用于分离非常小的胚胎样(vsel)干细胞的方法

专利名称：用于分离非常小的胚胎样(vsel)干细胞的方法
技术领域：
当前披露的主题总体上涉及从骨髓、脐带血、和/或其它来源分离的干细胞(在本文中被称为非常小的胚胎样(very small embryonic-like) (VSEL)干细胞)群的鉴定、分离及应用。更具体地，当前披露的主题涉及分离所述VSEL干细胞并且(任选地在体外处理后)将其用于治疗需要其的受试者中的组织和/或器官损伤。
背景技术：
干细胞和干细胞衍生物的应用已经在医药研究中，尤其在提供用于治疗由于遗传缺陷、创伤、和/或疾病过程的任何一个造成的组织损伤的试剂领域中获得提高的兴趣。理想地，能够分化为受影响的细胞类型的细胞可以被移植入需要其的受试者中，其中它们将与器官微环境相互作用并供应必须的细胞类型以修复损伤。已经付出了相当多的努力以从大量不同的组织中分离干细胞用在再生医药中。例如，授予I^sukamoto et al.的美国专利No. 5，750，397披露了据报道能够分化为淋巴细胞、 红细胞(erythroid)、和髓细胞单核细胞(myelomonocytic)谱系的人类造血干细胞的分离和生长。授予Bruder et al.的美国专利No. 5，736，396披露了用于在合适的生长和/或分化因子的影响下分离的人类间充质干细胞的谱系定向分化的方法。随后可以将所述得到的细胞引入宿主用于间充质组织再生或修复。强烈感兴趣的一个领域涉及胚胎干(EQ细胞的应用，其已经在小鼠中显示具有分化为动物的所有不同的细胞类型的潜能。小鼠ES细胞源自胚泡期的早期小鼠胚胎的内细胞群的细胞，并且其它多能和/或全能细胞已经从胚(germinal)组织(如原始生殖细胞；PGC)分离。这些多能和/或全能干细胞以未分化状态在体外增殖、保持10正常核型、 以及保持分化为全部的三个胚层(内胚层、中胚层及外胚层)的衍生物的潜能的能力使得这些细胞作为细胞的潜在来源用在出生后受试者的再生治疗中是有吸引力的。人类ES(hES)细胞的开发还不及对小鼠ES细胞进行的进展成功。Thomson et al.报道了来自低等灵长类(美国专利 No. 5，843，780 ;Thomson et al. (1995)92 Proc Natl Acad Sci USA 7844-7848)、以及来自人类(Thomson et al. (1998)282 Science 1145-1147)的多能干细胞。Gearhart et al.产生了来自胎儿性腺组织的人类胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott et al. (1998)95 Proc Natl Acad Sci USA 13726-13731 ；及美国专利No. 6，090，622)。hES和hEG细胞均具有多能干细胞的理想特征，在于它们能够在体外增殖而不分化，它们通常维持正常的核型，并且它们仍然能够分化为多种不同的细胞类型。 无性(clonally)来源的人类胚胎干细胞系在培养中长期维持多能性和增殖潜能(Amit et al. (2000)227 Dev Biol 271—278)。ES细胞或其它多能细胞用于受试者中再生治疗的一个重大挑战是控制细胞生长和分化为受试者治疗所需的特定细胞类型。已有许多生长因子对ES细胞分化的影响的报道。例如，Schuldiner et al.报道了八种生长因子对细胞从hES细胞分化为不同细胞类型的影响(参见khuldiner et al. (2000)97 Proc Natl Acad Sci USA 11307-11312)。如其中所披露的，在开始通过胚状体样(embryoid body-like)形成的分化后，在bFGF、TGFPI、 活化素-A、BMP-4、HGF、EGF、PNGF、或视黄酸的存在下培养细胞。每种生长因子对分化途径具有独特的影响，但是没有生长因子排他地指导分化为一种细胞类型。理想地，能够从受试者分离和纯化干细胞和/或前体细胞是有益的，所述细胞能够在被再引入受试者用于治疗目的之前被纯化和/或体外处理。受试者的自身细胞的应用将消除采用辅助免疫抑制治疗的需要，由此维持受试者免疫系统的能力。然而，用于分离ES 细胞系，尤其是hES细胞系的目前的策略排除了从受试者分离细胞并将它们再引入相同的受试者。因此，对于来自成年动物的其它干细胞类型的研究在继续。例如，间充质干细胞(MSC)是一种这样的细胞类型。已经显示MSC具有分化为包括骨(Haynesworth et al. (1992) 13 Bone 81-88)、软骨(Mackay et al. (1998)4 Tissue Eng 415-28 ；Yoo et al. (1998)80 J Bone Joint Surg Am 1745-57)、脂肪组织(Pittenger et al. (2000)251 Curr Top Microbiol Immunol-11)、腱(Young et al. (1998)16 J Orthop Res 406-13)、肌肉及基质(Caplan et al. (2001)7 Trends Mol Med 259-64)的多个谱系的潜能。另一细胞群，多能成年祖细胞(MAPC)也已经从骨髓纯化(BM ；Reyes et al. (2001)98 Blood 25 261 5-2625 ；Reyes & Vetfaillie 0001) 938 Ann NY Acad Sci 231-23 。这些细胞已经显示能够在体外扩展为超过100次的群体倍增(100 population doubling)而没有端粒缩短或核型异常的发生。已经显示MAPC在限定的培养条件下能够分化为各种间充质细胞30类型(如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞及骨骼成肌细胞)、内皮、神经外胚层细胞、以及更最近的，分化为肝细胞(Sctiwartz et al. (2000) 109 J Clin Invest 1291-130 。此外，已报道造血干细胞(HSC)能够分化为多种细胞类型。已报道BM造血干细胞能够“转分化(transdifferentiate) ” 为表达早期心(Orlic et al. (2003)7 Pediatr Transplant 86-88 ；Makino et al. (1999) 103 J Clin Invest 697-705)、骨骼肌(Labarge & BlaiK2002) 111 Cell 589-601 ；Corti et al. (2002)277 Exp Cell Res 74-85)、神经(&inchez-Ramos^002)69 Neurosci Res 880-893)、肝(Petersen et al. (1999)284 Science 1168-1170)、或胰腺细胞(lanus et al. (2003) 111 J Clin Invest 843-850 ；Lee & Stoffel (2003) 111 J Clin Invest 799-801)标记物的细胞。在人类体内实验中还表明 CD34+外周血(PB)干细胞的移植导致供体-来源的肝细胞(Korbling et al. (2002)346 N Engl J Med 738-746)、上皮细胞(Korbling et al. (2002)346 N Engl J Med 738-746)、和神经元(Hao et al. (2003) 12 J Hematother Stem Cell Res 23-32)的出现。此外，已显示人类BM-来源的细胞有助于梗塞的心肌的再生(Stamm et al. (2003)361 Lancet 45-46)。这些报道已经被解释为成年干细胞的转分化或可塑性现象存在的证据。然而， 成年组织特异性干细胞的转分化的概念目前在科学和医药界内是广泛争议的主题(参见，如，Lemischka (2002) 30 Exp Hematol 848-852 ；Holden & Vogel (2002) 296 Science 2U6-2129)。试图再生的研究结果表明借助神经干细胞的转分化是不成功的(Castro et al. (2002)297 Science 1299)。还显示肌肉组织中发现的造血干/祖细胞(HSPC)起源于 BM(Mckinney-Freeman et al. (2002)99 Proc Natl Acad Sci USA 1341-1346 ；Geiger et al. 100 Blood 721-723 ；Kawada & Ogawa(2001)98 Blood 2008-2013)。此外，借助涉及单独的HPC移植入致命照射的小鼠的嵌合动物的研究表明循环HPSC和/或它们的子代的转分化和/或可塑性(如果其确定存在)是极稀有的事件(Wagers et al. (2002)297 Science 2256-2259)。因此，持续存在产生适于多种应用(包括但不限于治疗多个器官和/或组织的损伤和/或疾病)的可移植细胞群的新方法的需要。