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[0027] 本发明第三方面提供了一种表达载体，其含有所述多核苷酸。
[0028] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述载体。这些方法包括重组DNA技 术、DNA合成技术等。可将编码所述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以 指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。
[0029] 较佳的，所述载体为原核载体或穿梭质粒，如原核载体PGEX6P-1质粒等。
[0030] 本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其被所述载体所转化。
[0031] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是尚 等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门菌、李斯特 细菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO, COS. 293细胞、或Bowes 黑素瘤细胞的动物细胞等。
[0032] 其中，特别优选大肠杆菌，如（E.coli)DH5a等。
[0033] 本发明第五方面公开了所述融合蛋白的制备方法，包括下列步骤：
[0034] 1)采用重叠延伸PCR法获得目的基因融合片段；
[0035] 2)将目的基因融合片段插入表达载体中，构建重组表达质粒；
[0036] 3)构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，在大肠杆菌中进行高效表达；
[0037] 4)融合蛋白的分离纯化。
[0038] 较佳的，步骤1)中，所述目的基因融合片段的基因序列如SEQIDN0.9所示，具体 为：
[0039] CGAGGGGATTCGTCATTCTCCTCCATTACCAACGAAGTCTCCGCCTCCTCAAGTTTCGATAAAGGCAAA TACAAAAAAGGTGATGACGCCTCCTATTTCGAACCGACCGGCCCGTACCTGATGGTTAACGTCACGGGCGTGGACAG CAAGGGTAATGAACTGCTGTCTCCGCATTATGTTGAATTTCCGATTAAACCGGGTACCACGCTGACCAAAGAAAAAA TCGAATATTACGTCGAATGGGCACTGGATGCGACGGCCTACAAAGAATTCCGTGTGGTTGAACTGGATCCGTCTGCT AAAATCGAAGTTACCTACTACGACAAAAACAAGAAAAAAGAAGAAACCAAATCATTTCCGATCACGGAAAAAGGCTT CGTCGTGCCGGATCTGTCGGAACACATTAAAAACCCGGGCTTCAACCTGATTACGAAAGTGGTCATCGAAAAGAAAG GGTCGGGGCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACC TGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGA GATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTG ATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAG TATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCC GCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCA CCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAAo
[0040]较佳的，步骤2)中，所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业PET系 列载体和国内外广泛使用的PBV220载体，优选带有His-GST标签的原核高效可溶性表达载 体PGEX6P-1。
[0041]较佳的，步骤3)中的大肠杆菌可以是适合原核系统表达的配套大肠杆菌，当使用PET类载体，宿主菌优选E. coli BL21 (DE3)系列，当使用PBV220载体时宿主菌可选择多种 商业上提供的大肠杆菌，优选E. coli DH5a。
[0042] 更佳的，步骤3)中，构建的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株，经IPTG诱导目 的蛋白表达。
[0043] 较佳的，步骤4)中，分离纯化方法为：在经Ni+亲和层析柱纯化过程中用3C蛋白 酶切除His-GST标签后，再利用DEAE离子交换柱、分子筛（Superdex 75)进行分离纯化。[0044] 本发明第六方面，提供了所述的融合蛋白或其编码基因在制备抗凝、溶栓药物中 的用途。
