一种构建高产丁醇菌株的方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种构建高产下醇菌株的方法与应用。
【背景技术】
[0002] 能源与环境是当今社会关注的焦点。随着化石能源的日渐枯竭和自然环境的污 染，人类对可再生能源的需求越来越强烈。利用微生物转化或发酵可再生资源高效生产可 再生能源是今后的能源发展趋势，运种通过生物法生产化学品的方式是可持续的且环境友 好的。
[0003] 下醇是一种重要的化工品和原料，可直接用作有机溶剂，是合成多种醋类化合物 的前体，广泛应用于各种塑料和橡胶制品中。同时，下醇也是优良的可替代汽油的生物燃 料。它具有和汽油相当的热值与辛烧值，可与汽油W任意比例混合；在运输过程中，不易腐 蚀管道；与乙醇相比，其蒸汽压低，安全性高，因此是一种极具潜力的新型生物燃料。目前， 下醇的年市场需求大约在百万吨级别。
[0004] 下醇可由生物合成是己斯德于1861年首次发现的。1912年，魏兹曼（Weizmann) 发现了一种梭菌Clostridiumacetobut^ixum(丙酬下醇梭菌）能够将淀粉转化为丙酬、 下醇及乙醇。之后，很多研究便集中于改造丙酬下醇梭菌，W期得到可用于工业化生产下醇 的工程菌株。但是，丙酬下醇梭菌是一种严格厌氧生长的革兰氏阳性细菌，其遗传操作系统 复杂，不利于进行实验室的研究和工业的生产。2008年，化otaAtsumi,JamesC.Liao等 首先在大肠杆菌中实现了下醇的合成（AtsumiS,CannAF,ConnorΜR,etal.Met油olic engineeringofEscherichiacolifor1-butanolproduction.Metabolicengineer! ng，2008, 10化）：305-311.)，该研究组将丙酬下醇梭菌体内的下醇合成途径转移至大肠杆 菌内，致使其可产生少量下醇。随后，该研究组对整条途径进行了优化，将WNADH为还原 力，催化可逆反应己豆酷辅酶A生成下酷辅酶A的下酷辅酶A脱氨酶复合物度cd-EtfAB complex)替换为来自齿垢密螺旋体（Treponemadenticola)的催化不可逆反应的反式締 酷辅酶A还原酶（Ter);催化乙酷辅酶A生成乙酷乙酷辅酶A的酶，由乙酷乙酷辅酶A硫解 酶帅1)换为大肠杆菌中活性更强的乙酷辅酶A乙酷转移酶（AtoB)，由此形成了NA畑和乙 酷辅酶A的驱动力，下醇产量大幅度提高。
[0005] 目前，在提高大肠杆菌产下醇方面，多数研究集中于改造来自丙酬下醇梭菌的下 醇途径，但运并不是唯一的策略。下醇途径是与糖酵解禪联的，除下醇途径外，基因组上可 能仍存在多个有利于下醇生产的祀点，而关于此类祀点的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种构建重组菌的方法。
[0007] 本发明提供的方法，为抑制或沉默生产下醇的出发菌的基因组上的丙酬酸激酶 pykA基因表达，得到重组菌。
[0008] 上述方法中，所述抑制或沉默生产下醇的出发菌基因组上的丙酬酸激酶pykA基 因表达为敲除生产下醇的出发菌基因组上的丙酬酸激酶pykA基因。
[0009] 上述方法中，所述敲除生产下醇的出发菌基因组上的丙酬酸激酶pykA基因采用 入-red同源重组系统、sacB基因介导筛选的同源重组或CRISPR/Cas系统。优先采用λ-red 同源重组系统进行实施。
[0010] 上述方法中，所述敲除生产下醇的出发菌基因组上的丙酬酸激酶pykA基因为采 用λ-red同源重组系统将生产下醇的出发菌基因组上的丙酬酸激酶pykA基因替换为 FRT(Flp重组酶识别祀点序列）；
[0011] 所述FRT的核巧酸序列为序列5第59-106位。
[0012] 上述方法中，所述生产下醇的出发菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌具体为大肠杆菌 BW25113 或其突变体邸216CGMCCNo. 11590。
[0013] 上述方法中，所述丙酬酸激酶pykA的氨基酸序列为序列表中序列1。
[0014] 上述方法中，所述丙酬酸激酶pykA基因pykA的核巧酸序列为序列3。
[0015] 上述方法中，所述抑制或沉默大肠杆菌邸216基因组上的丙酬酸激酶基因表达包 括如下步骤：
[0016] 1)将含有丙酬酸激酶基因pykA的上游同源臂、抗性基因和丙酬酸激酶基因pykA 的下游同源臂的DM分子导入邸216 (PKD46)，得到pykA替换为两端带有FRT的卡那霉素抗 性基因片段的中间菌；
[0017] 所述邸216 (P邸46)为将质粒导入邸216中得到的菌；