发明概述本概述部分列出了当前披露的主题的几个实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变体和改变。本概述部分仅是许多和改变的实施方式的示例。提及的给定实施方式的一个或更多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以伴随或不伴随提及的特征而存在；同样地，那些特征可以应用到当前披露的主题的其它实施方式，不管在本概述部分中是否列出。为了避免过多重复，本概述部分没有列出或建议这样的特征的所有可能组合。当前披露的主题提供了用于从非常小的胚胎样(VSEL)干细胞或其衍生物的群体形成胚状体样球体的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45_细胞群；以及(b)在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中培养VSEL干细胞或其衍生物达足以使胚状体样球体形成的时间。在一些实施方式中，VSEL干细胞或其衍生物包含⑶34+/lin_/⑶45_或ka-1+/ IirT/⑶45_非常小的胚胎样(VSEL)干细胞。在一些实施方式中，VSEL干细胞的直径约为 3-4 μ m，表达SSEA-I、0ct-4、Rev-l、和Nanog的至少一种，具有由细胞质的窄缘围绕的大细胞核，并且具有开放型染色质(常染色质)。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45_细胞群从人或从小鼠分离。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞或其衍生物的 CD45—细胞群从人或小鼠中选自骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合的来源分离。在一些实施方式中，诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个生长因子包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2及其组合。在一些实施方式中，通过将VSEL 干细胞或其衍生物与C2C12细胞共培养将所述一个或更多个因子提供给VSEL干细胞或其衍生物。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括通过下述方法分离包含VSEL干细胞或其衍生物的CD45_细胞群，所述方法包括下述步骤(a)提供怀疑包含CD45_干细胞的初始细胞群；(b)将所述初始细胞群与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或特异的第二抗体接触，接触条件足以允许每个抗体与其在初始细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合；(c)选择为⑶34+或ka-Γ、并且⑶45_的细胞的第一亚群；(d)将所述细胞的第一亚群与对于一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触，接触条件足以允许每个抗体与其在细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合，所述标记物选自 CD45R/B220、Gr-l、TCRa β、TCR γ δ、CDllb 及 Ter-119 ； (e)从所述细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的抗体的至少一个的那些细胞；以及(f)收集为0034+/1^/^045_或 ka-r/lirT/⑶45_的细胞的第二亚群，由此分离⑶45_干细胞的亚群。在一些实施方式中， 每个抗体包含可检测的标记。在一些实施方式中，所述可检测的标记包括荧光标记或者可以通过包含荧光标记的试剂被检测的部分。在一些实施方式中，所述分离包括FACS分类 (sorting)。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离为C-met+、C-kit+、和/或 LIF-R+的那些细胞。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离表达选自SSEA-1、 Oct-4、Rex-I及Nanog的一个或更多个基因的那些细胞。在一些实施方式中，细胞群包括骨髓样品、脐带血样品、或外周血样品。在当前披露的主题的一些实施方式中，在用足以将包含VSEL干细胞的⑶45_干细胞从骨髓迁移到受试者的外周血的量的迁移剂处理受试者后，将所述细胞群从受试者的外周血分离。在一些实施方式中，所述迁移剂包括粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4 拮抗剂的至少一种。在一些实施方式中，CXCR4拮抗剂是T140肽。在一些实施方式中，所述受试者是小鼠。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括将干细胞的亚群与结合到CXCR4 的抗体接触以及从干细胞的亚群分离为CXCR4+的那些细胞。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离为CXCR4+和/或AC133+的那些细胞。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括选择为HLA_DR_、MHCI类_、⑶90_、 ⑶四―、⑶105—、或其组合的那些细胞。当前披露的主题还提供了包含多个非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的胚状体样球体。当前披露的主题还提供了包含本文披露的胚状体样球体的细胞培养物。在一些实施方式中，本文披露的胚状体样球体在包含诱导VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体形成的一个或更多个因子的培养基中提供。当前披露的主题还提供了将非常小的胚胎样(VSEL)干细胞分化为感兴趣的细胞类型的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞或其衍生物的胚状体样球体；以及(b)在包含分化诱导量的一个或更多个因子的培养基中培养胚状体样球体直到培养基中出现感兴趣的细胞类型，所述因子诱导VSEL干细胞或其衍生物分化为感兴趣的细胞类型。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型是神经元细胞或其衍生物。在一些实施方式中，神经元细胞或其衍生物选自少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞及神经元。在一些实施方式中，所述神经元细胞或其衍生物表达选自GFAP、巢蛋白、β III 微管蛋白、Oligl及01ig2的标记物。在一些实施方式中，所述培养持续至少约10天。在一些实施方式中，所述培养基包含约10ng/ml rhEGF、约20ng/ml FGF-2及约20ng/ml NGF0 在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为内胚层细胞或其衍生物。在一些实施方式中， 所述培养包括在包含活化素A的第一培养基中培养胚状体样球体；以及其后在包含N2补充物-A、B27补充物及约IOmM烟酰胺的第二培养基中培养胚状体样球体。在一些实施方式中， 在第一培养基中的培养持续约48小时。在一些实施方式中，在第二培养基中的培养持续至少约12天。在一些实施方式中，内胚层细胞或其衍生物表达选自Nkx6. 1、Pdxl及C-肽的标记物。在一些实施方式中，感兴趣的细胞类型为心肌细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述培养持续至少约15天。在一些实施方式中，所述培养基包含碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子及转化生长因子Dl的组合，数量足以造成胚状体样球体细胞的亚组分化为心肌细胞。在一些实施方式中，所述心肌细胞或其衍生物表达选自Nsx2. 5/Csx和 GATA-4的标记物。在当前披露的方法的一些实施方式中，所述胚状体样球体通过下述制备(a)提供包含VSEL干细胞的⑶45_细胞群；以及(b)在包含一个或更多个诱导VSEL细胞的胚状体样球体形成的因子的培养基中培养VSEL干细胞足以使胚状体样球体出现的时间。当前披露的主题还提供了包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的本文披露的分化的非常小的胚胎样(VSEL)干细胞的制剂。在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体或赋形剂用于人类中是可接受的。当前披露的主题还提供了用于治疗受试者中组织损伤的方法。在一些实施方式中，所述方法包括给予受试者一种组合物，该组合物包含在药学上可接受的载体中的多个分离的⑶45_干细胞，所述⑶45_干细胞包含VSEL干细胞，数量和经由的途径足以允许 ⑶45_干细胞群的至少一部分移植入(engraft)所述组织并且在其中分化，由此治疗损伤。 在一些实施方式中，所述损伤选自缺血性损伤、心肌梗塞及中风。在一些实施方式中，受试者为哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物选自人类和小鼠。在一些实施方式中， 包含VSEL干细胞的分离的CD45_干细胞从选自骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合的来源分
