及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0063] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons, New York,1987 and periodic updates； the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, Chromatin(P. M. ffassarman and A. P. ffolffe, eds.), Academic Press，San Diego，1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，V〇1.119, Chromatin Protocols (P. B. Becker，ed. ) Humana Press，Totowa，1999 等。
[0064] 实施例1重组葡激酶的表达及纯化
[0065] 重组葡激酶（rSAK)的表达及纯化方法，具体详见重庆医科大学学报2012年第37 卷第3期《重组葡激酶的表达纯化及纤溶活性鉴定》，杨可，杨震，汪德强，雷寒，周建中。
[0066] 亦即，主要构建方法如下：
[0067] 利用基因合成技术，优化合成rSAK全长基因序列，在保持蛋白质序列不变的情况 下，优化部分可能影响翻译、表达过程的密码子碱基序列，使其成为大肠杆菌的偏爱密码子 或最佳密码子，以pET-28a为载体，诱导优化后的基因序列在感受态E. coli BL21中表达并 通过Ni-NAT柱纯化。
[0068] 所述rSAK全长基因序列如SEQID NO. 1所示，具体为：
[0069] TCATTCTCCTCCATTACCAACGAAGTCTCCGCCTCCTCAAGTTTCGATAAAGGCAAATACAAAAAAGGT GATGACGCCTCCTATTTCGAACCGACCGGCCCGTACCTGATGGTTAACGTCACGGGCGTGGACAGCAAGGGTAATGA ACTGCTGTCTCCGCATTATGTTGAATTTCCGATTAAACCGGGTACCACGCTGACCAAAGAAAAAATCGAATATTACG TCGAATGGGCACT GGATGCGACGGCCTACAAAGAATTCCGTGTGGTTGAACTGGATCCGTCTGCTAAAATCGAAGT TACCTACTACGACAAAAACAAGAAAAAAGAAGAAACCAAATCATTTCCGATCACGGAAAAAGGCTTCGTCGTGCCGG ATCTGTCGGAACACATTAAAAACCCGGGCTTCAACCTGATTACGAAAGTGGTCATCGAAAAGAAAo
[0070] 所得重组葡激酶（rSAK)的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示，具体为：
[0071] SFSSITNEVSASSSFDKGKYKK⑶DASYFEPTGPYLMVNVTGVDSKGNELLSPHYVEFPIKPGTTLT KEKIEYYVEffALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKV VIEKK。
[0072] 实施例2人a微球蛋白融合蛋白的表达及纯化
[0073] 人a微球蛋白（a 1M)的表达及纯化方法，具体详见Zhang Y, Gao Z, Zhang Z, et al. Cloning, purification,crystallization and preliminary X-ray sstudies of human a 1-microglobulin[J] ? Acta Crystallogr Sect F Stryc Biol Cryst Commun, 2012,68(pt 6):692-694。
[0074] 所述人a微球蛋白（a 1M)的基因序列如SEQID NO. 3所示，具体为：
[0075] CAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACC TGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGA GATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTG ATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAG TATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCC GCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCA CCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAAo
[0076] 所得人a微球蛋白（a 1M)的氨基酸序列如SEQID NO. 4所示，具体为：
[0077] QVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSG AYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQG VGIPEDSIFTMADRGECVPGEQE。
[0078] 实施例3 RGD-重组葡激酶-人a微球蛋白融合蛋白的质粒构建
[0079] 1. 1 材料
[0080] 重组葡激酶（rSAK)由实施例1构建，人a微球蛋白截短体（a 1M)由实施例2构 建，质粒载体PEGX6P-1由Novagen公司购买获得。大肠杆菌0册(1、8121，3(：蛋白酶，限制 性内切酶NotI、SalI，T4 DNA连接酶，高保真rTaq酶，dNTP，质粒纯化试剂盒，DNA Marker， 分子量蛋白Marker等均购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自Promega公司。凝血酶， 纤溶酶原，纤维蛋白原，尿激酶标准品等均购自中国食品药品检定院。其余试剂均为国产 分析纯。
[0081] 1.2 仪器
[0082] 水浴箱，温箱，金属浴连接仪，PCR仪，凝胶成像仪，超声破碎仪，梯度杯，蛋白浓度 检测仪，GST亲和层析柱，DEAE离子交换柱，分子筛（Superdex 75)等均系GE公司产品。其 余试剂均为国产分析纯。
[0083] 1. 3方法
[0084] 1. 3. 1采用重叠延伸PCR法获得目的基因融合片段RGD-rSAK- a 1M
[0085] 以重组葡激酶（rSAK)、人a微球蛋白（a 1M)分别进行PCR扩增得两个片段，凝胶 回收后以这两个片段为模版进行重叠延伸PCR，获得目的基因融合片段RGD-rSAK-a 1M。重 叠延伸PCR引物如表1所示。
[0086]表1
[0087]
【主权项】
1. 一种融合蛋白，为RGD-重组葡激酶-人a微球蛋白融合蛋白。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，重组葡激酶的氨基 酸序列如SEQIDNO. 2所示。
3. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，人a微球蛋白的氨 基酸序列如SEQIDNO. 4所示。
4. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，RGD连接于重组葡激酶的N端，人a 微球蛋白连接于重组葡激酶的C端。
5. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述RGD-重组葡激酶-人a微球蛋 白融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 12所示。
6. -种多核苷酸，其编码权利要求1-5任一权利要求所述融合蛋白。
7. -种表达载体，其含有权利要求6所述多核苷酸。
8. -种宿主细胞，其被权要求7所述载体转化。
9. 一种如权利要求1-5任一权利要求所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤： 1) 采用重叠延伸PCR法获得目的基因融合片段； 2) 将目的基因融合片段插入表达载体中，构建重组表达质粒； 3) 构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，在大肠杆菌中进行高效表达； 4) 融合蛋白的分离纯化。
10. 如权利要求1-5任一权利要求所述融合蛋白或其编码基因在制备抗凝、溶栓药物 中的用途。
11. 一种低免疫原性靶向抗凝、溶栓药物组合物，含有有效剂量的如权利要求1-5任一 权利要求所述融合蛋白或其编码基因及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。
【专利摘要】本发明提供了一种RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白及其制备与应用。本发明所述RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.12所示。本发明的融合蛋白通过以下制备方法获得：采用重叠延伸PCR法获得目的基因融合片段；将目的基因融合片段插入表达载体中，构建重组表达质粒；构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，在大肠杆菌中进行高效表达；融合蛋白的分离纯化。与现有的同类产品比较，本发明的融合蛋白不仅具有高效的溶栓抗凝活性，而且兼备低的免疫原性。与此同时，本发明的融合蛋白还克服了现有的一些RGD-重组葡激酶活性下降和不溶性表达的缺点。
【IPC分类】C12N15-63, A61K48-00, C12N15-54, C12N9-12, A61K38-45, A61K38-17, A61P7-02
【公开号】CN104845949
【申请号】CN201410412215
【发明人】周建中, 汪德强, 苟冶然, 龙小滨, 陈检, 杨可, 白垒, 雷寒, 黄爱龙, 何泉, 张宏鹏
【申请人】重庆医科大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2014年8月20日