胆色素原脱氨酶基因治疗的制作方法

专利名称：胆色素原脱氨酶基因治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列和携带这些序列的核酸构建体。 本发明还涉及新的基因治疗载体以及使用所述载体治疗和预防胆色素原脱氨酶缺乏所引起的疾病状况的方法。更具体而言，本发明的基因治疗载体可以用于缓解包括急性间歇性卟啉病在内的这类疾病状况的症状的方法。发明背景 急性间歇性卟啉病(AIP)是遗传代谢病，其特征为胆色素原脱氨酶(PBGD)即血红素合成途径的第三个酶缺乏。该酶的活性在继承该遗传性状的人中为正常活性的约50% 该疾病以常染色体显性方式遗传，并且是最常见的急性卟啉病。尽管其发生于所有的种族中，但是其在北欧最流行，主要在瑞典、英国和爱尔兰。在美国和其他国家，估计的流行程度为5/100000，在瑞典北部高达60-100/100000。目前，PB⑶基因中超过225个突变已有描述。显性临床特征为由于神经系统功能障碍导致的急性间歇性发作，包括腹部疼痛、脑脊髓交感神经系统障碍和循环障碍。腹部疼痛已在85-95%的病例中有报道，并且是最常见的特征，随后是神经变化或与神经变化有关。如果AIP未被识别到，且未撤回有害药物，如可以促使发作发生的肝细胞色素P450酶所代谢的药物，就会发生向呼吸麻痹和延髓麻痹以及死亡的进展。由于心律失常，还可以发生突然死亡。也会发生原发性肝癌和肾功能受损。PB⑶的遗传缺乏不足以出现症状。继承PB⑶突变的高比例的个体从未发展卟啉病症状，即临床外显率很低。AIP携带者的临床症状与卟啉前体Δ -氨基乙酰丙酸(ALA)和胆色素原(PBG)的产生和分泌增加(由于激发急性发作的药物或其他诱发因素导致血红素合成要求增加)有关。在这些情况中，PB⑶缺乏限制了血红素合成，结果血红素介导的ALA 合成酶(ALASl)抑制受到削弱。有证据表面，肝是过量卟啉前体的主要来源。这些化合物在倾向于重复卟啉病危险期的那些人的发作中升高，并在危险期中进一步增加。如果疾病长时期保持无活性，它们可以降低至正常。急性发作经常在青春期后发生，并且可以通过内分泌因素和类固醇激素以及多种环境因素在潜伏的个体中诱发，包括药物、营养因素、受限的碳水化合物和热量摄取、抽烟、 类固醇激素和口服避孕药、铅中毒、并发感染、外科手术以及心理压力。药物是最重要的促使急件发作发牛的因素，并目.安全药物名录可在www. druRs-porphyria. com中获得。抽烟、 酒精以及为CYP450所代谢的药物极大地增加了肝血红素需求并导致ALASl诱导，ALASl增加卟啉前体的产生并促使急性发作发生。同样，ALASl受在禁食期在肝中被诱导的过氧化物酶体增生物激活受体Y共激活剂la (PGCla)的正向调节。在诱发因素中，类固醇激素看起来发挥重要作用。这一概念受到疾病很少在青春期前表现出来以及口服避孕药在一些患有PB⑶缺乏的女性中使发作加剧这一事实的支持。同样，女性感染(80%)比男性感染 (20%)更频繁。急性发作用输注葡萄糖和氯高铁血红素治疗(Normosang，Orphan Europe)。葡萄糖看起来拮抗PGC-I α所介导的ALASl诱导。氯高铁血红素恢复调节血红素库并抑制肝ALASl诱导。一些女性发展了可通过促性腺素释放素(&iRH)类似物预防的经期前发作。一些患者表现出复发的急性发作和严重的致残性神经功能障碍(disabling neurological dysfunction) 0晚期神经损伤和亚急性和慢性症状对血红素治疗无应答。这是仅能通过异源肝移植治愈的威胁生命的疾病状况，异源肝移植目前在3名患者中阻止了神经毒性ALA 和PBG累积。然而，肝移植可获得的相容供体有限和具有显著的发病率和死亡率。因此，基因替代治疗在除了 PBGD缺乏肝功能完全正常的患者中是肝移植的潜在可选方案。基因治疗是通过使用载体将特定基因导入细胞来控制疾病的方法。旨在校正肝酶缺陷的基因送递治疗的可行性正在AIP(AIP小鼠)实验模型中研究。腺病毒载体介导的PBGD向卟啉病小鼠的基因转移，由于PBGD的短暂肝表达而表现出短期治疗功效(Johansson, 2004, Mol. Ther. 10(2) :337-43)。这些结果建立了原理验证 (proof-of-principle)，表明病毒载体介导的PB⑶基因送递可以在AIP小鼠中短暂地缓解苯巴比妥诱发的卟啉病发作的严重表现。EP 1 049 487仅在概念水平上公开了含有人B⑶cDNA的rAAV载体的构建。然而，本领域仍然需要用于AAV介导的向有需要的对象送递hPBGD的改善的载体和方案。发明概述根据本发明，提供了核苷酸序列，即核酸或多核苷酸，其编码人胆色素原脱氨酶 (PB⑶)，其中至少约320个编码人胆色素原脱氨酶的密码子与SEQ ID NO 1中的密码子相同，或其中至少约305个编码人胆色素原脱氨酶的密码子与SEQ ID NO :3中的密码子相同。 优选地，通过Needleman和^msch全局比对算法测定，所述编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列与SEQ ID NO :1或3的全长具有至少95%相同性。SEQ ID NO :1和3中的“密码子”指从SEQ ID NO :1和3的核苷酸1开始的读框中的密码子，即不是从SEQ ID NO :1和3的核苷酸2或3开始的读框。