1 O在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分化分离的⑶45—干细胞以在给予受试者所述组合物之前产生预定的细胞类型。在一些实施方式中，所述预定的细胞类型选自神经细胞、内胚层细胞、心肌细胞及其衍生物。当前披露的主题还提供了用于产生嵌合动物的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将一个或更多个包含VSEL干细胞的CD45_干细胞群添加到胚胎，从而一个或更多个 CD45—干细胞发育为胚胎的一个或更多个细胞类型。在一些实施方式中，所述添加包括将一个或更多个CD45—干细胞注射入胚泡期胚胎的囊胚腔。在一些实施方式中，所述添加包括聚集(aggregating)包含VSEL干细胞的一个或更多个⑶45_干细胞与桑葚胚期胚胎。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括在加入一个或更多个包含VSEL干细胞的⑶45_干细胞后孕育胚胎至少直到出生，以提供嵌合动物。当前披露的主题还提供了从0045_干细胞群纯化非常小的胚胎样(VSEL)干细胞中感兴趣的细胞类型的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干细胞的⑶45_干细胞群；(b)鉴定表达VSEL干细胞的标记物的⑶45_干细胞的亚群；以及(c)纯化所述亚群。在一些实施方式中，所述群和所述亚群除了为⑶45_外，均为⑶34+/CXCR4+/ 1土11_或^^-171111_。在一些实施方式中，包含VSEL干细胞的CD45_干细胞群从选自骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合的来源分离。在一些实施方式中，感兴趣的细胞类型选自骨骼肌细胞、肠上皮细胞、胰腺细胞、内皮细胞、表皮细胞、黑色素细胞、神经元细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、胰腺细胞、内皮细胞、上皮细胞、视网膜色素细胞及内胚层细胞。 在一些实施方式中，所述标记物选自GFAP、巢蛋白、β III微管蛋白、Oligl、01ig2、Myf5, MyoD,成肌蛋白(Myogenin)、Nsx2. 5/Csx、GATA-4、甲胎蛋白(α -Fetoprotein)、CK19、 Nkx2-3、Tcf4、Nkx 6. l、Pdxl、VE-钙粘蛋白、Krt 2-5,Krt 2_6a、BNC、DCT、TYR 及 TRP。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为心肌细胞，所述标记物选自Nkx2. 5/Csx、GATA-4、 MEF2C。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为内皮细胞，所述标记物选自VEGFR2、 VE-钙粘蛋白、血管性血友病因子(von Willebrand factor)及TIE2。在一些实施方式中， 所述感兴趣的细胞类型为骨骼肌细胞，所述标记物选自Myf5、MyoD及成肌蛋白。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为肝细胞，所述标记物选自甲胎蛋白和CK19。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为神经细胞，所述标记物选自β III微管蛋白、Oligl、 01ig2、GFAP及巢蛋白。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为胰腺细胞，所述标记物选自Nkx6. 1和Pdxl。在一些实施方式中，所述感兴趣的细胞类型为黑色素细胞，所述标记物选自DCT、TYR及TRP。当前披露的主题还提供了用于鉴定胚状体样球体形成的诱导剂的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)从已知包含诱导剂的细胞制备包含多个cDNA克隆的cDNA文库；(b)用所述cDNA文库转化不包含所述诱导剂的多个细胞；(c)在足以造成VSEL干细胞或其衍生物形成胚状体样球体的条件下，在转化的多个细胞存在下，培养多个VSEL干细胞或其衍生物；(d)分离包含所述诱导剂的转化的细胞；(e)从转化的细胞回收cDNA克隆；以及(f)鉴定由回收的cDNA克隆编码的多肽，由此鉴定胚状体样球体形成的诱导剂。在一些实施方式中，已知包括诱导剂的细胞为C2C12细胞。在一些实施方式中，多个cDNA克隆包含位于克隆载体(cDNA克隆被插入其中)中cDNA克隆位点的至少一侧的侧翼的至少一个引物结合位点。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括利用杂交到位于cDNA克隆位点的两侧的侧翼的引物位点的引物扩增转化的细胞中存在的cDNA克隆。在一些实施方式中，所述鉴定是通过对cDNA克隆的测序。当前披露的主题还提供了从脐带血或其部分(fraction)分离包含VSEL干细胞的CD45—干细胞的亚群的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(a)将脐带血或其部分与对于CD45特异的第一抗体和对于CD34或特异的第二抗体接触，接触条件足以允许每个抗体与其在细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合；(b)选择为CD34+或 ka-Γ、并且为⑶45—的细胞的第一亚群；(c)将细胞的第一亚群与对于选自⑶45R/B220、 Gr-U TCRa β , TCR γ δ、⑶lib及Ter_119的一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体接触，接触条件足以允许每个抗体与其在细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合；(d)从细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的抗体的至少一个的那些细胞；以及(e)收集为⑶34+/lin7⑶45_或ka-l+/lin7⑶45_的细胞的第二亚群，由此分离包含 VSEL干细胞的⑶45_干细胞的亚群。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括在低渗溶液中孵育脐带血或其部分或所述任何亚群达到足以基本上裂解可能存在的所有红细胞(erythocyte)的时间。在一些实施方式中，当前披露的方法进一步包括分离对于CXCR4、 c-met、c-kit、或LIF-R的至少一种为阳性的那些细胞。因此，当前披露的主题的一个目的是提供新的干细胞群，以及制备和应用其的方法。这个目的和其它目的全部或部分通过当前披露的主题实现。
当前披露的主题的一个目的已经在上面陈述，其他目的将随着描述的继续以及结合下述实施例和附图而变得显而易见。根据一些实施方式，提供了源自人类的成人(adult)器官或组织细胞的非常小的胚胎样干细胞(VSEL)的富集群体，其中所述群体这样富集通过就 ⑶133+CXCR4+⑶34+LirTCD45-细胞来选择细胞以获得靶(target) VSEL的富集群体。在一些实施方式中，所述VSEL源自血液(例如，脐带血、外周血)。所述靶VSEL是Oct-4+、Nanog+ 和/或SSEA+。在一些实施方式中，所述靶VSEL在细胞核中表达Oct-4蛋白，并且在表面上表达SSEA抗原。在一些实施方式中，所述靶VSEL表达选自下列的原始生殖细胞(PGC)标志物胎儿型碱性磷酸酶、OctA, SSEA-U CXCR4、Mvh、Stella、Fragilis, Nobox 和 Hdac6。 在一些实施方式中，可以通过就大小为2至6μπι或大小为2至4μπι的细胞进行选择而富集VSEL的富集群体。可以通过就含有原始的非结构化的(primitive unorganized)常染色质的细胞进行选择而富集VSEL的群体。优选地，在VSEL的富集群体中，至少25% (例如 30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% )的细胞是革巴VSEL。根据一些实施方式，提供了产生细胞群体的方法，所述细胞群体就来自人类血液(例如，脐带血、外周血)的靶非常小的胚胎样干细胞(VSEL)进行了富集，包括裂解 (Iysing)血液以除掉红细胞和制备LinTD45_CD133+细胞的富集群体。根据一些实施方式，提供了产生细胞群体的方法，所述细胞群体就来自人类血液 (例如，脐带血、外周血)的靶非常小的胚胎样干细胞(VSEL)进行了富集，包括i)裂解血液以除掉红细胞；ii)制备⑶133+细胞的富集群体；和iii)制备LinTD45_CD133+的富集群体。可以通过使用免疫磁珠就CD133+细胞富集VSEL的群体。可以通过荧光激活的细胞分选就LinTD45_CD133+细胞富集VSEL的群体。在一些实施方式中，可以在低渗的氯化铵溶液中裂解血液以除掉红细胞。


