陷孔式单细胞克隆分离玻底培养板的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及细胞培养，特别涉及一种陷孔式单细胞克隆分离玻底培养板及单细胞克隆分离方法。
【背景技术】
[0002]体外培养细胞传统的器材为玻璃培养瓶，玻璃的表面是亲水的，不经过特殊的处理，普通的细胞就可以贴壁生长。
[0003]后来出现的聚苯乙稀(polystyrene，PS)材质的培养瓶，聚苯乙稀透光性能好，具有较好的强度和易塑性，并且没有毒性。聚苯乙烯结构表明了它是疏水的，即不具有亲水性，所以未经特殊处理的聚苯乙烯培养瓶不能使贴壁细胞正常贴壁，每个单位生产的细胞培养瓶的处理方法均不同，比如将聚苯乙烯表面接枝羟基(0H)，羧基(C00H)，氨基(NH或NH2)等基团，进行亲水性改性，从而完美解决贴壁细胞培养的问题。
[0004]单细胞克隆指的是分离单个细胞，其增殖产生的后代都是来源于同一个细胞，即为单细胞克隆。传统的单细胞克隆分离可采用有限稀释法或克隆环法。
[0005]有限稀释法:即把细胞稀释到理论上的5~10 μ I培养液中含I个细胞，然后用移液器吸取相应容积的细胞悬液至96孔板中，每孔补足培养液至200 μ 1，在显微镜下找到有单细胞克隆生长的培养孔，进行单细胞克隆分离。实际的操作中，该法效率不高，大量存在的空白孔和多细胞孔(细胞数大于或等于2)需要研宄人员观察排除，费时费力。
[0006]克隆环法:在显微镜下找到要挑取的单克隆，用记号笔在培养板的背面标示出来。用镊子夹取克隆环，在环的底部均匀的涂上凡士林，扣在标记的单克隆上，形成相对封闭的空间，然后在克隆环内滴入适量的胰酶，细胞消化下来后用枪头吸出，放到新的培养板中培养。该方法对操作技巧要求较高，初学者不易掌握。
【实用新型内容】
[0007]为克服上述现有技术的缺陷与不足，本实用新型提供一种陷孔式单细胞克隆分离玻底培养板及单细胞克隆分离方法。
[0008]本实用新型的技术方案是:
[0009]陷孔式单细胞克隆分离专用培养板，包括培养板本体，所述培养板本体上表面设有若干培养孔，每个培养孔的底板上设有若干规则排列的凹陷的小陷孔，所述小陷孔底部设有圆形通孔，所述小陷孔下方通过无影胶固定有玻璃底片，培养板本体上方盖有培养板至
ΠΠ O
[0010]优选的，所述培养板本体为聚苯乙烯板。
[0011]优选的，所述玻璃底片厚0.085-0.19mm。
[0012]优选的，所述小陷孔直径5~8mm，深2~4mm。
[0013]优选的，所述各个小陷孔的侧壁以及各小陷孔之间的间隔的表面覆盖有超疏水纳米层。
[0014]优选的，所述超疏水纳米层为具有超疏水表面的聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料层，或者是阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜。
[0015]优选的，每个小陷孔的右上方标有字母和数字的组合编号。
[0016]使用陷孔式单细胞克隆分离玻底培养板进行单细胞克隆分离的方法，包括步骤:
[0017]S1、将细胞悬液浓度稀释至30~50 cells/ml，在培养板的方形培养孔内加入定量的细胞稀释液，细胞只能在各个小陷孔底部的玻璃底片上粘附生长，而不能在培养板其它覆盖有超疏水纳米层的部位粘附生长；
[0018]S2、每天在显微镜下观察细胞生长情况，记录有单细胞克隆生长的小陷孔，吸弃培养液，PBS漂洗I次，吸除PBS，在有单细胞克隆生长的小陷孔中加入少量0.25%的胰酶，待细胞脱落，收集细胞；
[0019]S3、收集消化好的单细胞悬液，经PBS重悬，在100rpm转速下离心lOmin，获取细胞沉淀，再次在100rpm转速下离心lOmin，获取细胞沉淀，用完全培养液重悬，将细胞转移至新的24孔板中，继续扩大培养，所得即为单细胞克隆。
[0020]本实用新型的优点是:
[0021]本实用新型所提供的陷孔式单细胞克隆分离玻底培养板及单细胞克隆分离方法，培养板本体上表面设有若干培养孔，每个培养孔的底板上设有若干规则排列的凹陷的小陷孔，所述小陷孔底部设有圆形通孔，所述小陷孔底部用医用无影胶固定有玻璃底片，各个小陷孔的侧壁以及各小陷孔之间的间隔的聚苯乙烯表面覆盖有超疏水纳米层，细胞只能在各个小陷孔底部的玻片的亲水表面上粘附生长，而不能在培养板其它聚苯乙烯表面经过超疏水处理的部位粘附生长，方便进行单细胞克隆分离操作。
【附图说明】
[0022]下面结合附图及实施例对本实用新型作进一步描述:
[0023]图1为本实用新型型所述的陷孔式单细胞克隆分离玻底培养板的培养板本体的俯视图；
[0024]图2为本实用新型所述的培养板的一个培养孔的纵剖面结构示意图；
[0025]图3为本实用新型所述的陷孔式单细胞克隆分离玻底培养板盖上培养板盖的整体结构示意图。
【具体实施方式】