换而言之，SEQ ID NO :1和3的第一个密码子以核苷酸数1-3表示。在另一方面，本发明涉及包含编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的核酸构建体，其中至少约320个编码人胆色素原脱氨酶的密码子与SEQ ID NO :1中的密码子相同，或其中至少约305个编码人胆色素原脱氨酶的密码子与SEQ ID NO 3中的密码子相同。优选地，在所述核酸构建体中，编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列可操作地连接于用于在人细胞中表达的启动子，优选肝特异性启动子。在另一方面，本发明涉及包含编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的病毒基因治疗载体，所述核苷酸序列可操作地连接于用于在人细胞中表达的启动子。优选地，所述载体是重组细小病毒载体或腺伴随病毒(AAV)载体。在另一方面，本发明涉及核酸、核酸构建体或细小病毒病毒体(包含重组细小病毒载体或AAV载体)，所述载体包含编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列。仍然在另一方面，本发明涉及包含此类核酸、核酸构建体或细小病毒病毒体和药学可接受的载体的药物组合物。本发明的其他方面涉及这些核酸、核酸构建体或细小病毒病毒体作为药物和在治疗胆色素原脱氨酶缺乏所引起的疾病状况中的用途，其中优选所述疾病状况是急性间歇性卟啉病(AIP)。本发明还涉及本发明的核酸、核酸构建体或细小病毒病毒体在制备用于治疗胆色素原脱氨酶缺乏所引起的疾病状况的药物中的用途。还提供了将编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列送递到哺乳动物的方法，所述方法包括a.提供本发明的核酸、核酸构建体或细小病毒病毒体；以及b.在使得蛋白以在哺乳动物中提供治疗效果的水平表达的条件下，给所述哺乳动物施用所述核酸、核酸构建体或细小病毒病毒体。本发明还涉及治疗胆色素原脱氨酶缺乏所引起的疾病状况的方法，其中所述方法包括给患有胆色素原脱氨酶缺乏的对象施用有效量的药物组合物，所述组合物包含具有编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的核酸、核酸构建体或细小病毒病毒体，其中，优选地， 所述疾病状况是急性间歇性卟啉病。发明描述定义“核酸”包括由单体核苷酸组成的或包含单体核苷酸的任何分子。术语“核苷酸序列”在本文中可以与“核酸”互换使用。核酸可以说是寡核苷酸或多核苷酸。核酸可以是 DNA或RNA。核酸可以是化学修饰的或人工的。人工核酸包括肽核酸(PNA)、吗啉代核酸和锁核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些核酸中的每一种与天然存在的DNA或RNA的区别在于分子主链的变化。同样，也可以使用硫代磷酸酯核苷酸。其他脱氧核苷酸类似物包括甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、N3' P5'-氨基磷酸酯以及寡核糖核苷酸硫代磷酸酯和它们的2' -0-烯丙基类似物和2' -0-甲基核糖核苷酸甲基磷酸酯，其可以用于本发明的核酸中。“核酸构建体”在本文中理解为，表示使用重组DNA技术产生的人造核酸分子。核酸构建体是单链或双链核酸分子，其被修饰为含有核酸的片段，所述核酸的片段以不在自然界另外存在的方式组合和并列。核酸构建体通常是“载体”，即用于将外源产生的DNA送递到宿主细胞的核酸分子。—种类型的核酸构建体是“表达盒”或“表达载体”。这些术语指核苷酸序列，所述核苷酸序列能实现基因在与这类序列相容的宿主细胞或宿主生物中表达。表达盒或表达载体通常包括至少合适的转录调节序列，和任选地3’转录终止信号。还可以存在有助于实现表达或实现表达所需的其他因子，如表达增强子元件。术语“同源的”，当用于表示给定的(重组)核酸或多肽分子与给定的宿主生物体或宿主细胞间的关系时，应理解为表示所述核酸或多肽分子本质上是由相同种类的宿主细胞或生物产生的。术语“异源的”可以用于表示核酸或多肽分子本质上是用不同种类的宿主细胞或生物产生的。如本文所用，术语“可操作地连接”指多核苷酸(或多肽)元件在功能关系中的连接。当将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，所述核酸是“可操作地连接”的。例如， 如果转录调节序列影响编码序列的转录，则该转录调节序列可操作地连接于该编码序列。 可操作地连接表示连接的DNA序列通常是连续的，并且，如果需要连接两个蛋白编码区，则是连续的和符合读框的。“表达控制序列”指调节与其可操作地连接的核苷酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制并调节核苷酸序列的转录和/或翻译时，所述表达控制序列“可操作地