图IA 和 IB 描绘了 Sca-l+/lin7CD45-和 Sca-l+/lin7CD45+ 细胞的透射电子显微镜(TEM)图像。图IA显示ka-r/lirT/⑶45_细胞较小并且测量的直径为3_4 μ m。它们具有由细胞质的窄缘围绕的较大细胞核。在超微水平上，细胞质的窄缘具有一些线粒体、分散的核糖体、内质网的小轮廓、以及一些囊泡。细胞核被包含在具有核孔的核膜内。染色质松散地压缩并由常染色质构成。图IB显示与之相反，Sca-Γ/lirT/⑶45+细胞表现为异源形态并且较大。它们的平均测量直径为8-10 μ m，并具有分散的染色质和突出的核仁。图2描绘了荧光显微图像，描绘了对^^-171化7⑶45_细胞的表达研究的结果并表明Sca-l+/lin7CD45_细胞是SSEA-Γ并表达0ct_4和Nanog。如左侧所示，通过FACS分离的ka-l7lin_/CD45_细胞被评估SSEA-1、Oct-4及Nanog的表达。所有的图像在Plan Apo 60XA/1. 40 油性物镜(Nikon，Japan)下采集。右侧示出了在 ADOBE PHOTOSHOP CS 软件(Adobe System Incorporated, San Jose, California, United States of America) 中进行的代表性细胞(箭头)的IOx放大的图像。阴性染色对照未示出。对从四个独立类别分离的细胞进行染色。示出了代表性数据。
图3A-3C 描绘了对 ka-l+/lin7CD45-的 CXCR4、c-met 和 LIF-R 的表达研究的结果图3A描绘了 RT-PCR产物在其上分离并用溴化乙锭染色的凝胶的图像，并描绘了 Sca-l7lin7CD45"中对于 CXCR4 (泳道(lane) 1)、c_Met (泳道 3)和 LIF-R (泳道 5)的 mRNA 的表达结果。RT-PCR进行30个循环。阴性RT-PCR反应(DNA代替cDNA 泳道2、4和6)。 示出了来自三个独立的类别的代表性结果。图:3B描绘了通过FACS分离并通过免疫组织化学染色评估CXCR4、c-Met和LIF-R的表达的ka-r/lirT/⑶45_细胞的荧光显微图像(在 Plan Apo 60XA/1. 40油性物镜(Nikon, Japan)下采集图像)。未示出阴性染色对照。示出了来自四个独立的实验的代表性结果。图3C是描绘了通过包含SDF-I或不包含SDF-I (阴性对照)的MATRIGEL 滴状物的ka-l+/lin7⑶45—细胞的化学引诱研究结果。示出了每 100 μ m的MATRIGEL 滴状物周长的化学引诱的ka-l+/lin7⑶45—细胞的数量。从三个独立的实验收集数据。*与对照MATRIGEL 相比ρ < 0. 00001。图4Α和4Β描绘了 FACS分类从不同年龄的动物分离的ka-l+/lin7CD45_细胞的结果。图4A是从源自3周大(上侧)和1岁大的小鼠(下侧)的BMMNC分类的细胞的 FACS点图。左侧描绘了鼠BMMNC的点图。作为ka-Γ/Ιin_ (中侧)的来自淋巴门(lymphoid gate)的细胞通过对于CD45表达的FACS进行分类(右侧)。进行三个独立的分类实验(对于每类8只小鼠的BM被收集)。示出了代表性类别。图4B是条形图，描绘了在通过FACS 分离来自3周大和1岁大的小鼠的ka-r/lin7⑶45_细胞中PSC和VSEL干细胞标记物的 mRNA的表达，并通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR进行比较。进行四个独立的分类实验(对于每类收集8只小鼠的BM)。数据是平均数士SD。*p<0.01 vs.来自年老动物的细胞。图5是条形图，描绘了来自具有相对长的生命期的小鼠品系(C57BL/6)的细胞数量与具有相对短的生命期的小鼠品系(DBA/2J)的细胞数量的比较结果。所述图示出了与 C57BL/6小鼠相比，DBAAJ小鼠中ka-l+/lin7CD45_细胞的数量减少。通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR比较通过FACS从三周大DBA/2J和C57BL/6小鼠分离的ka-l+/lin7 ⑶45—细胞中PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA的表达。进行三个独立的分类实验(对于每类6只小鼠的BM被收集)。数据是平均数士 SD。*p<0.01vs.来自年老DBA/2J小鼠的细胞。图6A和6B描绘了骨髓单核细胞(BMMNC)的侧群(SP)的分类。图6A是描绘BMMNC的SP的FACS分类的点图。图6B是条形图，描绘了通过FACS 从 3 周大的小鼠分离的 BMMNC、SP、SP Sca-l+/lin7CD45\ SP Sca-Γ/1 irT/CD45+、Sca-1+/ lin_/CD45_和Sca-Γ/1 in7CD45+细胞中的PSC和VSEL干细胞标记物的mRNA的表达，并通过相同数量的分类细胞之间的RQ-PCR进行比较。进行三个独立的分类实验(对于每类，8 只小鼠的BM被收集)。数据以平均数士 SD表示。、<0.01 vs.来自年老动物的细胞。图7是四个点图，描绘了细胞的多个亚群的移植结果和这些细胞对长期血细胞生成的贡献。Sca-r/lin7⑶45—细胞对长期血细胞生成没有贡献。Ly5. 2小鼠被移植以来自 Ly5. 1 小鼠的 IO4 个 Sca-l+/lin7CD45+或 2X104 个 Sca-l+/lin7CD45-细胞，并且与 IO6 个 BMMNC Ly5. 2细胞一起移植入Ly5. 2受体小鼠，在移植后8个月通过FACS评估Ly5. 1细胞的存在。上侧描绘了来自外周血的MNC的分析。下侧描绘了来自骨髓的MNC的分析。示出了代表性结果。图8A和8B描绘了荧光显微图像，描绘了具有对于SSEA-I (图8A ;4个图板)或 0ct-4(图8B)特异的抗体的ka-l7lin_/CD45_BM细胞的ES样球体的染色。图9A和9B描绘了在C2C12细胞上的GFP、ca-l+/lin7CD45-BM细胞的胚状体样球体的形成。图9A描绘了在实施例20所述的条件下，共培养^^-171^1_/⑶45_BM细胞与 C2C12细胞后胚状体(EB)-样球体的显微图像。图9B是描绘ka-l+/lin7⑶45_细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达的荧光显微图像，表明这些胚状体源自从绿色免疫荧光阳性(GFP+) 小鼠(购自 The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, United States of Americ 的 C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP) lOsb/J 小鼠)分离的纯化 ka-l+/lin7CD45TM 细胞，并且不是 C2C12细胞。图10是从鼠淋巴结分离的碘化丙啶(propidium iodide)染色的细胞、HSC(造血干细胞；Sca-l+/lin7CD45+)或 VSEL 干细胞(Sca-l7lin_/CD45_)的一系列点图。图11A-11G是鼠骨髓细胞的FACS分析的系列点图。图IlA是低渗裂解后鼠骨髓MNC的点图。图IlB是示出了来自Rl门(R1 gate) 用于谱系标记物表达和⑶45抗原的细胞的染色的点图。在这个图中，R2示出了谱系-和 CD45阴性BM MNC0分析来自Rl和R2的细胞的Sca-I的表达和HLA_DR(参见图11C)、MHC I类(参见图11D)、^四(参见图11E)、⑶90(参见图11F)及⑶105(参见图11G)抗原的