[0026]如图1-3所示，本实用新型所揭示的陷孔式单细胞克隆分离玻底培养板，包括由聚苯乙烯制成的培养板本体I，所述培养板本体上表面设有6个培养孔2，每个培养孔2的底板上设有按10X 10矩阵排列的凹陷的小陷孔3，所述小陷孔直径5~8mm，深2~4mm。所述小陷孔底部设有圆形通孔，所述小陷孔下方通过无影胶固定有玻璃底片4，所述玻璃底片厚0.085-0.19_。每个小陷孔的右上方标有字母和数字的组合编号，字母代表该小陷孔所在行，数字代表该小陷孔所在列，方便区分。培养板本体上方盖有培养板盖5。
[0027]所述各个小陷孔的侧壁以及各小陷孔之间的间隔的表面覆盖有超疏水纳米层。所述超疏水纳米层为具有超疏水表面的聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料层，或者是阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜。上述超疏水纳米层的制作方法为现有技术中采用的方法，例如在聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料表面蚀刻具有一定粗糙度的微观结构从而构建超疏水表面，采用气相沉积的方法制备超疏水的阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜。
[0028]使用陷孔式单细胞克隆分离玻底培养板进行单细胞克隆分离的方法，包括步骤:
[0029]S1、将细胞悬液浓度稀释至30~50 cells/ml，在培养板的方形培养孔内加入2 ml的的细胞稀释液，细胞只能在各个小陷孔底部的玻璃底片上粘附生长，而不能培养板其它覆盖有超疏水纳米层的部位粘附生长；
[0030]S2、每天在显微镜下观察细胞生长情况，记录有单细胞克隆生长的小陷孔，吸弃培养液，PBS漂洗I次，吸除PBS，在有单细胞克隆生长的小陷孔中加入少量0.25%的胰酶，待细胞脱落，收集细胞；
[0031]S3、收集消化好的单细胞悬液，经PBS重悬，在100rpm转速下离心lOmin，获取细胞沉淀，再次在100rpm转速下离心lOmin，获取细胞沉淀，用完全培养液重悬，将细胞转移至新的24孔板中，继续扩大培养，所得即为单细胞克隆。
[0032]上述实施例只为说明本实用新型的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本实用新型的内容并据以实施，并不能以此限制本实用新型的保护范围。凡根据本实用新型主要技术方案的精神实质所做的修饰，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。
【主权项】
1.陷孔式单细胞克隆分离专用培养板，其特征在于:包括培养板本体，所述培养板本体上表面设有若干培养孔，每个培养孔的底板上设有若干规则排列的凹陷的小陷孔，所述小陷孔底部设有圆形通孔，所述小陷孔下方通过无影胶固定有玻璃底片，培养板本体上方盖有培养板盖。
2.根据权利要求1所述的陷孔式单细胞克隆分离专用培养板，其特征在于:所述培养板本体为聚苯乙烯板。
3.根据权利要求1所述的陷孔式单细胞克隆分离专用培养板，其特征在于:所述玻璃底片厚 0.085-0.19mm。
4.根据权利要求1所述的陷孔式单细胞克隆分离专用培养板，其特征在于:所述小陷孔直径5~8_，深2~4mm。
5.根据权利要求1所述的陷孔式单细胞克隆分离专用培养板，其特征在于:所述各个小陷孔的侧壁以及各小陷孔之间的间隔的表面覆盖有超疏水纳米层。
6.根据权利要求5所述的陷孔式单细胞克隆分离专用培养板，其特征在于:所述超疏水纳米层为具有超疏水表面的聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料层，或者是阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜。
7.根据权利要求1所述的陷孔式单细胞克隆分离专用培养板，其特征在于:每个小陷孔的右上方标有字母和数字的组合编号。
【专利摘要】本实用新型公开了一种陷孔式单细胞克隆分离玻底培养板，所述培养板包括培养板本体，所述培养板本体上表面设有若干培养孔，每个培养孔的底板上设有若干规则排列的凹陷的小陷孔，所述小陷孔底部设有圆形通孔，所述小陷孔下方通过无影胶固定有玻璃底片，培养板本体上方盖有培养板盖。本实用新型所提供的陷孔式单细胞克隆分离玻底培养板及单细胞克隆分离方法，细胞只能在各个小陷孔底部的玻片的亲水表面上粘附生长，而不能在培养板其它聚苯乙烯表面经过超疏水处理的部位粘附生长，方便进行单细胞克隆分离操作。
【IPC分类】C12M3-00
【公开号】CN204608028
【申请号】CN201520253932
【发明人】何向锋, 沈康, 施文, 强福林, 王建红
【申请人】何向锋, 南通市肿瘤医院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月24日