6连接”于所述核苷酸序列。因此，表达控制序列可以包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IREQ、转录终止子、位于蛋白编码基因前的起始密码子、内含子剪接信号以及终止密码子。术语“表达控制序列”意图最低限度包括其存在被设计为影响表达的序列，并且还可以包括其他有利的组分。例如，前导序列和融合伴侣序列是表达控制序列。该术语也可以包括核酸序列的设计，以至将读框内外不需要的、潜在的起始密码子从序列中去除。其也可以包括核酸序列的设计，以至去除不需要的潜在剪接位点。其包括指导PolyA尾添加的序列或聚腺苷酸化序列，PolyA是位于mRNA 3'末端的一串腺嘌呤残基，其可以称为polyA序列。其还可以被设计为增强mRNA稳定性。适用于昆虫细胞中的影响转录和翻译稳定性的表达控制序列即启动子，以及影响翻译的序列，如Kozak序列(Kozak sequence)，对本领域技术人员而言是公知的。表达控制序列可以具有如调节与其可操作地连接的核苷酸序列的这种性质，从而实现更低或更高的表达水平。如本文所用，术语“启动子”或“转录调节序列”指核酸片段，其功能是控制一个或多个编码序列的转录，并且对于编码序列的转录起始位点的转录方向而言位于上游，并且在结构上由DNA依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列的存在所鉴定，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的作用是直接或间接调节由启动子转录的量的任何其他核苷酸序列，包括例如衰减子或增强子以及沉默子。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是受到生理或发育调节的启动子，如通过应用化学诱导剂调节。 “组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中有活性。“3，UTR，，或“3，非翻译序列”(也称为3，非翻译区，或3’末端)指在基因的编码序列的下游所发现的核酸序列，其包含例如转录终止位点和(在大多数但不是所有的真核 mRNA中)聚腺苷酸化信号(如AAUAAA或其变体)。在转录终止后，mRNA转录物可以在聚腺苷酸化信号的下游受到切割，并且可以添加poly㈧尾，poly㈧尾参与mRNA向细胞质 (发生翻译的地方)的转运。术语“实质上相同(substantially identical) ”、“实质相同性”或“基本上相似” 或“基本相似性”表示，两个肽或两个核苷酸序列，当最佳比对时，比如通过GAP或BESTFIT 程序，利用默认参数，共享本文其他地方所限定的某些百分比的序列相同性。GAP利用 Needleman和^msch全局比对算法对它们的全长比对两个序列，从而使匹配最大化而使空位最小化。通常，使用GAP默认参数，空位产生罚分=50 (核苷酸)/8(蛋白)，空位延伸罚分=3 (核苷酸)/2 (蛋白)。对于核苷酸，所用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白，默认评分矩阵是 Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89,915-919) 显然，当认为 RNA 序列与DNA序列基本上相似或具有某种程度的序列相同性时，认为DNA序列中的胸腺嘧啶 ⑴等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。序列比对和序列百分比相同性得分可以利用计算机程序测定，如 GCG Wisconsin Package，版本 10. 3，可从 Accelrys Inc. , 9685Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752，USA获得，或开放源码软件用于Windows的Emboss (当前版本 2. 7. 1-07)。可选地，相似性或相同性百分比可通过针对诸如FASTA、BLAST等的数据库进行检索而测定。在本说明书和权利要求书中，动词“包含”和其变形以其非限制性意义使用，表示包括该词语后的项目，但不排除未明确提到的项目。另外，不定冠词“a ( —个)”或“an ( 一个)”所提到的元件不排斥存在多于一个该元件的可能性，除非上下文明确要求存在且仅存在一个该元件。不定冠词“a (—个)”或“an (—个)，，因此通常表示“至少一个”。发明详述本发明涉及编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列。所述编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列优选是合成核苷酸序列。术语“合成核苷酸序列”在本文中理解为，表示该核苷酸序列在自然界中并不如此存在，而是受到人的干预的设计、改造和/或构建。术语“合成”因此并不一定意味着序列无一例外地和/或完全通过化学合成获得。更确切地是，尽管合成序列的部分在一个阶段可能已经通过化学合成获得，但是包含本发明的合成序列的分子通常通过生物来源如(培养的，如重组)细胞获得。本发明的核苷酸序列可以编码红系(erythroid)或非红系胆色素原脱氨酶。优选地，所述核苷酸序列编码人来源的胆色素原脱氨酶。所述核苷酸序列因此可以编码等位基因形式的人胆色素原脱氨酶的任何天然存在的氨基酸序列。