共表达。图12是来自VSEL干细胞衍生的球体(VSEL-DS)的碘化丙啶染色的细胞的系列点图。示出了三个独立的代表性实施例。图13描绘了对从D3胚胎干细胞(ED-D3 ；顶侧)形成的胚状体和从VSEL干细胞 (底侧)形成的胚状体样球体进行碱性磷酸酶(AP)染色的图。图14描绘了荧光显微图像，表明VSEL干细胞衍生的胚状体样球体表达早期胚胎发育标记物如 SSEA-I、GATA-6、GATA-4、F0XD1 及 Nanog。图15描绘了在VSEL干细胞衍生的胚状体样球体中存在的细胞的透射电子显微镜图，表明这些细胞在尺寸上大于它们来源的初始VSEL干细胞(图15，上侧)，但仍具有非常原始的包含常染色质的细胞核。图15的中侧描绘了在用SDF-I、HGF/SF及LIF刺激从VSEL 干细胞-衍生的胚状体样球体分离的细胞后MAPKp42/44的磷酸化研究结果，表明相应的受体(分别为SDF-1、HGF/SF及LIF)在这些细胞的表面表达。并且最后，图15的下侧描绘了从来自VSEL干细胞衍生的胚状体样球体的细胞的连续传代分离的细胞的RT-PCR分析结果，其揭示了调节胚状体的原肠胚形成的基因GnGATA-6、CdX2、SOX2、HNF3&AFP) WmRNA 的表达增加。图16A-16C和图17A-17D描绘了荧光显微镜图像，描绘了 ES样球体分化为少突胶质细胞(图16A-16C)或神经元(图17A-17D)。细胞用针对巢蛋白的抗体染色，其利用 Alexa Fluor 594-标记的山羊抗-小鼠IgG第二抗体检测，其给予红色荧光。用抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor 488结合物检测细胞中存在的GFP (绿色荧光)，并且细胞核用DAPI 染色(蓝色荧光)。
图18A-18C描绘了荧光显微镜图像，描绘了 ES样球体分化为表达胰腺细胞的标记物(C-肽)的内胚层细胞。图19A-19C和20A-20D描绘了荧光显微图像，描绘了 ES样球体分化为心肌细胞。 这些细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)，表明心肌细胞源于由GFP+Sca-Γ/lirT/⑶45—BM细胞形成的胚状体。细胞用针对肌钙蛋白I或α横纹肌辅肌动蛋白的抗体染色(分别为图19和 20)，其利用Alexa Fluor 594-结合的第二抗体检测，其给予红色荧光。用抗-绿色荧光蛋白Alexa Fluor 488结合物检测细胞中存在的GFP (绿色荧光)，细胞核用DAPI染色(蓝色荧光)。图21A-21C描绘了对来自单VSEL干细胞衍生的球体的细胞进行RT-PCR的结果， 其表明这些细胞可以分化为心肌细胞(中胚层；参见图21Α)、神经细胞和少突胶质细胞 (外胚层；参见图21Β)及胰腺或肝细胞(内胚层；参见图21C)。图22Α-22Ι描绘了表明培养的细胞中心脏-特异性抗原的表达的免疫荧光和透射共聚焦显微镜照片。图22A-22C和22D-22F描绘了其中Sca-l+/lin7CD45TMMNC被培养的培养板的图像。具有ka-r/lin7⑶45—细胞的板中的许多细胞对于心脏-特异的肌球蛋白重链是阳性的(图22B、22C、22E及22F;绿色荧光)。这些心脏-特异性肌球蛋白重链-阳性的细胞中的许多对于心脏肌钙蛋白I也是阳性的(图22D和22F[箭头]；红色荧光)。图22G-22I 是其中Sca-r/lirT/⑶45+细胞被培养的培养板的图像。这些细胞对于前述心脏-特异性抗原的表达基本上是阴性的(参见图22H)。通过DAPI染色鉴定图22A-22I中的每个的细胞核(蓝色荧光)。比例尺=20 μ m。图23描绘了 ka-r/lin7⑶45_细胞的FACS分类结果，表明能够被分类的这些细胞的产量随着供体动物的年龄而降低。图M是描绘作为年龄的函数的小鼠骨髓中存在的VSEL干细胞(左侧)和HSC (右侧)的百分数的两幅图。图25是两幅图，描绘了从较老的小鼠分离的VSEL干细胞形成胚状体样球体的能力下降(左侧)以及根据小鼠(细胞从其分离)的年龄的VSEL干细胞的培养物中CD45+细胞的百分数增加(右侧)。图沈为从5周大的小鼠(左侧)与2.5岁大的小鼠(右侧)分离的VSEL干细胞的不同表达模式。在左侧中，示出了免疫荧光和透射共聚焦显微镜图像，表明来自5周大的小鼠的培养的细胞中不同造血抗原的表达。在右侧中，示出了在从2. 5岁大的小鼠分离的 VSEL干细胞中，CD45被表达并且所述细胞能够在甲基纤维素培养基中的第二培养基中生长造血集落。图27A-27B描绘了人类脐带血的FACS分类结果。图 27A 示出了 人类 CB 包含表达 CXCR4 (0. 037 士 0. 02 %，η = 9)、 CD34(0. 118士0. 028%,η = 5)及 CD133(0. 018士0. 008%,η = 5)的 lin7CD4511NC 群。图 27B 表明这些 CXCR47CD133+/CD;M7lin7CD45-细胞非常小(约 3-5 μ m ；图 27B，上侧)，而 CB-来源的lin7CD45+造血细胞较大(> 6 μ m ；图27B,下侧)。图^A_28C描绘了对来自人类脐带血的分类的细胞的基因表达研究结果。图28A和286是条形图，显示通过FACS分类的CB-来源的CXCR4+/CD133+/0^4+/lin7CD45"细胞、以及 C)(CR47lin7CD45\CD347lin7CD45\ 以及 CD133+/lin7CD457 细胞高度富集由多能胚胎细胞表达的转录因子如Oct-4和Nanog的mRNA。图28C示出了确认 FACS分析的RT-PCR结果。图四描绘了 CB-VSEL干细胞的免疫荧光染色结果，表明高度纯化的CB-来源的 CXCR4+/lin_/CD45_细胞在它们的表面上表达SSEA-4并且在细胞核内表达0ct_4和Nanog 转录因子。图30描绘了三种不同的CB-VSEL干细胞的光学显微图片，表明这些细胞非常小 3-5 μ m,并包含相对大的细胞核和具有许多线粒体的细胞质的窄缘。这些细胞的细胞核中的DNA包含作为多能胚胎干细胞的特征的开放型常染色质。图31A-31C描绘了光学显微图片，表明来源于GFP+小鼠的VSEL干细胞-DS如果被平铺在补充有IL-3+GM-CSF的甲基纤维素培养基中可以形成小的第二球体(图31A和 31B)。通过从初始甲基纤维素培养基的甲基纤维素溶解回收的这些第二球体制备的单细胞悬浮液，如果再次平铺在甲基纤维素培养基(图31B)或血浆凝块(图31C)中并由IL-3和 GM-CSF刺激，形成造血集落。这些为造血集落的证据通过FACS分析来自甲基纤维素中生长的溶解集落的细胞的CD45表达或通过免疫荧光染色来自血浆凝块培养基中生长的集落的细胞的⑶45而获得。图32是用于从人类脐带血分离VSEL干细胞的基于FACS的策略的略图。图33.流式细胞术分离源自骨髓的ka-l+/Lin-/CD45+造血干细胞和
Lin-/⑶45-VSEL。代表性的点图显示了来自淋巴门(A)(基于Sca-I (FITC)和谱系标记物 (PE) (C)以及⑶45 (APC)的表达)的小细胞的分类。图板D显示了区域3(R3)含有 Lin-/CD45-VSEL而区域4(R4)含有ka_l+/lin-/CD45+细胞。通过将BMC的分类与具有已知直径的珠子的分类作比较，图板B中的FSC轴确认了图板A中的感兴趣区域中的细胞的非常小的尺寸(2-10μ)。如(R3)所示，总BMC中只有0.02%是VSEL。FSC，前向分散特征；SSC，侧向分散特征。图34.心肌梗塞尺寸。从小组I-III中的Masson三色染色心脏检测的心机梗塞面积分数([梗塞面积/LV面积]xlOO)，三个小组分别经载体、⑶45+造血干细胞和VSEL处理。〇，个体小鼠； ，平均数士 SEM。图35.超声心动描记术检测LV的功能。冠状动脉闭塞/重灌注后35天以载体处理(Α、B)、CD45+细胞处理(C、D)和VSEL处理(Ε、F)的小鼠的代表性的二维(Α、C、Ε)和 M-模式(B、D、F)图像。箭头代表梗塞壁(A、C、E)。与载体处理和⑶45+细胞处理的心脏相比，VSEL处理的心脏显示出较小的LV腔，较厚的梗塞壁和改善的梗塞壁运动。图板G-J证明VSEL的移植改善了 MI之后35天LV心脏收缩功能的超声心动描记术检测。数据为平均数 士SEM。η = 11-14 只小鼠 / 组。*Ρ < 0. 05 vs.第；35 天时的小组 II ;#P < 0. 05 vs.第 35天时的小组I ； §P < 0. 05 vs.各个小组在96小时之时的数值。图36. LV重塑的形态测量学检测。来自于载体处理(A)、⑶45+造血干细胞处理 ⑶和VSEL处理(C)的心脏的代表性Masson三色染色心肌部分。分别以蓝色和红色鉴别出结痂组织和有活力的(viable)心肌层。注意在VSEL处理的心脏中LV腔较小，梗塞壁较厚。图板D-H显示了 LV结构参数的形态测量学检测。数据为平均数士SEM。η = 11-14 只小鼠/组。< 0. 05 vs.小组II。
