一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基。以该无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成：α-MEM10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺1-5mM、泊洛沙姆18850-300mg/L、重组人白蛋白2-8g/L、重组人转铁蛋白10-20mg/L、重组人胰岛素2-10mg/L、Hepes1-5mM、β-巯基乙醇50nM、脂质0.1-1mg/L、微量元素1-5mg/L、谷胱甘肽0.1-5mg/L、对氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氢化可的松1-50ng/mL、维生素PP20-50mg/L、维生素C5-50mg/L、式I的化合物2-10μM、式II的化合物5-20μM、黄体酮10-20ng/mL、腐胺1-10mg/L、肝素1-10IU/mL、EGF1-10ng/mL、b-FGF1-10ng/mL、HGF1-10ng/mL、VEGF1-10ng/mL。该MSCs无血清培养基BPS-SFM是一种化学成分确定、无动物源性物质、无血清的培养基；
【专利说明】—种用于培养间充质干细胞的无血清培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基，属于细胞工程与生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是广泛存在于人体组织器官中的成体干细胞，因其具有高度自我更新能力和多向分化潜能，在临床造血支持、促进干细胞植入和免疫调控等方面具有潜在的应用前景。目前，通过将MSCs作为细胞治疗产品进行直接输注，或与支架材料相结合构建组织工程化的组织、器官(皮肤、骨或软骨等)进行移植开展的大规模临床前及临床研究证实，MSCs在烧伤、骨缺损、软组织填充、终末期肝病、心肌梗死、糖尿病等创伤或疾病的治疗中具有良好的安全性和有效性。例如，2012年，美国Osiris公司的干细胞产品Prochymal在加拿大获批上市,成为全球首个获批的干细胞药物。Prochymal是间充质干细胞静脉注射剂，用于激素治疗失败的acute GvHD(急性移植物抗宿主病，一种骨髓移植并发症)的儿童患者，这是间充质干细胞临床应用的历史性进步。
[0003]目前，已经可从脐带、胎盘、成人骨髓、外周血、脂肪等组织中分离获得MSCs，虽然不同来源MSCs在特性上略有差别，但都具有如下共同性质:例如，体外成纤维生长、扩增，特异性表达⑶29、⑶44、⑶90、⑶105、⑶166，但不表达内皮和造血的标志⑶34和⑶45等，且在体外具有成脂、成骨和成软骨分化的潜能。因此，都可以作为终末期疾病、难治性疾病治疗的种子细胞来源。
[0004]随着MSCs在临床应用中的迫切需求以及潜在的巨大衍生市场，关于符合临床应用要求的、规模化的MSCs的分离、纯化、扩增技术和标准的建立亟待解决。由于组织中MSCs数量极其有限，为获得足够用于临床治疗的细胞量，需要在回输前对其进行体外扩增。虽然研究表明，常规用于普通细`胞培养的含有胎牛/新生牛血清的培养体系同样适合MSCs的体外扩增和维持，然而细胞内残存的动物血清会引发回输后受体产生严重的免疫反应，并且带来不可预知的动物源性污染，为临床应用带来诸多问题。例如Sunghoon Jung等人对这类含有血清或动物源成分的培养体系的临床应用问题进行了系统性总结(Sunghoon Junget al.,Ex vivo Expansion of Human Mesenchymal Stem Cell in Defined Serum-FreeMedia, Stem Cells International，2012)，其至少包括如下潜在问题:
[0005](I)有害病原体的污染，例如病毒、支原体、朊病毒等；
[0006](2)异种蛋白所引发的免疫反应；
[0007](3)高度的批间差异性导致细胞的生产过程很难实现标准化；
[0008](4)血清中还可能含有生长抑制因子、细胞毒性物质；
[0009](5)为降低各类污染风险而开展的质量控制难度十分高；
[0010](6)其它成分不明的因子、激素等物质的作用尚待研究。
[0011]近年来，对MSCs等成体干细胞的体外维持和扩增机制的深入研究，极大推动了MSCs的体外无血清培养体系的研发和建立。目前商品化以及在研的MSCs无血清培养基(表I)都是在基础培养基(a -MEM、IMDM、L-DMEM等)中添加生长因子(碱性成纤维细胞生长因子bFGF、上皮细胞生长因子EGF、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子-1IGF-1、干细胞生长因子SCF等)、蛋白(胰岛素Insulin、转铁蛋白Transferrin、人/牛血清白蛋白H/BSA等)、激素(地塞米松/钠)、微量元素(硒)、维生素等。无血清培养基具有成分明确的特点，并可良好维持MSCs的体外增殖和分化多能性，但存在价格高、保存时间短等问题。同时，这些培养基大多需要辅助明胶等基质胶对培养平皿进行包被处理，不但可能因此引入动物源成分，而且也增加了细胞培养扩增的工作量和传代过程中的污染机会。因此，寻找成分明确、质量稳定、使用便捷、成本较低的无血清培养体系对于MSCs的临床应用具有重要的意义。