然而，本发明明确包括的是编码与例如天然存在的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的胆色素原脱氨酶的改造突变蛋白的核苷酸序列。优选地，所述核苷酸序列编码具有胆色素原脱氨酶活性(EC 2.5. 1.61)的蛋白，所述活性可以通过诸如feight and Lim(1983, Biochem. J. 213 :85-88)所述的测定法进行测定。在本发明优选的实施方案中，编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列与天然存在的编码脱氨酶的核苷酸序列相比，具有对于人细胞而言改善的密码子使用偏好。编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列对人细胞的密码子使用的适应性可以表示为密码子适应指数(codon adaptation index, CAI)。密码子适应指数在本文中定义为对高表达的人基因的密码子使用，基因的密码子使用的相对适应性的度量。每个密码子的相对适应性(w)，是每个密码子的使用与同一个氨基酸最丰富密码子的使用的比率。将CAI定义为这些相对适应性值的几何平均数。排除非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)。CAI值的范围为0-1，较高的值表示较高比例的最丰富的密码子(参阅Siarp and Li, 1987,Nucleic Acids Research 15 :1281-1295 ；还参阅Kim et al. ,Gene. 1997,199 :293-301 ；zur Megede et al. , Journal of Virology, 2000, 74 :2628-2635)。优选地编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的CAI为至少 0. 8、0· 85、0· 90、0· 92、0· 94、0· 95、0· 96 或 0. 97。在本发明优选的核苷酸序列中，编码非红系胆色素原脱氨酶的所有密码子中有至少 320、330、340、345、350、355、356、357、358、359、360 或 361 个密码子与 SEQ ID NO 1 中 (相应位置中)的密码子相同。更优选，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO :2的氨基酸序列。可选地，在本发明优选的核苷酸序列中，编码细胞胞类胆色素原脱氨酶的密码子中有至少 305、310、315、320、325、330、335、340、341、342、343 或 344 个密码子与 SEQ ID NO 3中(相应位置中)的密码子相同。更优选地，所述核苷酸序列编码SEQ ID N0:4的氨基酸序列。SEQ ID NO :1和3中的“密码子”指从SEQ ID NOs :1和3的核苷酸1开始的读框内的密码子，即不是从SEQ ID NO :1和3的核苷酸2或3开始的读框。换而言之，SEQ ID NO :1和3的第一个密码子以核苷酸数1-3表示。本发明另一优选的核苷酸序列编码具有胆色素原脱氨酶活性的多肽，由此，该核苷酸序列在其全长与SEQ ID NO :1或3具有至少95%、96%、97%、98%或99%核苷酸序列相同性，这通过Needleman和mmsch全局比对算法测定。更优选，核苷酸序列编码SEQ ID NO :2或4的氨基酸序列。在本发明特别优选的实施方案中，核苷酸序列具有SEQ ID NO :1或3的核苷酸序列。在另一方面，本发明涉及包含本文上文所限定的核苷酸序列的核酸构建体。在所述核酸构建体中，编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列优选地可操作地连接于哺乳动物的细胞相容表达控制序列，如启动子。许多此类启动子在本领域内是已知的(参阅Sambrook and RuSSell，2001，同上)。可以使用在许多细胞类型中广泛表达的组成型启动子，如CMV 启动子。然而，诱导型、组织特异性、细胞类型特异性或细胞周期特异性启动子可以是优选的。在优选的实施方案中，编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列可操作地连接于肝特异性启动子。肝特异性启动子特别优选用于与非红系脱氨酶一起使用。优选地，在本发明的构建体中，用于肝特异性表达的表达控制序列例如选自α 1抗胰蛋白酶(AAT)启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、白蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、肝控制区(Hepatic Control Region, HCR)-ApoCII杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件组合的AAT启动子，以及载脂蛋白E启动子。其他实例包括用于肿瘤选择性表达和特别是神经细胞肿瘤选择性表达的E2F启动子(Parr et al.，1997，Nat. Med. 3 1145-9)或用于单核血细胞的 IL-2 启动子(Hagenbaugh et al.，1997，J Exp Med ； 185 2101-10)。