图37.心肌细胞和左心室肥大的检测。图板A-C显示了来自Masson三色染色的经载体处理(A)、⑶45+造血干细胞处理(B)和VSEL处理(C)的心脏的有活力的心肌层中的心肌细胞的代表性图像。比例尺=50pm。与⑶45+造血干细胞处理的心脏不同，VSEL处理的心脏未显示出增加的肌细胞剖面面积(与非梗塞对照心脏(D)相比)。超声心动描记术估计的LV质量在VSEL处理的心脏(E)中显著较低。数据为平均数士SEM。η = 11-14 只小鼠 / 组。D 乍 < 0. 05 vs.小组 II ;#P < 0. 05 vs.对照；E :*P < 0. 05 vs.小组 II 和 IIK最终的);#P < 0. 05 vs各个基线值。图38. VSEL移植和心肌细胞再生。通过EGFP (B、D，绿色)和α -横纹肌 (sarcomeric)辅肌动蛋白(C、D，红色)分别鉴别VSEL和肌细胞；图板D显示了合并区域。 显示了对EGFP(箭头，B，绿色)和α-横纹肌辅肌动蛋白(箭头，C，红色)均为阳性的两个肌细胞。细胞核以DAPI染色(A、D，蓝色)。比例尺=40μπι。图39.梗塞区域中的肌细胞面积分数的测定。图板A-C显示了 Masson三色染色的经载体处理(A)、⑶45+造血干细胞处理(B)和VSEL处理(C)的心脏的结痂的代表性例子。放大倍率x600。图板D中显示了定量数据。数据为平均数士 SEM。η= 11-14只小鼠 / 组。D:*P<0. 05 vs.小组 II。图40.外周血(PB)中循环的VSEL的流式细胞术分析。在急性MI之后M小时、 48小时和7天；在假性手术(假性对照)之后M小时；以及从未经处理的小鼠(对照)，收集PB样品。使用ka-Ι、谱系标记物和⑶45将PB白细胞(PBL)的全部群体染色。在点图中显示PBL，代表它们的前向(FSC)vs.侧向分散特征(SSC)，分别与细胞内容物的大小和粒度/复杂度相关。区域Rl(图板A)中包括了无粒的、小的(大小为2-10μπι)事件，其包括 VSEL群体。进一步分析来自区域Rl的细胞的Sca-I和谱系标记物(Lin)的表达，在区域 R2(图板B)中只包括^^-1+/1^11事件。然后基于⑶45的表达分析来自区域R2的细胞，将 ⑶45-和⑶45+亚群体显示于柱状图(图板C，分别为区域R3和R4)。百分率显示了每个亚群体在总PBL中所占的平均含量。根据FSC，图板D分别显示了区域R5和R6中Sca-I+/ Lin-/CD45-细胞(VSEL)和ka_l+/Lin-/CD45+细胞(HSC)的大小。红色圆圈代表每个亚群体中细胞的主要定位。图41.急性MI之后VSEL运动的时间过程。显示了 MI之后M小时、48小时和7 天，未处理的(对照)、假性操作(假性对照)和梗塞小鼠的每微升血液中循环的Sca-I+/ Lin-/⑶45-VSEL的绝对数目。图板A和B分别代表从6周龄和15周龄小鼠获得的数据。 绝对数目是基于VSEL占外周血中PBL和总白细胞计数的百分含量计算的。数据为平均数 + SEM0 ，平均数；〇，个体小鼠；*P < 0. 0025 vs.对照以及假性对照。图42.急性MI之后HSC运动的时间过程。图形显示了 MI之后M小时、48小时和 7天，未处理的(对照)、假性操作(假性对照)和梗塞小鼠的每微升血液中循环的Sca-I+/ Lin-/⑶45+HSC的绝对数目。图板A和B分别代表从6周龄和15周龄小鼠获得的数据。绝对数目是基于HSC占PBL和总白细胞计数的百分含量计算的。数据为平均数士 SEM。眷，平均数；〇，个体小鼠；乍< 0.0025 vs.各个年龄小组中的对照以及假性对照。图43.来自急性MI之后的6周龄和15周龄小鼠(分别为图板A和B)的源自外周血的细胞中多能标记物(Oct-4、Nanog、Rexl、Rifl、Dppal)和造血干细胞标记物Gcl) 的mRNA水平。将从每个实验小组的动物血液中收集的细胞汇集在一起以获得每个时间点的平均mRNA含量。对于所有的样品进行一式三份qRT-PCR。将mRNA含量的倍数增加与对照进行比较。基于三次反应计算平均值。数据显示为平均数士SEM。PSC，多能干细胞。图44.源自外周血(PB)的VSEL中的0ct_4的表达。MI之后M小时从PB分离的运动的VSEL(下端图板)和HSC(上端图板)的代表性的共焦显微镜图像。通过FACS分离ka-l+/Lin-/CD45-VSEL和ka_l+/Lin-/CD45+HSC然后进行免疫染色。上端图板显示了 ka-l+/Lin-/CD45+细胞(HSC)，其对于CD45 (FITC，绿色荧光，造血细胞标记物)是阳性的，对于0ct-4(TRITC，红色荧光)是阴性的。下端图板显示了 ka-l+/Lin-/CD45-细胞 (VSEL)，其对于CD45是阴性的，对于0ct-4(多能细胞标记物)是阳性的。细胞核以DAPI 染色(蓝色荧光)。Tr，透射图像。图45.实验方案。使用了三组WT小鼠(小组I-III，n = 11-14/组)。在基线超声波心动描记术四天之后，小鼠进行30分钟的冠状动脉闭塞，然后进行重灌注。MI之后48 小时，小鼠接受心肌内注射载体(小组I)、ka-l+/Lin-/⑶45+造血干细胞(小组II)或 ka-l+/Lin-/CD45-VSEL(小组III)。在细胞移植后48小时和MI之后35天重复超声波心动描记术。在MI之后35天，处死小鼠以进行形态测量学和组织学研究。图46. LV重塑的超声心动描记术检测。图板A和B显示了 LV尺寸的超声心动描记术测量。数据为平均数士SEM。η = 11-14只小鼠/组。图47.心肌毛细血管密度的定量测定。梗塞边界区域(A)和非缺血区域(B)中的心肌毛细血管密度。在载体处理的、⑶45+造血干细胞处理的和VSEL处理的心脏之间没有显著性差异。数据为平均数士 SEM。η= 11-14只小鼠/组。图48Α-Β.图板A-除掉RBC以获得TNC或丽C成分(fraction)的实验程序。通过FACS (荧光激活的细胞分选)对CB-VSEL进行计数。图板B-代表性的设门策略，以对 CB-VSEL和造血干细胞(HSC)进行流式细胞术分析和FACS分选。百分率显示了两种细胞成分中的CB-VSEL和HSC的平均含量(平均值士SEM)。图49.通过ImageMream系统获得的源自CB的VSEL和HSC的图像。每幅照片显示了细胞的亮视野图像，以7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色后的细胞核图像，以及与下列表面标志物的表达相关的图像:Lin (绿色)、⑶45(橙色)和CD133(AC133 ；黄色)。比例尺表示 10 μ m。图50A-B.图板A-相对于新鲜的CB样品，以两种RBC消除程序进行分离之后，从1 毫升CB获得的总细胞数目。图板B-可以从分离自1毫升CB的TNC (RBC裂解后)和MNC (以 Ficoll-Paque分离后)获得的CB-VSEL和HSC的绝对数目。数值显示为平均值士SEM(P < 0. 05 ；N = 5)。图51.通过ImageMream系统获得的CB-VSEL和HCS的形态学特征，包括大小和 N/C比率。细胞的大小计算为基于细胞的亮视野图像的较短细胞轴的长度，N/C比率显示为细胞质和细胞核面积之比，它们分别是基于亮视野和细胞核图像计算的。数字表示每个参数的平均值(平均值士SEM)。图52A-B.图板A和B显示了从CB单元(通过用于储存的常规程序制备并在其解冻之后)回收的CB-VSEL和HSC。数值表示从处理1毫升CB获得的两个群体的平均绝对数目(xl03)(平均值士SEM;N= 5 ；当与新鲜CB比较时，P <0.05)。置于柱形图内的百分率是存在于最初的新鲜CB样品中的CB-VSEL和HSC的最初数目的回收百分率。
图53A-D.图板A-D显示了 CD133+/Lin7CD45TB_VSEL的原始亚群的百分含量和形态学特征，所述亚群的特征在于共表达⑶34、Oct-4和SSEA-4抗原。数值表示通过 ImageStream系统从10次独立实验计算的平均数(平均值士SEM)。图由Imag必tream系统获得的CB-VSEL亚群的代表性图像。每幅照片显示了细胞的亮视野图像，以7-AAD染色后的细胞核图像，以及表面和核内标志物的表达。比例尺表示10 μ m。图55A-C. Annexin V (AnV)在CB-VSEL和HSC上的结合，这是由于RBC裂解过程中释放的微囊泡转移磷脂酰丝氨酸。图板A-在RBC裂解之前和之后，CB-VSEL和HSC中的 AnV+细胞的含量。图板B-在RBC裂解之前和之后，AnV+细胞成分中血型糖蛋白A+ (GlyA+) 细胞的含量。图板C-RBC裂解之后分选的⑶34+/AnV+/GlyA+的纯化的成分的集落生成潜力与通过FicolI-Paque分离的⑶34+细胞的对比。数字代表平均值(平均值士 SEM)。图56A-G.通过FACS分选源自人类UCB衍生的VSEL的设门策略。通过FACS从人类UCB有核细胞(UCB-nucleated cells)的总成分(TNC)中分离UCB-VSEL。图板A 标准直径为1、2、4、6、10和15 μ m的预先确定大小的珠子颗粒。区域R2包括直径介于2 μ m的所有物体。图板B:通过显示FSC vs. SSC信号的点图显示源自UCB的TNC。图板C和D 来自区域Rl的细胞，分别就造血Lin标志物表达以及它们的存活性(通过7-AAD)对其进行分析。图板E 基于⑶34和⑶45抗原表达显示源自包括区域R2和R3的门的LirT存活事件。 包括并从区域R4分选CD133+/Lin7CD45XB-VSEL的群体。图板F 新鲜分选的UCB-VSEL的纯度和存活性分析。图板G 固定并以7-AAD重新染色细胞之后，分选的UCB-VSEL成分中的有核细胞的含量分析。在区域R6中显示了 7-AAD+有核的UCB-VSEL。