20gTween-200.5ml蒸馏水1000ml将它们混合至完全溶解后，向微孔板上的每个孔加入0.llml,于37'C放置2小时，之后，把孔内的溶液甩掉，排干、晾干。(4)包装将晾干的微孔板装入锡箔袋内，加入一个防潮剂后，用真空包装机封装。贴签后放入4一8'C存放。二、酶标记抗原的制备(1)HBeAg的酶标记HBeAg的标记采用MBS方法。该方法使用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)。具体地，所述方法包括a)将8mg服P溶于0.1M的PB(pH7.0)lml中；b)用0.lml二甲基酰胺溶解8mgMBS，加入到HRP溶液中，室温反应1小时；c)离心去除沉淀后，用G25凝胶柱层析去除过量的MBS,缓冲液为pH5.00.05M醋酸盐缓冲液；d)将已处理的酶液浓縮；e)把10mgHBeAg单体加入到酶液中，室温反应1小时；f)将反应液过凝胶层析柱，将偶联物和未偶联物分离，收集偶联物；g)将偶联液过己偶联单克隆乙肝E抗体s印harose-4B亲和柱，收集穿过峰。h)将穿过峰浓縮，浓縮到适当体积后加入等量甘油，冷冻保存。(2)酶稀释液的配制0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液，含有小牛血清、防腐剂和表面活性剂的溶液。具体地，所述配制方法包括NaH2P042H200.2gNa2HP0412H202.9g小牛血清200mlTween-200.5mlProclin3000.lml蒸馏水800ml将它们混合至完全溶解。(3)酶标记HBeAg的稀释取2ml酶标记HBeAg，加入到50ml的酶稀释液，震荡混匀。然后再把其加入到950ml的酶稀释液中，回旋摇晃试剂瓶20分钟以上。测定混匀后，取样品测定，合格后，贴签后放入4一8'C存放。(4)分装按照每个包装瓶6ml的标准,精确地把已稀释好的酶标记HBeAg分装。贴签后放入4一8t:存放。三、显色液的配制本方法采用TMB为底物。显色液分为A液和B液配制，分别存放，在使用时等比例混合。具体方法包括1)显色液A(100ml，7)的配制拧檬酸0.86g柠檬酸三钠1.735gH20250ML蒸馏水100ml将它们混合至完全溶解。2)显色液B(100ml，TO4.7)的配制柠檬酸0.8256g柠檬酸三钠1.6656g庶糖6g蒸馏水96mlTMB0.026gDMSO4ml。将它们混合至完全溶解。3)取显色液A和B样品进行测定，符合质量要求后分装。按照每个包装瓶6ml的标准分装。分装完成后，贴签，放到避光处4一8t:存放。四、终止液的配制终止液为2M硫酸。具体地方法包括浓硫酸200ml蒸馏水800ml溶液混合均匀后，分装。按照每个包装瓶6ml的标准分装。分装完成后，贴签于室温存放。五、洗涤液的配制Tris24gNaCl160gKC14gHC115ml蒸馏水1000ml溶液混合均匀后，测定pH值，应该为7.4。合格后分装。按照每个包装瓶20ml的标准分装。分装完成后，贴签于室温存放。六、半成品及成品的组装上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过精密性、特异性、灵敏度以及稳定性检测合格才能组装成试剂盒。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。实施例24制备本发明的双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒(ELISA法)除分别以塑料珠、塑料管或磁性颗粒为载体外，其余均以与实施例1相同的方法制备双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒。实施例5制备本发明的双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒(ELISA法)除以碱性磷酸酶为HBeAg的标记酶外，其余均以与实施例1相同的方法制备双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒。实施例6制备本发明的双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒(CLIA法)除以化学发光反应液代替ELISA发中的显色底物液且没有终止液外，其余均以与实施例1相同的方法制备双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒化学发光反应液的配制方法本反应液以鲁米诺和苯并荧蒽为发光物，分为A和B液分别配制，分开存放，使用前以l:l的比例混合均匀后使用。具体方法包括1)反应液A(100mlpH8.5)的配制Tris1.21g浓盐酸0.295ml鲁米诺0.5g苯并荧蒽0.lgTween200.5ml去离子水100ml2)反应液B(100mlpH4.6)的配制柠檬酸三钠0.73g柠檬酸0.44g30%双氧水0.12ml去离子水100ml3)取显色液A和B样品进行测定，符合质量要求后分装。按照每个包装瓶6ml的标准分装。分装完成后，贴签，放到避光处4一8'C存放。实施例7本发明试剂盒的使用方法1本实施例使用实施例1制备的双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒(ELISA法)。1)加样预包反应板(条)，每板设阴、阳性对照各2孔，每孔加50ixl。设空白对照l孔(不加任何试剂)，其余各孔加待检血清50ul。每孔再加酶结合物50ul(或l滴)，充分摇匀后置37。C保温30分钟；2)洗板甩去各孔液体，用洗液加满各孔，静置10秒钟后甩干，如此再洗三次，最后拍干；3)显色每孔(包括空白孔)加入显色液A50ii1(或1滴)、再加入显色液B50ul(或l滴)，充分摇匀后，置37。C显色15分钟；4)终止每孔加终止液50p1(或1滴)终止反应。5)结果判定用波长450咖校准空白孔00=0，然后测定各孔OD值，并按下列公式计算结果一被检血清0D值SN=阴性对照平均OD值S/N》2.l为阳性S/N〈2.l为阴性阴性对照0D值〈0.07时，按0.07计算，〉0.07时按实际OD值计算。实施例8本发明试剂盒的使用方法2本实施例使用实施例6制备的双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒(CLIA法)。1)加样预包反应板(条)，每板设阴、阳性对照各2孔，每孔加50u1。其余各孔加待检血清50ul。每孔再加酶结合物50ul(或l滴)，充分摇匀后置37'C保温30分钟；2)洗板甩去各孔液体，用洗液加满各孔，静置10秒钟后甩干，如此再洗三次，最后拍干；3)混合发光反应液将反应液A和B，以l:l的比例混合均匀；4)发光反应每孔加混合发光反应液100n1(或2滴)，置室温避光反应5分钟。5)测量在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时长:1秒/孔。6)结果判定用波长450nm校准空白孔OD^，然后测定各孔OD值，并按下列公式计算结果=被检血清OD值SN_阴性对照平均OD值S/N>1.0为阳性S/N〈l.0为阴性实施例9本发明的试剂盒的方法学质量鉴定按照乙肝E抗体体外诊断试剂盒的国家质量标准，采用国家标准血清盘为标准，检测在实施例1和6中制备的试剂盒。结果见下表l。表l:国家标准血清盘的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>以上结果表明"双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒"的灵敏度、特异性、精密性和稳定性均完全符合国家标准要求。实施例10使用本发明的试剂盒与市场上的中和竞争法试剂盒对比检测临床上的血清样本。使用本发明的试剂盒(ELISA法)和ABBOTT的Murex的中和竞争法试剂盒同时检测76份临床随机标本，两种试剂盒的比较结果见下表2。对于本试剂盒和ABBOTT试剂盒不符的6份血清，通过査阅来源患者的病历档案，发现他们均是处在治疗不同时期的乙肝患者，他们的乙肝病毒E抗原数量均出现了下降。这和临床的治疗效果是相符的这六位患者的治疗都出现了好转的迹象，即乙肝E抗体出现，表明开始"转阴"。