在本发明特别优选的实施方案中，其中启动子具有SEQ ID NO :5的序列。在本发明核酸构建体的另一优选的实施方案中，3' UTR(或3'非翻译序列)可以位于编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的下游。技术人员可获得合适的3' UTR序列。它们可以衍生于任何哺乳动物且优选人基因，并且通常包含转录终止位点和聚腺苷酸化信号 (如AAUAAA或其变体)。在特别优选的实施方案中，所述核酸构建体包含衍生于人PBGD基因的 3' UTR，如 SEQ ID NO :6。在本发明核酸构建体的另一优选的实施方案中，可操作地连接于编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的表达控制序列的上游前面是PolyA绝缘子(polyA insulator)，以便终止从可能的上游转录单元开始的贯通转录。如上文所述且优选地至少包含转录终止序列的3' UTR可以用于本目的。优选的polyA绝缘子是具有SEQ ID NO :7的序列的合成polyA 绝缘子。在一优选的实施方案中，本发明的核酸构建体可以包含在编码胆色素原脱氨酶核苷酸序列的起始密码子周围的Kozak共有序列。Kozak共有序列在本文中定义为 GCCRCC (AUG) A (SEQ ID NO :8)，其中R是嘌呤(即A腺苷，或G鸟苷)，且其中(AUG)代表胆色素原脱氨酶编码序列的起始密码子。尽管在通常的Kozak共有序列中，直接在AUG起始密码子之后的核苷酸是G (鸟苷)，但在本发明中，这个核苷酸在红系和非红系胆色素原脱氨酶编码序列中优选是A(腺苷)。在优选的实施方案中，Kozak共有序列的前面可以是另一 GCC三联体。在其他方面，本发明涉及包含编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的核酸构建体， 所述核苷酸序列可操作地连接于上文所限定的表达控制序列，其中构建体是适于哺乳动物的基因治疗优选人的基因治疗的表达载体。根据本发明，优选的核酸构建体是病毒基因治疗载体。病毒基因治疗载体在本领域中是公知的，并且例如，包括基于腺病毒和细小病毒科
9(Parvoviridae)成员的载体，如腺伴随病毒(AAV)或疱疹病毒、痘病毒或逆转录病毒。优选的病毒基因治疗载体是AAV、腺病毒载体或慢病毒载体。在本发明中，特别优选的基因治疗载体是细小病毒载体。因此，在该优选的方面， 本发明涉及动物细小病毒的用途，特别是诸如感染性人或猿AAV的依赖病毒以及其组分 (如动物细小病毒基因组)用作载体，将编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列引入哺乳动物细胞和/或在哺乳动物细胞中表达该核苷酸序列。细小病毒科的病毒是小DNA动物病毒。细小病毒科可以分成两个亚科细小病毒亚科(Parvovirinae)，其感染脊椎动物，和浓核症病毒亚科(Densovirinae)，其感染昆虫。 细小病毒亚科的成员在本文中称为细小病毒，并包括依赖病毒属(Dependovirus)。正如可以根据它们属的名称所推断的，依赖病毒属的成员是独特的，因为它们通常要求与诸如腺病毒、疱疹病毒的辅助病毒的共感染，用于在细胞培养物中进行生产性感染。依赖病毒属包括AAV，其通常感染人(如血清型1、2、3A、;3B、4、5和6)或灵长类(如血清型1和4)，以及感染其他温血动物的相关病毒(如牛、犬、马和绵羊的腺伴随病毒)。有关细小病毒亚科的细小病毒和其他成员的其他信息描述于Kenneth I. Berns, “ Parvoviridae :The Viruses and Their Replication, " Chapter 69in Fields Virology(3d Ed. 1996)。为了方便，参照AAV，在本文中进一步举例说明和描述了本发明。然而应当理解，本发明并不限于AAV，而可以等同应用于其他细小病毒。所有已知的AAV血清型的基因组结构都是非常相似的。AAV的基因组是线性的单链DNA分子，其长度小于约5000个核苷酸(nt)。反向末端重复(ITR)位于非结构复制 (Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特的编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白(VPl、-2以及_3) 形成壳体。末端145nt是自我互补的，并且可以被组织以形成充分稳定的分子内双链体的方式组织，所述双链体形成T形发夹。这些发夹结构发挥病毒DNA复制的起点的功能，充当细胞DNA聚合酶复合体的引物。在哺乳动物细胞中，野生型(Wt)AAV感染后，Rep基因(即 Rep78和R印5 分别由P5启动子和P19启动子表达，并且两个R印蛋白都在病毒基因组复制中具有功能。R印ORF中的剪接事件导致实际上4个R印蛋白(即R印78、R印68、Rep52 和R印40)的表达。然而，已经证明，在哺乳动物细胞中编码R印78和R印52蛋白的未剪接的mRNA足以用于AAV载体产生。同样，在昆虫细胞中，R印78和R印52蛋白足以使AAV载体产生。