一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法，该方法以大豆糖蜜作为唯一碳源，再添加所需的培养基，采用黑曲霉菌发酵生产柠檬酸；采用大豆糖蜜质量浓度26%，发酵温度35℃，起始pH4.5，发酵时间96h，接种量5%，在此条件下，大豆糖蜜发酵柠檬酸得到的总酸度为9.02%。本发明选用大豆糖蜜发酵生产柠檬酸，充分利用了大豆糖蜜这一宝贵资源，对其开发和利用，一方面可减轻对环境压力，另一方面也可以大大提高大豆糖蜜的利用价值，变废为宝。另外由于大豆糖蜜价格低廉，采用其作为发酵底物可以明显降低生产成本。
【专利说明】一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法。
【背景技术】
[0002]柠檬酸又名枸橼酸，是一种三元羧酸，其学名为3—羟基一3—羧基戊二酸。柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布广泛，主要存在于柠檬、柑橘、梅子等果实中。柠檬酸被广泛地应用于食品、医药和化学工业中。 [0003]大豆糖蜜是醇法生产大豆浓缩蛋白过程中的副产物。1963年，Daniel Chajuss把乙醇提取大豆蛋白质过程中产生的棕色粘稠的浆状物质命名为“大豆糖蜜”。大豆糖蜜成分较为复杂，是多种植物性化合物的集合体。在生产大豆浓缩蛋白的过程中产生的大豆糖蜜是制约生产企业扩大生产规模的主要因素之一，由于大豆糖蜜物料的特殊性，目前只作为价格低廉产品出售主要用作饲料，有效成分得不到充分利用，造成资源浪费。因此，对大豆糖蜜的开发和利用显得尤为重要，若能充分利用这一宝贵资源，对其开发和利用，一方面可减轻对环境压力，另一方面也可以大大提高其利用价值。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是:提供一种生产成本低的大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法，该方法不仅充分利用了大豆糖蜜中的有效成分，大大提高了其的利用价值，变废为宝，而且减轻了大豆糖蜜对环境的压力。
[0005]解决上述技术问题的技术方案是:一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法，包括以下步骤:
(1)培养基的制备
菌种活化培养基的制备:取去皮土豆加蒸懼水煮沸25-35 min, 土豆与蒸懼水的比例为:lg:3.8-4.2 mL,过滤,取滤液,按Ig土豆加入0.1-0.15g葡萄糖和0.09-0.095g琼脂计加入葡萄糖和琼脂，用蒸馏水定容，土豆与定容后溶液的比例为:lg:4.8-5.2 mL，灭菌后铺斜面，制备成斜面培养基备用；
种子培养基的制备:取55-65g/L的大豆糖蜜溶液，按ImL大豆糖蜜溶液加入
0.05-0.06g葡萄糖计加入葡萄糖，用蒸馏水定容，大豆糖蜜溶液与定容后溶液的体积比为:1:1.9-2.1，灭菌后冷却备用；
发酵培养基的制备:调节大豆糖蜜初糖质量浓度为23-28%，加入新制配的石灰乳调pH8.8-9.2，加热煮沸，过滤，滤液用硫酸回调至pH5.8-6.2，再加草酸除去多余的Ca2+,在2500-3500 r/min的转速下离心分离15-25 min,取上清液，按ImL上清液加入
0.005-0.00681^2?04和().01-0.015尿素计，先加入KH2PO4，灭菌后，再加入尿素，再在无菌操作条件下利用盐酸或者氢氧化钠溶液调节PH4.3-4.8，冷却备用；
(2)菌种活化:以无菌操作方式用接种环取一环的黑曲霉菌菌种到菌种活化培养基中划斜面，放在28-33°C恒温培养65-80 h后，用无菌水将斜面上的孢子洗下制备孢子悬浊液，利用无菌水调节孢子悬浊液中孢子浓度0.8 X IO6-L 2X106spore/mL ；
(3)种子培养:取孢子悬浮液接入种子培养基中，孢子悬浮液与种子培养基的体积比为:1:45-55，于32-38°C、150-250 r/min的摇床中培养35_45h得种子发酵液；
(4)糖蜜发酵产柠檬酸:按4-6%的接种量将种子发酵液接种到发酵培养基中，将接种好的培养基放到32-38°C、150-250 r/min的摇床上培养90_100h。
[0006]本发明的进一步技术方案:所述的发酵培养基的制备步骤中，所述的石灰乳的质量浓度为10-20%，所述的盐酸或者氢氧化钠溶液的浓度为l-2mol/L。 [0007]所述的菌种活化培养基的制备和种子培养基的制备步骤中，灭菌是指在121°C灭菌20 min,所述的发酵培养基的制备步骤中，尿素是指在108°C灭菌5min后的尿素，盐酸或者氢氧化钠溶液是指在121°C灭菌15min后的盐酸或者氢氧化钠溶液。
[0008]以干基计，大豆糖蜜中碳水化合物占总固形物含量的60%左右，是一种良好的天然微生物发酵剂，因大豆糖蜜价格低廉，作为发酵底物可以明显降低生产成本，使其有效地转换为具有更高利用价值的生物能源和化工原料，同时，大豆糖蜜制备发酵产品的副产物还是良好的饲料添加剂，可达到物尽其用。本发明选用大豆糖蜜发酵生产柠檬酸(以大豆糖蜜作为唯一碳源)，充分利用了大豆糖蜜这一宝贵资源，对其开发和利用，一方面可减轻对环境压力，另一方面也可以大大提高大豆糖蜜的利用价值。因此，选用大豆糖蜜发酵生产柠檬酸，无论是从经济角度还是从可行性角度，都是值得考虑选择利用的。本发明采用大豆糖蜜发酵生产柠檬酸得到的总酸度为9.02%。