百分率显示了总 UCB-有核细胞中指明的细胞亚群的平均含量。图57A-D.通过ISS获得的UCB-VSEL和HSPC的代表性图像。图中显示了 UCB-VSEL 及其造血对应物的形态学特征的比较，包括它们的大小和标志物表达。图板A 用作大小标志物的预先确定大小的珠子的亮视野图像。图板B、C和D分别是表达⑶34、⑶133+和 CXCR4抗原的UCB-VSEL和HSPC的多通道图像。每幅照片显示了细胞的亮视野图像，与指明的表面标志物的表达相关的荧光图像，以及以7-AAD染色后的细胞核图像。在每个图板中， 造血Lin标志物和CD45的表达分别显示为绿色(Lin ；FITC)和橙色(PE)，而⑶34、CD133 或CXCR4的表达显示为黄色(PE-C0)。所有的图像均以相同的放大倍数显示。比例尺表示ΙΟμπι。数值反映了每个群体的平均大小(平均值士 SEM)，其由IDEAS软件根据较短的细胞轴的长度计算。图58A-F. UCB-VSEL的原始亚群的含量和形态学的ISS分析。图板A-D显示了 ISS 中UCB-VSEL的含量的分析。在分析之前将细胞固定并以7-AAD染色。图板A 根据形态学参数(包括细胞核的面积和亮视野的长宽比)显示所分析的物体。基于亮视野计算长宽比， 其为较短的细胞轴(宽度)与较长的轴(高度)之比。圆的、非长形的细胞具有接近1.0 的长宽比，而长形的细胞或细胞块(clumps)具有较低的长宽比。包括了圆的、含有DNA的单个细胞以进行进一步分析(区域Rl)。图板B 基于CD45和造血Lin标志物的表达在直方图中显示来自区域Rl的物体。在区域R2中包括LirT/⑶45_的物体。图板C:根据0ct_4 的核内表达和⑶133抗原的表面表达分析来自区域R2的非造血成分。在区域R3中包括了具有两种标志物的共表达的物体，其代表UCB-VSEL含量。图板D 根据由IDEAS软件计算的大小(计算为较短的细胞轴的长度)显示来自区域R3的UCB-VSEL。在点图中标出了 UCB-VSEL中的小于6和8 μ m的细胞的平均含量。所有图板上的百分率表示每个区域中指明的成分占总UCB细胞的含量(平均值士 SEM)。图板E-F 表格和图形显示了 UCB-VSEL亚群(根据表面存在CD34和SSEA-4抗原以及0ct_4的细胞核表达来区分)的含量和形态学特征，例如大小、N/C比率和小于6μπι的细胞的含量。平均值表示为平均值士SEM。代表性图像显示了共表达⑶133和Oct-4抗原的细胞。图59A-E. RBC裂解和在Ficoll-Paque上离心后获得的细胞成分中的UCB-VSEL和 HSPC回收和基因表达的分析。图板A-B分别是以IxBD WmrmLyse缓冲液裂解RBC后获得的TNC成分和Ficoll-Paque分离后获得的MNC的成分中UCB-VSEL的含量分析。两个细胞成分均就Lin标志物(FITC)、⑶45 (PE)以及原始SC的标志物之一，例如⑶34、⑶133 或CXCR4(APC)进行染色。图板A和B显示了根据CD45和指明的原始细胞标志物的表达而源自两种细胞成分的Lin-细胞。区域R5中显示了 UCB-VSEL，区域R4中显示了其造血对应物。百分率表示每个成分的细胞中的亚群的平均含量(平均值士SEM)。图板C-D:通过在低渗溶液中裂解RBC或通过在Ficoll-Paque梯度上离心而从1毫升UCB中分离的 UCB-VSEL和HSPC的绝对数目。数值表示来自5次独立实验的平均数(平均值士 SEM)。相对于在裂解RBC后获得的TNC，P < 0. 05被认为是统计学上显著的(#)。图板E 裂解RBC 和在Ficoll-Paque上离心后分别获得的TNC和MNC成分中与多能性相关的基因(0ct_4和 Nanog)和与组织定向相关的基因(Nkx2. 5/Csx、GATA-4和VE-钙粘蛋白)的表达。数据显示为所分析的成分与总CB细胞之间的平均(平均值士SEM)倍数差异。与总的未纯化的 UCB细胞相比，P < 0. 05被认为是统计学上显著的O。图60A-B.以用于临床应用的AXP AutoXpress平台处理UCB单元之后的 UCB-VSEL和HSPC的回收。图板A 可以从1毫升UCB中回收的总的⑶34+细胞以及具有 ⑶34表达的UCB-VSEL和HSPC的绝对数目。在下列新鲜的和经处理的UCB样品中分析回收情况i)完全未经处理的UCB (灰色条柱)；ii)体积耗竭(volume depletion)之后获得的 UCB的新鲜浓缩物(黑色条柱)；和iii)经历冷冻/解冻程序之后的UCB的浓缩物(阴影条柱)。平均值表示为平均值士 SEM。与完全未经处理的UCB相比，P<0. 05被认为是统计学上显著的O。图板B:在每个UCB处理步骤中从1毫升UCB中回收的表达⑶133抗原的 HSPC的绝对数目的类似分析。平均值表示为平均值士SEM。与完全未经处理的UCB相比， P < 0. 05被认为是统计学上显著的O。图61A-B.以多种策略处理UCB之后的UCB-VSEL和HSPC的回收。图板A 从1毫升完全/未经处理的UCB (白色条柱)以及从1毫升经过以下处理的UCB回收的UCB-VSEL的绝对数目:i)裂解RBC(灰色条柱)；ii)在Ficoll-Paque梯度上离心(阴影条柱)；和iii) 双步骤处理，包括⑶133+的免疫磁性分离，然后进行FACS。图板B 从1毫升UCB (按照对于UCB-VSEL回收的描述进行处理)回收的HSC的绝对数目。平均值表示为平均值士SEM。 与完全未经处理的UCB相比，P < 0. 05被认为是统计学上显著的O。图62.通过ISS获得的代表多能性UCB-VSEL亚群的细胞的图像。图中显示了表达CD34抗原和多能性标志物Oct-4和SSEA-4的UCB-VSEL的代表性图像。每幅照片由亮视野图像和与细胞核图像(7-AAD ；红色)和Lin标志物和⑶45 (FITC ；绿色)、Oct-4或 SSEA-4(PE ；黄色)和CD34或CD133(PE，黄色或PE-Cy5，红紫色)的表达(如每幅照片上所示)相关的单独的荧光图像组成。组合照片显示了细胞核(7-AAD)和指明的标志物的复合。数值显示了所示细胞的直径。比例尺表示10 μ m。图63A-B.含有UCB-VSEL的UCB亚群的绝对数目。图板A 表达CD34、CD133和 CXCR4抗原的UCB的非造血成分的含量，其富含UCB-VSEL。图板B 表达⑶34抗原以及PSC 的标志物(Oct-4和SSEA-4)的UCB-VSEL的亚群的含量。数值表示可以从1毫升UCB中分离的细胞的平均绝对数目(平均值士SEM)。图64A-D.通过FACS分选VSEL的设门策略。通过FACS从免疫荧光染色的鼠BM有核细胞分离源自BM的VSEL。图板A 与具有1、2、4、6、10和15 μ m的标准直径的6种大小不同的珠子颗粒(Flow Cytometry Size beads, Invitrogen ；Molecular Probes, Carlsbad, Calif.，USA)比较之后，在门Rl中包括了介于2-10μπι的无颗粒的(agranular)小的事件。 图板B 通过显示正向分散(FSC)相对于侧向分散(SSC)信号(它们分别与细胞的大小和粒度/复杂性相关)的点图显示BM有核细胞。图板Dj^ka-l和Lin的表达进一步分析来自区域Rl的细胞，仅将ka-r/LirT的事件包括在区域R2中。基于⑶45标志物的表达， 进一步将来自区域R2的群体分选进入CD45_和CD45+亚群，显示于直方图中(图板C，分别为区域R3和R4)。Sca-l+/Lin7CD45-细胞(VSEL)分选为包括在包含区域RU R2和R3的逻辑门中的事件，而ka-l7Lin/⑶45+细胞(HSC)来自包括区域R1、R2和R4的门。百分率显示了总的BM有核细胞中每个细胞亚群的平均含量(士 SEM)。图65A-D.源自胸腺的VSEL的ImageMream系统分析。图中显示了就ka_l、CD45 和造血谱系标志物(Lin)染色之后，从胸腺分离的细胞的完整群体的分析。图板A显示了根据形态学参数(包括细胞核的面积和亮视野的长宽比)所获取的所有物体。基于每个细胞的亮视野图像计算长宽比，其为较短的细胞轴(宽度)与较长的轴(高度)的比。圆的、 非长形的(non-elongated)细胞具有接近1. 0的长宽比，而长形的细胞或细胞块具有小于 1.0的长宽比。在区域Rl中包括了圆的、含有DNA的单个细胞以进行进一步分析。随后，基于Lin(图板B)和CD45(图板D)的表达在直方图中显示来自区域Rl的物体。来自包括区域R2和R3的逻辑门的LirT/⑶45_物体显示于点图中，其中显示了它们的侧向分散特征和 Sca-I 表达(图板 C)。区域 R4 中包括了 Sca-l+/Lin7CD45_ 细胞。Sca-l+/Lin7CD45_ 细胞在源自胸腺的总细胞中的百分含量显示为平均值士SEM。图66A-B.通过ISS获得的鼠VSEL、HSC、红细胞和血小板之间的形态学比较。图板 A显示了就Sca-1(FITC，绿色)、Lin(PE，橙色)和CD45 (PE_Cy5，红紫色)染色的鼠VSEL以及就Ter 119 (PE，橙色)和⑶41 (FITC，绿色)染色的源自血液的红细胞和血小板。在固定之后，所有的样品以7-AAD(红色)进行染色以显示细胞核。红细胞和血小板没有细胞核， 而VSEL显示出含有细胞核的细胞结构。显示了每个群体的平均大小(平均值士SEM)。比例尺表示10 μ m。图板B显示了当与相同级别的大小预先确定的珠子相比较时，来自所有3 个群体的细胞(VSEL、RBC和血小板)。图67A-D.以Imag必tream系统检测到的人工假象。图板A显示了就ka-Ι染色为阳性的正常的有核的Lin7CD45_细胞。在下面的图板上显示了假“阳性”的人工假象的选择的图像(图板B)，被破坏的、降解的细胞(图板C)和细胞碎片(图板D)。每幅照片显示了亮视野图像以及与细胞核图像(7-AAD;红色)和^^-1尔11^;绿色)、1^11肿；橙色) 和⑶45 (PE-Cy5 ；黄色)的表达相关的单独的荧光图像。比例尺表示10 μ m。