这说明本发明的试剂盒可以比中和竞争法的试剂盒提前检测出患者体内的乙肝E抗体。表2:本试剂盒与ABBOTT的Murex的试剂盒对比结果ABBOTT试剂盒+—合计本试剂盒+30636的结果04040合计304676综上所述，本发明的"双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒(ELISA法)"与现用的中和竞争法的试剂盒相比，灵敏度更高，特异性更好，可以更早地检测出E抗体。权利要求1.一种基于双抗原夹心法原理的乙肝E抗体体外诊断试剂盒，其包括1)已包被于固相载体的重组HBeAg；2)已进行酶标记的重组HBeAg；3)底物液。2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。3.根据权利要求1的试剂盒，其中所述酶为辣根过氧化酶或碱性磷酸酶。4.根据权利要求1的试剂盒，其中所述底物液是应用于ELISA的显色底物液，包含显色液A:柠檬酸0.86g，柠檬酸三钠1.735g溶于去离子水中，定容至100ml，加入1120250叱混匀；显色液B:①柠檬酸0.8256g、柠檬酸三钠1.6656g和蔗糖6g溶于去离子水中，定容至96ml，②TMB0.026g溶于4mlDMSO，将①和②混匀。5.根据权利要求4的试剂盒，其中所述TMB是3，3，5,5-四甲基联苯胺、3，3，5，5-四甲基联苯胺硫酸盐、或3，3，5,5-四甲基联苯胺盐酸盐。6.根据权利要求1的试剂盒，其中所述底物液是应用于CLIA的酶促化学发光底物液，包含反应液A:12.lgTris,2.95ml浓盐酸，5g鲁米诺，lg苯丙荧蒽，0.5mlTween20，定容到1000ml。反应液B:7.3g柠檬酸三钠，4.4g柠檬酸，L2ml30%的双氧水，定容到1000ml。7.—种制备乙肝E抗体体外诊断试剂盒的方法，其包括1)将HBeAg包被于固相载体；2)将重组朋eAg进行酶标记；3)底物液的配制；4)组装为成品试剂盒。8.根据权利要求7的方法，其中所述的步骤2)包括以下步骤a)将MBS用二甲基酰胺溶解，加入到服P溶液中，室温反应1小时;b)用G25凝胶柱层析去除过量的MBS;c)将已处理的酶液浓縮；d)把HBeAg加入到酶液中，室温反应1小时；e)将反应液过凝胶层析柱将偶联物和未偶联物分离，收集偶联物。f)用乙肝核心抗体亲和柱吸附具有HBcAg活性的偶联物。9.根据权利要求7的方法，其中所述的步骤3)是配制应用于ELISA的显色底物液，包括以下步骤a)显色液A(100ml，PH4.7)的配制:柠檬酸0.86g和柠檬酸三钠1.735g溶于去离子水中，定容至100ml，加入HA50叱混匀；b)显色液B(100ml，PH4.7)的配制:①柠檬酸0.8256g、柠檬酸三钠1.6656g和蔗糖6g溶于去离子水中，定容至96ml，②TMB0.026g溶于4迈1DMSO,将①和②混匀。10.根据权利要求7的方法，其中所述的步骤3)是配制应用于CLIA的酶促化学发光底物液，包括以下步骤a)反应液A的配制12.lgTris，2.95ml浓盐酸，5g鲁米诺，lg苯丙荧蒽，0.5mlTween20，定容到1000ml。b)反应液B的配制7.3g柠檬酸三钠，4.4g柠檬酸，1.2111130%的双氧水，定容到1000ml。全文摘要本发明提供了一种双抗原夹心法乙型肝炎病毒E抗体体外诊断试剂盒(ELISA法)，其包括1)已包被于固相载体的重组HBeAg；2)已进行酶标记的重组HBeAg；3)底物液，例如应用于ELISA的显色底物液，或应用于CLIA的酶促化学发光底物液。另外，本发明提供了制备上述试剂盒的方法，其包括以下步骤1)将重组HBeAg包被于固相载体；2)对重组HBeAg进行酶标记；3)配制底物液；和4)组装为成品试剂盒。本发明的试剂盒灵敏度高、特异性好、结果准确，临床适用性强，可以准确地反映出乙肝患者体内E抗体的量。文档编号G01N33/544GK101598730SQ20091015811公开日2009年12月9日申请日期2009年7月13日优先权日2009年5月11日发明者冯挺财,娜张,钟士博申请人:钟士博