苏云金芽孢杆菌基因cry1Ah3及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及“苏云金芽孢杆菌基因cry1Ah3及其应用”，属于生物防治领域。本发明从BT菌株Bt?S6克隆到一个新的基因，命名为cry1Ah3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示。编码该基因的蛋白Cry1Ah3，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO2所示的。其室内蛋白活性检测，对玉米螟、棉铃虫、水稻二化螟、小菜蛾有高活性，为生物防治提供了新的生物资源。
【专利说明】苏云金芽孢杆菌基因cry1Ah3及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及一种苏云金芽孢杆菌基因crylAh3以及其应用。
【背景技术】
[0002]虫害是造成农作物减产的重要原因之一，减少虫害的损失是增加粮食与饲料作物产量的重要途径。据统计全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14%，直接给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。我国每年因虫害造成的损失水稻减产10%、小麦减产20%、棉花减产30%以上[夏启中，张明菊，抗植物虫害基因及其应用，鄂州大学学报，2005，(5):56-60.]。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，生物杀虫剂成本较高。长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。因此，减少杀虫剂使用量，发展现代植物保护技术，已成为可持续发展农业中必须正视的课题之一。
[0003]苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins,ICPs),也称δ-内毒素(delta-endotoxin),它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E, Crickmore.N, Van Rie.J., Lereclus.D, Baum.J, Feitelson.J, Zeigler.D.R., Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev, 1998，62 (3): 775-806.]。
[0004]自1981年Schn印f等克隆了 Bt的第一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，截止2008年6月已发现和克隆了 412种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。
[0005]1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自BtcryIAcο在接下来的几年里，转cryIAb基因的抗虫玉米,转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有crylAc/crylA基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2007年，全球转基因作物种植面积增长率达12%，即增加1230万hm2，达到1.143亿hm2 (2.824亿英亩)。第一个12年，转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。
[0006]由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。[0007]因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。
【发明内容】
[0008]本发明提供一个新的苏云金芽孢杆菌基因crylAh3，其室内蛋白活性检测，对玉米螟、棉铃虫、水稻二化螟、小菜蛾有高活性，而且对大豆食心虫也有较好的活性，为生物防治提供了新的生物资源。
[0009]一种杀虫蛋白，命名为CrylAh3，其氨基酸序列如SEQ ID N02所示的。
[0010]一种苏云金芽孢杆菌杀虫基因，其核苷酸序列编码上述杀虫蛋白CrylAh3。
[0011]所述杀虫基因命名为crylAh3，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。 [0012]上述杀虫 基因或蛋白在杀灭害虫中的应用，所述害虫为玉米螟、棉铃虫、水稻二化螟、小菜蛾或大豆食心虫。
[0013]所述应用是将蛋白作为杀虫剂的有效成分用于所述害虫。
[0014]本发明从BT菌株Bt S6 (保藏编号为GMCC3459)中克隆得到了一个新的基因，提交Bt命名委员会命名为crylAh3，经测序，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示，其氨基酸序列如SEQ ID N02所示。用软件对CrylAh3蛋白进行了理化性质分析，该基因全长3483bp，编码的氨基酸为1160个，推算所编码蛋白分子量为约131kDa。该蛋白的理论等电点为5.10，为弱酸性蛋白质。
[0015]其室内蛋白活性检测，对玉米螟、棉铃虫、水稻二化螟、小菜蛾有高活性，为生物防治提供了新的生物资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1Bt S6扫描电镜图片
[0017]图2Bt S6PCR产物电泳图谱
[0018]图3crylAh3基因与cryIAhl基因序列比较
[0019]图4CrylAh3基因与CrylAhl基因序列比较
[0020]图5crylAh3基因表达分析
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
[0022]下述实验中所述的材料均为市售。
[0023]实施例1
[0024]1.菌株形态学观察特性:
[0025]Bt菌株接种于1/2LB培养基中，30°C培养大约两天，显微镜观察芽胞晶体释放后，刮取培养物用蒸馏水洗3-4遍，悬浮于ImL无菌水中，孢晶混合液滴于玻璃片上，干燥，经锇酸固定，而后经酒精梯度脱水，临界点干燥，离子溅射喷金(2nm)，New Bio-TEMH-7500扫描电镜观察拍照(图)，结果显示Bt杀虫蛋白形成双锥形晶体。
[0026]2.基因的克隆与序列分析:[0027]2.1基因克隆:
[0028]设计引物扩增基因全长:
[0029]1AH5 atggagatagtgaataatcagaatc
[0030]1AH3 ttcctccataaggagtaattccacgc
[0031]以Bt菌株Bt S6的基因组为模板，用上述引物、Phusion超保真DNA聚合酶扩增新cry基因，得到约3.5kb的片段。将该全长基因克隆入pEB载体。测序结果用Vector NTISuite9软件包中的ContigExpress程序进行拼接。得到该基因的序列，并将其翻译成氨基酸序列见附录。
[0032]详细步骤如下:
[0033]I) Bt S6基因组制备
[0034]⑴将菌株Bt S6划线接种于LB培养基上，30°C培养到芽胞释放；尽可能刮取平板上全部菌体于1.5ml EP管中，用IOOyl TE溶液充分悬浮；加入100 μ I 4%SDS溶液，充分混匀；加入 200 μ I NaAc (3Μ, ρΗ4.5)，混匀，12000rpm 离心 10 分钟；
[0035]⑵收集上清，加入等体积异丙醇，-20°C静置20分钟；
[0036](3) 12000rpm离心10分钟，弃上清；
[0037]⑷用70%的无水乙醇清洗沉淀，室温晾干；
[0038](5佣100 μ I TE溶液溶解；_20°C保存备用。
[0039]2) PCR反应体系:
[0040]
【权利要求】
1.一种杀虫蛋白，命名为CrylAh3，其氨基酸序列如SEQ ID N02所示的。
2.—种苏云金芽孢杆菌杀虫基因，其核苷酸序列编码权利要求1所述的杀虫蛋白CrylAh30
3.根据权利要求2所述的苏云金芽孢杆菌杀虫基因，命名为CrylAh3，其核苷酸序列如SEQ ID NOl 所示。
4.权利要求2或3所述的杀虫基因或权利要求1所述的蛋白在杀灭害虫中的应用，所述害虫为玉米螟、棉铃虫、水稻二化螟、小菜蛾或大豆食心虫。
5.权利要求4所述应用，是将权利要求1所述的蛋白作为杀虫剂的有效成分用于所述害虫。`
【文档编号】C12N15/32GK103570811SQ201310582998
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】束长龙, 耿丽丽, 张 杰, 宋福平, 彭琦 申请人:中国农业科学院植物保护研究所