图68.通过ISS在鼠组织中分析的0ct-4+/Sca-l7Lin7⑶45_细胞的图像。图中显示了在骨髓、肺、脑、肾、胰腺和骨骼肌检测的此类细胞的代表性图像。就多能性标志物 0ct-4(FITC ；绿色)、CD45和Lin(PE ；橙色)以及Sca-I (PECy5 ；红紫色)染色分离自器官的细胞。以7-AAD(红色)染色细胞以显示细胞核，并通过ISS分析以检测Oct-4的核内表达，如在放大的组合的图像中所示。比例尺表示10 μ m。图69A-B.存在于鼠器官中的0ct-47Sca-r/Lin7⑶45_细胞的绝对数目。图板 A显示了通过使用由ISS获得的百分含量和分离自每种器官的总细胞数而计算的每个器官中Oct-4+VSEL的含量[xl03]。数值表示为平均值士SEM。图板B显示了所分析的所有器官中Oct-4+VSEL的总数目的百分率分布的估计。数值显示为平均值士SEM。图70.在成体器官中检测到的Oct-4+VSEL的共聚焦显微镜图像。图中显示了在骨髓、脑和肾中检测到的Oct-4+VSEL的代表性图像。就Oct-4 (TRITC ；红色)、CD45 (Cy5 ；红紫色)和Sca-I (FITC ；绿色)染色分选的Sca-I+LirT/⑶45_细胞。细胞核以DAPI (蓝色) 进行染色。图像显示了对⑶45为阴性而对0ct_4(其为多能性细胞的标志物)和Sea-I为阳性的0ct-47Sca-rLin7CD45_细胞(VSEL)。合并的图像显示了 0ct_4的核内染色以及 Sca-I抗原的表面存在。比例尺表示5 μ m。序列表的简单描述SEQ ID Nos :1_64是可以用于扩增多个鼠核酸序列的32个引物对的核苷酸序列， 总结于表1中。^t 1 用于实时RT-PCR的鼠引物的序列
基因 (GENBANK 登记号 )序列(以5，-3'顺序表示)召2微球蛋白 (NM_009735)CATACGCCTGCAGAGTTAAGCA (SEQ ID NO: 1) GATCACATGTCTCGATCCCAGTAG (SEQ ID NO: 2)Oct4 (X52437)ACCTTCAGGAGATATGCAAATCG (SEQ ID NO: 3) TTCTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCT (SEQ ID NO: 4)Nanog (AY278951)CGTTCCCAGAATTCGATGCTT (SEQ ID NO: 5) TTTTCAGAAATCCCnCCCTCG (SEQ ID NO: 6)
权利要求
1.源自人类的成人器官或组织细胞的非常小的胚胎样干细胞(VSEL)的富集群体，其中所述群体这样富集通过就⑶133+CXCR4+CD34+LinTD45-细胞来选择细胞以获得靶VSEL 的富集群体。
2.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是0ct_4+。
3.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是SSEA+。
4.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL在细胞核中表达Oct-4蛋白，并且在表面上表达SSEA抗原。
5.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是Nanog+。
6.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL表达选自下列的原始生殖细胞 (PGC)标志物胎儿型碱性磷酸酶、OctA, SSEA-U CXCR4、Mvh、Stella, Fragilis, Nobox 和 Hdac6。
7.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就大小为2至6μπι的细胞进行选择而富集的。
8.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就大小为2至4μπι的细胞进行选择而富集的。
9.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就含有原始的非结构化的常染色质的细胞进行选择而富集的。
10.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述群体中至少30%的细胞是靶VSEL。
11.源自人类血液的非常小的胚胎样干细胞(VSEL)的富集群体，其中所述群体这样富集通过就⑶133+CXCR4+⑶34+LinTD45_细胞来选择细胞以获得靶VSEL的富集群体。
12.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述血液是脐带血。
13.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述血液是外周血。
14.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是0ct_4+。
15.权利要求1的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是SSEA+。
16.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL在细胞核中表达0ct_4蛋白，并且在表面上表达SSEA抗原。
17.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL是Nanog+。
18.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述靶VSEL表达选自下列的原始生殖细胞 (PGC)标志物胎儿型碱性磷酸酶、OctA, SSEA-1、CXCR4、Mvh、Stella、Fragilis, Nobox 和 Hdac6。
19.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就大小为2至6μ m的细胞进行选择而富集的。
20.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就大小为2至4μm的细胞进行选择而富集的。
21.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述群体是通过就含有原始的非结构化的常染色质的细胞进行选择而富集的。
22.权利要求11的VSEL的富集群体，其中所述群体中至少30%的细胞是靶VSEL。
23.产生细胞群体的方法，所述细胞群体就来自人类血液的靶非常小的胚胎样干细胞 (VSEL)进行了富集，所述方法包括裂解血液以除掉红细胞和制备LirT/⑶457⑶133+细胞的富集群体。
24.权利要求23的方法，其中所述血液是脐带血。
25.权利要求23的方法，其中所述血液是外周血。
26.产生细胞群体的方法，所述细胞群体就来自人类血液的靶非常小的胚胎样干细胞 (VSEL)进行了富集，所述方法包括i)裂解血液以除掉红细胞；ii)制备CD133+细胞的富集群体；和iii)制备LirT/⑶457⑶133+的富集群体。
27.权利要求沈的方法，其中所述血液是脐带血。
28.权利要求沈的方法，其中所述血液是外周血。
29.权利要求沈的方法，其中所述LirT/⑶457⑶133+的富集群体是通过荧光激活的细胞分选来富集的。
30.权利要求沈的方法，其中在低渗的氯化铵溶液中裂解血液以除掉红细胞。
31.权利要求沈的方法，其中通过使用免疫磁珠来富集CD133+细胞。
全文摘要
当前披露的主题提供了分离干细胞群的方法，所述干细胞群来自骨髓、外周血和/或其它来源。还提供了使用干细胞治疗受试者中的组织和/或器官损伤的方法。
文档编号C12N5/071GK102333861SQ200980148102
公开日2012年1月25日 申请日期2009年9月30日 优先权日2008年9月30日
发明者E·K·祖巴-叙尔马, J·拉塔查克, M·库恰, M·拉塔查克 申请人:尼奥斯泰姆公司, 路易斯维尔大学研究基金会有限公司