“重组细小病毒载体或AAV载体”(或“rAAV载体”)在本文中指包含侧翼为至少一个细小病毒反向末端重复序列(ITR)或AAV反向末端重复序列(ITR)的一个或多个目的多核苷酸序列、目的基因或“转基因”的载体。当存在于正在表达AAV r印和cap基因产物(即AAV R印和Cap蛋白)的昆虫宿主细胞中时，可以使此类rAAV载体复制并包装成感染性病毒颗粒。当将rAAV载体并入更大的核酸构建体(如在染色体中或在另一个诸如用于克隆或转染的质粒或杆状病毒的载体中)中时，则rAAV载体通常称为“前载体 (pro-vector) ”，在存在AAV包装功能和必须的辅助功能的情况下，其可以通过复制和壳体化“营救(rescue)”。因此，在另一方面，本发明涉及包含如上文所述编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的核酸构建体，其中核酸构建体是重组细小病毒载体或AAV载体，因此包含至少一细小病毒ITR或AAVITR。优选地，在核酸构建体中，编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的侧翼是位于任一侧的细小病毒ITR或AAV ITR0任何细小病毒ITR或AAV ITR都可以用于本发明的构建体中，包括来自AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8和/或AAV9的ITR。 AAV2的ITR是最优选的。用于本发明优选的核酸构建体的优选的ITR序列的实例是给定的 SEQ ID NO 9 (左或上游 ITR)和 SEQ ID NO 10(右或下游 ITR)。AAV能感染许多哺乳动物细胞。参阅如Tratschin et al. (1985，Mol. Cell Biol. 5 :3251-3260)和 Grimm et al. (1999，Hum. Gene Ther.边2445-2450)。然而，人滑液成纤维细胞的AAV转导显著地比在相似的鼠细胞中更有效，Jennings et al.，Arthritis Res，3 :1(2001),且AAV的细胞向性(tropicity)在血清型中不同。参阅，例如Davidson et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 :3似8_3432)，对于哺乳动物 CNS 细胞向性和转导效率，其讨论了 AAV2、AAV4 和 AAV5 中的差异，还参阅 Goncalves，2005，Virol J. 2(1) 43，其讨论了修饰AAV向性的方法。对于肝细胞的转导，具有AAV1、AAV8和AAV5壳体蛋白的rAAV病毒体是优选的(Nathwani et al. ,2007,Blood 109(4) :1414-1421 ；Kitajima et al. ,2006, Atherosclerosis 186(1) :65-7 ，其中具有 AAV5 壳体蛋白的 rAAV 病毒体是最优选的。可用于本发明用于在昆虫细胞中产生rAAV载体的AAV序列可以衍生于任何AAV 血清型的基因组。通常，AAV血清型在氨基酸水平和核酸水平具有显著同源性的基因组序列。这提供了产生病毒体的一套相同的遗传功能，所述病毒体实质上在物理和功能方面是等同的。有关各种AAV血清型的基因组序列和基因组相似性综述，参阅例如GenBank登录号 U89790、GenBank 登录号 J01901、GenBank 登录号 AF043303、GenBank 登录号 AF085716、 Chlorini 等(1997，J.Vir. 71 :6823-33)、Srivastava 等(1983，J.Vir. 45 :555-64)、 Chlorini 等(1999，J. Vir. 73 :1309-1319)、Rutledge 等(1998，J.Vir. 72 :309-319)和 Wu 等0000，J. Vir. 74 :8635-47)。rAAV血清型1、2、3、4以及5是用于本发明的AAV核苷酸序列的优选来源。优选地，用于本发明的AAV ITR序列衍生于AAV1、AAV2和/或AAV4。同样，Rep (R印78/68和R印52/40)编码序列优选衍生于AAV1、AAV2和/或AAV4。然而，编码用于本发明的病毒蛋白(VP) VP1、VP2和VP3壳体蛋白的序列，可以取自已知的42个血清型中的任何血清型,更优选地取自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9，或通过壳体改组技术(capsid shuffling technique)和AAV壳体文库获得的新研发的AAV 样颗粒。AAV Rep和ITR序列在大多数血清型中特别保守。各种AAV血清型的R印78蛋白例如超过89%相同，且在AAV2、AAV3A、AAV;3B和AAV6之间在基因组水平上总核苷酸序列相同性为约 82% (Bantel-Schaal et al. , 1999, J. Virol. ,73(2) :939-947)。而且，已知许多 AAV血清型的Rep序列和ITR，在哺乳动物细胞中产生AAV颗粒时，有效地与来自其他血清型的相应序列交叉互补(即在功能上取代)。US2003148506报道，AAV Rep和ITR序列在昆虫细胞中也有效地与其他AAV R印和ITR序列交叉互补。已知AAV VP蛋白决定AAV病毒体的细胞向性。在不同AAV血清型中，VP蛋白编码序列明显没有R印蛋白和基因保守。R印和ITR序列与其他血清型的相应序列交叉互补的能力允许产生包含一血清型(如AAV5)的壳体蛋白和另一 AAV血清型(如AAV2)R印和/或 ITR序列的假型rAAV颗粒。这类假型rAAV颗粒是本发明的一部分。在本文中，假型rAAV 颗粒可以称为是“x/y”型，其中“X”表示ITR的来源，而“y”表示壳体的血清型，如2/5rAAV 颗粒具有来自AAV2的ITR和来自AAV5的壳体。
