up: :hyg的下游多克隆位点。
[0028] 优选的，步骤B1中，大肠杆菌转化后筛选阳性克隆采用的培养基为含有卡那霉素 的LB培养基，培养条件为37Γ培养过夜。
[0029] 本发明还设及一种深绿木霉T23Δ化el菌株，敲除深绿木霉T23基因组中的 Crel基因；所述深绿木霉T23ΔCrel菌株为深绿木霉（Trichoderma.at;rovi;ride)CGMCC NO:11574。
[0030] 优选的，所述敲除包括如下步骤：
[0031]S1、获取深绿木霉T23的crel基因侧翼序列；
[0032]S2、重组质粒PC1300化-Acrel的构建：W提取的深绿木霉T23的基因组DNA 为模板，分别对crel基因侧翼序列进行PCR特异性扩增，获得crel基因的上、下游侧 翼序列；将上、下游侧翼序列分别导入敲除质粒PC1300化的上、下游，形成重组质粒 pC1300cih-Δcrel;
[0033]S3、将所述重组质粒pC1300化-Δcrel转化大肠杆菌感受态，验证、筛选阳性克隆 提取重组质粒PC1300化-Δcrel,导入根癌农杆菌AGL1进行ATMT转化。
[0034] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0035] 1)深绿木霉作为重要生防菌株，其有效的括抗植物病原菌的特性使其在木霉生防 菌剂中应用越来越为广泛。高效的生防特性是木霉菌与病原菌互作中的关键，本发明通过 ATMT转化技术成功构建了深绿木霉碳代谢抑制因子CRE1敲除突变株，发现crel基因与深 绿木霉的生长和产抱有关。crel基因敲除后，突变株较野生株菌丝生长变慢，产抱明显滞 后。CRE1抑制了几下质酶、葡聚糖酶编码基因的转录从而降低了其酶活水平，同时还抑制了 纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等酶的活性。说明木霉菌碳代谢抑制基因化el抑制木霉菌与病 原菌互作中关键细胞壁降解酶的分泌，而工程株T23Δcrel菌株具有促进，对木霉菌细胞 壁降解酶分泌及活性，间接提高木霉菌括抗病原菌的功能。
[0036] 2)改良的ATMT技术，包括改进筛选培养基，将传统的利用PDA作为选择性培养基 改为IM诱导培养基，添加300μg/mL的头抱霉素和200μg/mL的潮霉素，延长了诱导剂作 用时间；此外，增加了木霉菌分生抱子浓度，木霉菌抱子浓度从IX1〇6提升到8X10 6,改良 后的方法适用于细胞壁较厚的深绿木霉，提升了转化效率及同源双交换发生几率。通过改 变筛选培养基为IM培养基，延长了诱导培养时间，边诱导边筛选；同时加上200ugAiL的潮 霉素进行抗性筛选，辅W300ug/mL特美汀抑制农杆菌的生长。改进的方法减少农杆菌在侵 染过程中阻力，增加其侵染效率，提高转化效率及转化子的稳定性。经筛选鉴定，在10个 阳性的转化子中，经鉴定1个是同源重组，9个是T-DNA插入，成功构建了深绿木霉敲除株 T23Δcrel。
【附图说明】
[0037] 通过阅读参照W下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0038] 图1为涂绿木霉crel基因侧翼序列克隆电泳结果不意图；其中，泳道Μ:DNA Marker2000;泳道1 :crel基因下游侧翼片段crel-down;泳道2 :crel上游侧翼片段 ere1-up；
[0039] 图2为crel敲除载体pC1300cih-Acrel的构建示意图；
[0040] 图3为敲除载体PC1300化-Acrel阳性克隆PCR鉴定示意图；其中，泳道M:DNA Marker2000 ;泳道1 :敲除载体阳性克隆pC1300化-Δcrel上游片段crel-up扩增鉴定；泳 道2 :敲除载体pC1300qh-Acrel阳性克隆下游crel-down片段扩增鉴定；
[00川 图4为crel敲除质粒pC1300cih-Acrel双酶切验证示意图；其中，泳道Μ:DNA Marker2000 ;泳道 1 :敲除载体pC1300cih-Acrel用HindIII和PstI双酶切crel-up; 泳道2 :敲除载体pC1300cih-Δcrel用EcoRI和ΚρηI双酶切crel-down;泳道3 :敲除载 体pC1300cih-Acrel用HindIII和EcoRI双酶切crel-up::hyg::crel-down;