[0012]表1目前已有的商品化培养基情况统计表
[0013]
【权利要求】
1.一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基，以该无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成: α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氢钠 2.4g/L、L-谷氨酰胺 l_5mM、泊洛沙姆 18850_300mg/L、重组人白蛋白2-8g/L、重组人转铁蛋白10-20mg/L、重组人胰岛素2-lOmg/L、H印esl_5mM、β-巯基乙醇50ηΜ、脂质0.1-lmg/L、微量元素l_5mg/L、谷胱甘肽0.l_5mg/L、对氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氢化可的松l-50ng/mL、维生素PP20_50mg/L、维生素C5_50mg/L、式I所示的化合物2-10 μ M、式II所示的化合物5-20 μ Μ、黄体酮10_20ng/mL、腐胺l-10mg/L、肝素1-lOIU/mL、EGFl-10ng/mL、b-FGFl-10ng/mL、HGFl-10ng/mL、VEGFl-10ng/mL ；
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其中，所述脂质包括胆固醇、花生四烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸中的一种或几种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其中，所述微量元素包括Cu、Zn、Se、Fe、Sn、N1、Ag、Al、Cr、Ge、Zr、Rb、Co、Cd、Ga、Mg、Mn 和 Ba 中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的无血清培养基，其中，以该无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成: α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺5mM、泊洛沙姆188100mg/L、重组人白蛋白8g/L、重组人转铁蛋白20mg/L、重组人胰岛素10mg/L、Hepes5mM、β-巯基乙醇50ηΜ、胆固醇0.5mM、花生四烯酸50nM、棕榈酸0.26mg/L、棕榈油酸0.25mg/L、硬脂酸0.28mg/L、油酸 0.28mg/L、亚油酸 0.28mg/L、亚麻酸 0.28mg/L、Cu5nM、Se30nM、ZnlmM、Ga0.3mM、Cr5 μ M> Mg0.3mM、Mn5nM、谷胱甘肽lmg/L、对氨基苯甲酸lmg/L、氢化可的松50ng/mL、维生素PP50mg/L、维生素C20mg/L、式I所示的化合物10 μ M、式II所示的化合物20 μ Μ、黄体酮15ng/mL、腐胺 10mg/L、肝素 10IU/mL、EGF10ng/mL、b-FGF10ng/mL、HGF10ng/mL、VEGFIOng/mL0
5.根据权利要求1或4所述的无血清培养基，其中，以该无血清培养基的体积计，其还包括:原儿茶酸 1.5mmol/L、PDGF-BBIOng/mL, IGF-110ng/mL、GM-CSFl-lOng/mL、TGF-β 1-lOng/mL。
6.根据权利要求5所述的无血清培养基，其中，以该无血清培养基的体积计,其还包括:原儿茶酸 1.5mmol/L、PDGF-BBIOng/mL, IGF-110ng/mL、GM-CSFlOng/mL、TGF-β IOng/mL0
7.权利要求1-6任一项所述的用于培养间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，其包括将各种成分与水混合之后利用0.22 μ m滤器过滤除菌，密封，4°C避光保存的步骤。
8.权利要求1-6任一项所述的用于培养间充质干细胞的无血清培养基在间充质干细胞培养中的应用。`
【文档编号】C12N5/0775GK103555665SQ201310583547
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】赵侃, 王春有, 赵宇, 刘湘连, 李莉莉 申请人:北京东方华辉生物医药科技有限公司