修饰的“AAV”序列也可以用于本发明中，如用于在昆虫细胞中产生rAAV载体。这类修饰的序列，例如，包括与 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 或 AAV9 的 ITR、 R印或VP具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约 95%或更多核苷酸和/或氨基酸序列相同性的序列(如具有约75%至约99%核苷酸序列同一性的序列)，其可用于取代野生型AAV ITR、Rep或VP序列。尽管在许多方面与其他AAV血清型相似，但是AAV5与其他人和猿AAV血清型的不同，多于其他已知的人和猿血清型。据此，在昆虫细胞中，rAAV5的产生，可以不同于其他血清型的产生。如果使用本发明的方法产生rAAV5，优选的是，一个或多个构建体包含，如果是多个构建体则共同包含，包含AAV5 ITR的核苷酸序列，包含AAV5 R印编码序列的核苷酸序列(即包含AAV5 Rep78的核苷酸序列)。可以根据需要修饰此类ITR和R印序列，以获得rAAV5或假型rAAV5载体在昆虫细胞中的有效产生。例如，可以修饰Rep序列的起始密码子，可以修饰或去除VP剪接位点，和/或可以修饰VPl起始密码子和附近的核苷酸，以改善rAAV5载体在昆虫细胞中的产生。修饰优选的腺病毒载体，以便减少宿主应答，如Russell (2000, J. Gen. Virol. 81 2573-2604)所评述，或如 US20080008690 和 Zaldumbide and Hoeben (Gene Therapy 2008 239-246)所述。因此本发明也涉及包含本文上文所限定的核酸构建体和本文上文所限定的细小病毒壳体蛋白的细小病毒病毒体。在其他方面，本发明涉及在昆虫细胞中产生重组细小病毒(如rAAV)病毒体(包含上文所限定的重组细小病毒(rAAV)载体)方法。优选地，所述方法包括如下步骤(a) 在使重组细小病毒(例如rAAV)载体产生的条件下，培养本文所限定的昆虫细胞；以及(b) 回收重组细小病毒(例如rAAV)载体。在此应当理解的是，在该方法中所产生的重组细小病毒(rAAV)载体优选是感染性细小病毒病毒体或AAV病毒体，其包含重组细小病毒(rAAV) 载体核酸。用于培养的昆虫细胞的生长条件，以及培养的昆虫细胞中异源产物的产生，在本领域中是公知的，并且描述于例如上文所引用的有关昆虫细胞的分子工程的参考文献中。用于产生本发明rAAV病毒体的优选的方法和构建体，公开于例如W02007/046703和 W02007/148971 中。优选地，用于产生重组细小病毒病毒体的方法还包括利用抗AAV抗体，优选地固定的抗体，亲和纯化(病毒体所包含的)重组细小病毒(rAAV)载体的步骤。抗AAV抗体优选地是单克隆抗体。特别合适的抗体是如可从骆驼或美洲驼(llamas)获得的单链骆驼抗体或其片段(参阅例如Muyldermans，2001，Biotechnol.li :277-302)。用于亲和纯化rAAV 的抗体优选地是特异性结合AAV壳体蛋白上的表位的抗体，由此，优选地，该表位是存在于多种AAV血清型的壳体蛋白上的表位。例如，抗体可以基于与AAV2壳体的特异性结合选择或产生，但同时，其也可以与AAV1、AAV3和AAV5壳体特异性结合。本发明还涉及本文上文所限定的细小病毒病毒体，其用作药物。换而言之，本发明提供了本发明的细小病毒病毒体在治疗人或动物体的方法中的用途。本发明还涉及本文上文所限定的细小病毒病毒体，其用于治疗胆色素原脱氨酶缺乏所引起的疾病状况。优选地，此类疾病状况是急性间歇性卟啉病。本发明的核酸或核酸构建体也适于此类用途。
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因此，本发明涉及用于制备用于治疗胆色素原脱氨酶缺乏所引起的疾病状况的治疗方法中的药物的本发明的核酸、核酸构建体或细小病毒病毒体。优选地，此类疾病状况是急性间歇性卟啉病。此类治疗可以缓解、改善、减少AIP的一种或多种症状的严重性，例如减少发作的发生率或严重性。例如，本发明的治疗可以缓解、改善、减少神经系统功能障碍、 腹部疼痛或脑脊髓交感神经系统障碍和/循环障碍的严重性。此外，本发明涉及包含本文上文所限定的细小病毒病毒体的药物组合物。药物组合物还优选地包含药学可接受的载体。任何合适的药学可接受的载体或赋形剂都可以用于本组合物中(参阅例如 Remington :The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor)Mack Publishing Company, April 1997)。 iftit白勺