[0009]下面，结合附图和实施例对本发明之一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法的技术特征作进一步的说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1:本发明工艺流程图。
【具体实施方式】
[0011]实施例1:一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法，包括以下步骤:
(I)培养基的制备
菌种活化培养基的制备:50 g去皮土豆加蒸馏水200mL煮沸30 min，过滤，取滤液，加入5 g葡萄糖，4.5 g琼脂，蒸馏水定容至250 mL，在121°C灭菌20 min后倒入试管中铺斜面，制备成斜面培养基备用。
[0012]种子培养基的制备:于250 ml三角瓶加入60 g/L的大豆糖蜜溶液50 mL，加入2.5g葡萄糖，蒸馏水定容至100 mL，12rC灭菌20 min，冷却备用。
[0013]发酵培养基的制备:调节大豆糖蜜初糖含量为26% (质量浓度)，加入新制配的15%石灰乳调PH9.0，加热煮沸，过滤，滤液用硫酸回调至pH6.0，再加草酸除去多余的Ca2+，在3000 r/min的转速下离心分离20 min,取上清液，以每瓶50 mL分装到500 mL的三角瓶中，添加KH2PO4 0.3g,在121 °C下高压灭菌20 min,在无菌操作条件下加入尿素0.5g (尿素事先108°C灭菌5min)，再在无菌操作条件下利用lmol/L盐酸或者氢氧化钠溶液调节pH4.5(lmol/L盐酸或者氢氧化钠事先121°C灭菌15min)，冷却备用。
[0014](2)菌种活化:以无菌操作方式用接种环取一环的黑曲霉菌菌种到菌种活化培养基中划斜面，把接好菌种的试管放在30°C恒温培养72 h后，用无菌水将斜面上的孢子洗下制备孢子悬浊液，利用无菌水调节孢子悬浊液中孢子浓度约106SpOre/mL。
[0015](3)种子培养:吸取约2 mL孢子悬浮液接入已装有100 mL的种子培养基的250mL的三角瓶中，35 0C 200 r/min的摇床中培养40 h得种子发酵液。
[0016](4)糖蜜发酵产柠檬酸
利用大豆糖蜜按照发酵培养基的制备方法制得发酵培养基，按5% (质量分数)的接种量将种子发酵液接种到发酵培养基中，将接种好的培养基放到35°C，200r/min的摇床上培养96h。在此条件下，大豆糖蜜 发酵柠檬酸得到的总酸度为9.02%。
【权利要求】
1.一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)培养基的制备 菌种活化培养基的制备:取去皮土豆加蒸懼水煮沸25-35 min, 土豆与蒸懼水的比例为:lg:3.8-4.2 mL,过滤,取滤液,按Ig土豆加入0.1-0.15g葡萄糖和0.09-0.095g琼脂计加入葡萄糖和琼脂，用蒸馏水定容，土豆与定容后溶液的比例为:lg:4.8-5.2 mL，灭菌后铺斜面，制备成斜面培养基备用； 种子培养基的制备:取55-65g/L的大豆糖蜜溶液，按ImL大豆糖蜜溶液加入0.05-0.06g葡萄糖计加入葡萄糖，用蒸馏水定容，大豆糖蜜溶液与定容后溶液的体积比为:1:1.9-2.1，灭菌后冷却备用； 发酵培养基的制备:调节大豆糖蜜初糖质量浓度为23-28%，加入新制配的石灰乳调pH8.8-9.2，加热煮沸，过滤，滤液用硫酸回调至pH5.8-6.2，再加草酸除去多余的Ca2+,在2500-3500 r/min的转速下离心分离15-25 min,取上清液，按ImL上清液加入 0.005-0.00681^2?04和().01-0.015尿素计，先加入KH2PO4，灭菌后，再加入尿素，再在无菌操作条件下利用盐酸或者氢氧化钠溶液调节PH4.3-4.8，冷却备用； (2)菌种活化:以无菌操作方式用接种环取一环的黑曲霉菌菌种到菌种活化培养基中划斜面，放在28-33°C恒温培养65-80 h后，用无菌水将斜面上的孢子洗下制备孢子悬浊液，利用无菌水调节孢子悬浊液中孢子浓度0.8 X IO6-L 2 X IO6SporeAiL ； (3)种子培养:取孢子悬浮液接入种子培养基中，孢子悬浮液与种子培养基的体积比为:1:45-55，于32-38°C、150-250 r/min的摇床中培养35_45h得种子发酵液； (4)糖蜜发酵产柠檬酸:按4-6%的接种量将种子发酵液接种到发酵培养基中，将接种好的培养基放到32-38°C、150-250 r/min的摇床上培养90_100h。
2.根据权利要求1所述的一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于:所述的发酵培养基的制备步骤中，所述的石灰乳的质量浓度为10-20%，所述的盐酸或者氢氧化钠溶液的浓度为l-2mol/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种大豆糖蜜发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于:所述的菌种活化培养基的制备和种子培养基的制备步骤中，灭菌是指在121°C灭菌20 min，所述的发酵培养基的制备步骤中，尿素是指在108°C灭菌5min后的尿素，盐酸或者氢氧化钠溶液是指在121°C灭菌15min后的盐酸或者氢氧化钠溶液。
【文档编号】C12R1/685GK103614421SQ201310583223
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】程谦伟, 孟陆丽, 易弋, 孙庭广, 黄继伟 申请人:广西科技大学