[0018] 2)将质粒PCP20转入所述中间菌，使所述PCP20质粒上的FRT替换了中间菌中的 卡那霉素，得到去除卡那霉素的中间菌；
[0019] 3)将所述去除卡那霉素的中间菌先在37°C培养去除了溫敏质粒PCP20和地046， 得到去除溫敏质粒的中间菌；
[0020] 4)将所述去除溫敏质粒的中间菌分别在卡那霉素抗性培养基、氯霉素抗性培养 基、无卡那霉素且无氯霉素平板培养基中培养，选取只在所述无卡那霉素且无氯霉素平板 培养基上生长，且在所述卡那霉素抗性培养基和所述氯霉素抗性培养基均不生长的菌，为 重组菌；
[0021] 所述两端带有FRT的卡那霉素抗性基因片段的核巧酸序列为序列5第41-1534 位；
[0022] 所述丙酬酸激酶基因pykA的上游同源臂为序列5第1-40位；
[0023] 所述丙酬酸激酶基因pykA的下游同源臂为序列5第1535-1574位。
[0024] 由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。
[00巧]上述方法或上述重组菌在生产下醇或提高下醇产量中的应用也是本发明保护的 范围。
[0026] 本发明的另一个目的是提供一种生产下醇的方法。
[0027] 本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述重组菌，得到下醇。
[0028]本发明所提供的丙酬酸激酶缺陷型的菌株邸216CGMCCNo. 11590源自大肠杆菌， EB216菌株是在大肠杆菌BW25113的基础上引入丙酬酸到下醇的生物合成途径，并缺失一 些副产物代谢途径获得的，其基因型为A1化A::化d，Aa化E::ter，Δ化地C::a化E2,Δ(ac kA-pta)::c;rt,AycjhD::atoB,Aeu1:E::;lMh,A；lMhF::;lMhcb,Δ化yc-hyp)::FRT,Am化：：F RT，其下醇生产途径见图1。在邸216菌株的基础上，敲除丙酬酸激酶基因，构建丙酬酸激酶 缺陷型的突变体，该突变体的下醇产量得到提高。
[0029] 所述敲除丙酬酸激酶基因的方法，是借助地04,PKD46,PCP20等3个质粒进行实施 的（示意图见图2)。
[0030] 所述地D4是PCR扩增卡那霉素抗性基因及其FRT的模板；
[0031] 所述地D46是用来表达λ-red同源重组酶的质粒，该酶对应基因的表达需用阿拉 伯糖诱导；
[0032] 所述PCP20是用来表达Flp重组酶W消除筛选标签卡那霉素抗性基因的质粒。
[0033] 生理指标均使用商业化的试剂盒进行测试。
[0034] 上述突变体菌株在小管中按照如下条件进行发酵：微好氧静置发酵；发酵溫度为 37°C;发酵时间为72h。
[0035] 上述突变体菌株在发酵罐中按照如下条件进行发酵：转速20化pm;发酵溫度为 37°C;发酵时间为72h。
[0036] 本发明实验证明，本发明通过的将生产下醇的出发菌邸216CGMCCNo.11590基因 组上的丙酬酸激酶pykA基因替换为FRT，得到重组菌，该重组菌发酵产生的丙酬酸产量明 显下降，下醇产量明显上升，工程菌细胞的一系列生理指标均发生了不同程度的变化。
【附图说明】
[0037] 图1为邸216体内的下醇生产途径。
[0038] 图2为基因敲除的过程示意图。
[0039] 图3为表示pykA和pykF基因敲除成功的PCR验证结果。
[0040] 图4为野生型与突变体菌株在小管中发酵的丙酬酸产量和下醇产量。
[0041] 图5为野生型与工程菌在发酵罐中发酵的丙酬酸生产曲线和下醇生产曲线。
[0042] 图6为使用高效液相色谱OPLC)分析发酵液的结果图。
【具体实施方式】
[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045] 大肠杆菌邸216菌已于2015年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中屯、（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.11590,分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia colio
[0046] 图1为邸216体内的下醇生产途径。
[0047] 实施例1、敲除大肠杆菌邸216中丙酬酸激酶基因制备重组菌
[0048] 下面的实施例用的是λ-red同源重组系统进行敲除丙酬酸激酶基因（图2)，其中 设计的质粒：
[0049]P邸4记载在如下文献中：Datsenko,KirillA.，andBairyLWanner.One-step