[0045] 本发明第七方面，提供了一种低免疫原性靶向抗凝、溶栓药物组合物，含有有效剂 量的可溶性的RGD-重组葡激酶-人a微球蛋白融合蛋白或其编码基因及至少一种药学可 接受的载体或赋形剂。
[0046] 本发明所提供的药物组合物可以多种剂型存在，如用于静脉注射等的注射剂，用 于皮下注射、表皮外敷等的经皮吸收剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴 鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种 形式，及肺部给药制剂及其他非肠道给药的组合物。上述各种剂型的药物均可以按照药学 领域的常规方法制备。
[0047] 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、 吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。该药用组合物还可以加入香味剂、甜味剂 等。
[0048] 如上所述的融合蛋白的药物制剂可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以经 静脉注射或者口、鼻、皮肤、肺吸入等途径给药。上述药物的优选周剂量为0.1-5 mg/kg体 重，优选的疗程为10至30天。一次性给药，或分次给药。无论采用何种给药方法，个体人 的最佳剂量应根据具体的治疗而定。
[0049] 本发明的有益效果为：
[0050] (1)本发明首次获得了可溶性的RGD-重组葡激酶-人a微球蛋白融合蛋白，以重 组葡激酶（rSAK)为对照，采用纤维蛋白溶圈法进行重组葡激酶-人a微球蛋白融合蛋白 的溶栓活性测定，通过血小板聚集试验进行抗凝活性测定。结果表明，该融合蛋白溶栓活性 与重组葡激酶相当，其纤溶活性与尿激酶标准品相当；与相应浓度的重组葡激酶（rSAK)相 比，具有显著抑制ADP激活血小板聚集的作用，抗血小板聚集作用较野生型葡激酶明显增 强。
[0051] (2)融合蛋白在大肠杆菌上清中高效表达，SDS-PAGE蛋白电泳显示其相对分子质 量约36KD，在溶液中以单聚体形式存在，有利于降低其免疫原性。在临床治疗血栓过程中， 部分病人需要多次给药，结果发现容易诱发人体的免疫反应，导致去抗体的形成，影响了具 有蛋白质水解活性的SAK-PLm复合物的形成，最终导致SAK失去了溶解血栓的功能。二聚 体存在多个抗原表位，与SAK的免疫原性相关，如果能够减少SAK二聚体的形成或许能够 降低其抗原性。因此，如何在保障其活性的前提下减轻SAK在临床给药过程中的免疫应答 将是今后面临的主要科学问题。为进一步通过基于SAK三维结构的分子改造来降低其免疫 原性并获得可望用于临床的SAK制剂提供了良好的研宄基础。
[0052] (3)本发明的融合蛋白与现有的同类产品比较，不仅具有高效的溶栓抗凝活性，而 且兼备低的免疫原性。与此同时，本发明的融合蛋白还克服了现有的一些RGD-重组葡激酶 活性下降和不溶性表达的缺点。
【附图说明】
[0053] 图1 :重叠延伸PCR产物电泳图，M :DNA marker 2000 ;1 :重叠延伸PCR产物。
[0054] 图2 :重组质粒双酶切鉴定电泳图，M :DNA marker 3000 ;1、2、3 :重组质粒双酶切 (Sal I、Not 1)〇
[0055] 图3 :融合蛋白的表达与纯化，M:蛋白Marker ;1 :未加入诱导剂IPTG的表达 菌（对照）；2:加入IPTG诱导的表达菌；3:超声破菌液上清；4:Ni+亲和层析柱纯化后 His-GST融合蛋白；5 :3C蛋白酶切除His-GST标签后的目的融合蛋白；6 :经DEAE纯化后的 目的融合蛋白；7 :经分子筛纯化后的目的融合蛋白。
[0056] 图4 :DEAE交换柱纯化图。
[0057] 图5 :分子筛纯化图，（A) Superdex 75的洗脱图；（B) Superdex 75的标定结 果：albumin bovine V (66. 2 kD)，chicken egg albumin (44. 2 kD), hymotrypsinogen A(24. 5kD)和 lysozyme(14. 4 kD) 〇
[0058] 图6 :目的蛋白纤溶活性效果图，1，2分别为尿激酶标准品10 y 1，20 y 1 ;3,4分别 为重组葡激酶l〇y l，20y 1 ;5,6分别为带His-GST标签的融合蛋白10y l，20y 1 ;7,8分别 为切除标签后的目的融合蛋白10 y 1，20 y 1 ;9,10分别为样品稀释缓冲液10 y 1，20 y 1。
[0059] 图7 :抗血小板聚集活性效果图。
【具体实施方式】
[0060] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0061] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0062] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握