[0042] 图5.为成功导入敲除载体PC1300化-Acrel的根癌农杆菌阳性克隆PCR鉴定。 其中，泳道1 :农杆菌阳性克隆crel上游侧翼序列crel-upPCR扩增；泳道Μ:DNAMarker 2000 ;泳道2 :农杆菌阳性克隆crel下游侧翼序列crel-downPCR扩增；
[0043] 图6为ATMT转化过程优化示意图；
[0044] 图7为改进后ATMT转化子在筛选平板中生长状态示意图；
[0045] 图8为不同分生抱子浓度下ATMT转化得到的转化子数示意图；
[0046] 图9为crel基因敲除深绿木霉菌PCR鉴定示意图；其中，泳道Μ:DNAMarker 2000 ;泳道1 :T-DNA插入单交换转化子同源重组引物（Δcrel-F/Δcrel-巧扩增；泳道2 : T-DNA插入单交换转化子T-DNA插入引物（tDNA-F/Hph-R)扩增；泳道3 :同源重组双交换转 化子同源重组引物（Acrel-F/Δcrel-巧扩增；泳道4 :同源重组双交换转化子T-DNA插入 引物（tDNA-F/Hph-R)扩增；
[0047] 图10为利用改良的ATMT转化方法得到的深绿木霉碳代谢抑制因子CRE1敲除突 变株Acre1的平板型图；
[0048] 图11为野生株和突变株几下质和葡聚糖酶活测定示意图；其中，A为T23和 T23Δcrel几下质酶活性平板测定，B为液体发酵几下质酶活和葡聚糖酶活，C为平板测定 0-1，3-葡聚糖酶酶活。
【具体实施方式】：
[0049] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。W下实施例将有助于本领域的技术人员 进一步理解本发明，但不W任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干调整和改进。运些都属于本发明的保 护范围。
[0050] 本发明设及的专用名词的术语解释如下：
[0051] 括抗木霉菌：木霉菌在工业和农业生防领域扮演重要的角色。在工业中，W里氏 木霉为代表的工业重要底盘细胞，常用于工业生产纤维素酶等酶制剂等产品；而在农业 生防领域，主要是W深绿木霉、哈茨木霉为代表的生防菌剂的开放和应用。括抗木霉菌在 植物病原真菌的生物防治中主要通过重寄生作用，与病原微生物竞争营养和生长环境、产 生毒性物质抑制病原菌生长、分泌细胞壁降解酶降解病原菌细胞壁组分，产生激发子诱导 寄主植物抗性等过程括抗植物病原菌，促进植物生长。木霉菌可产生多种代谢产物，其中 初级代谢产物主要是一些细胞壁降解酶类，如有几下质酶（chitinases)、0-1，3-葡聚 糖酶（6-1,3-邑111。曰11曰363)、蛋白酶（口1'〇16；[]1曰363)、纤维素酶（。611111曰363)、木聚糖酶 (xylanaes)等等，而木霉菌分泌的细胞壁降解酶类则恰恰能够高效降解真菌细胞壁等结 构，使病原菌失去侵染性或者引起死亡，有效防治植物病害。
[0052] 碳代谢抑制：当环境中存在多种碳源时，微生物会优先选择利用利用某一种优先 碳源，如葡萄糖、果糖等，同时在碳代谢抑制蛋白参与下抑制其他碳源的代谢和利用。运种 机制保证了微生物可W在复杂环境中提升竞争力和环境适应能力，使得其能在复杂生境 处于一个较为优势生态位运种全局性的碳代谢利用调控机制称作是碳代谢抑制（Carbon Cat油oliteR巧ression，CCR)或者葡萄糖抑制。碳代谢抑制蛋白普遍存在于各种微生物 中，具有多种多样的调控模式和途径，主要发生在转录层面的激活/抑制，W及转录后的翻 译控制，调节碳源转运蛋白活性或碳代谢抑制效应蛋白复合物稳定性等方式。
[0053] 碳代谢抑制因子crel:木霉菌中的CCR机制并不像细菌中由细胞中的cAMP水平 介导的，而是通过一种直接的DNA结合蛋白抑制基因的转录等方式实现的对不同碳源利用 的调控。在很多子囊菌类的真菌中，是由一种切S2化S2型转录调控因子化eA/CREl所介导 的抑制，通过对creA或者化el基因敲除株，很多代谢酶类如纤维素酶、半纤维素酶和果胶 酶等酶的编码基因均被发现受化e蛋白调控。
[0054] 连施例
[005引本发明是