盐水、葡萄糖溶液或缓冲溶液或其他药学可接受的无菌流体组合。可选地，可以使用固体载体，如微载体珠。药物组合物通常是无菌的，且在制备和储藏条件下是稳定的。可以将药物组合物配制为适于容纳高药物浓度的溶液、微乳剂、脂质体或其他有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多羟基化合物(例如丙三醇、丙二醇以及液态聚乙二醇等)和其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以通过以下方式维持流动性例如通过使用诸如卵磷脂的包被，通过在分散情况下维持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂。在许多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖，诸如甘露醇、山梨醇的多元醇或氯化钠。可注射的组合物的延长吸收，可以通过在该组合物中包括可延迟吸收的试剂来实现，所述试剂例如单硬脂酸盐和明胶。细小病毒病毒体可以以定时释放或控制释放制剂的方式施用，例如，以包括缓释聚合物或会保护所述化合物免于快速释放的其他载体的组合物的形式，包括移植物和微胶囊化的送递系统。例如可以使用生物可降解的生物相容聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸以及聚乳酸聚乙醇酸共聚物 (polylactic, polyglycolic copolymers, PLG)。本发明还提供了将编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列送递到哺乳动物的方法，所述方法包括a.提供本文上文所限定的核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物；以及b.在使得蛋白以在所述哺乳动物中提供治疗效果的水平表达的条件下，给所述哺乳动物施用所述核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物。本发明还涉及用于治疗胆色素原脱氨酶缺乏所引起的疾病状况的方法，其中所述方法包括以下步骤给患有胆色素原脱氨酶缺乏的个体施用有效量的本文上文所限定的核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物。优选地，所述个体患有急性间歇性卟啉病疾病状况。在本发明的治疗或疗法中，胆色素原脱氨酶缺乏所引起的疾病状况通过给个体施用有效量的本文所限定的核酸、核酸构建体细小病毒病毒体或药物组合物来治疗。患有此类疾病状况的患者的状况可以通过施用本发明的核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物来改善。可以将治疗有效量的本发明的核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物给予有需要的患者。核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物通常包括于药物组合物中，任选地与药物载体、稀释剂和/或佐剂组合。此类组合物包括足以提供期望的治疗或预防效果的有效量的核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物，和药效可接受的载体或赋形剂。“有效量”包括治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”指在必要的剂量和时间段内，有效实现期望的治疗结果的量，例如 PBGD活性的升高。核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物的治疗有效量，可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别、重量的因素以及核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物在该个体中引发期望的应答的能力而变化。可以调整剂量治疗方案，以便提供最佳的治疗应答。治疗有效量还通常是核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物的任何毒性或有害作用被治疗有益效果超过的量。“预防有效量”指在必要的剂量和时间段内，有效实现期望的预防结果的量，如预防或抑制各种疾病状况，包括与PBGD水平降低有关的疾病状况。在疾病的早期阶段或在疾病的早期阶段之前，可以在个体中使用预防剂量，并且在许多情况下，预防有效量可以比治疗有效量多或少。在具体实施方案中，核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物的治疗或预防有效量的范围可以是从IxlO12和IxlO13个基因组拷贝(gc)/kg，例如从IxlO11到 lxl012gc/kgo应当指出，剂量值可以随着待缓解的疾病状况的严重性而变化。对于任何具体对象，可以根据个体需要和管理和监督组合物施用的人员的专业判断，随时间调整具体的剂量治疗方案。本文所提出的剂量范围仅仅是示例性的，并且不限制开业医师(medical practitioner)可选择的剂量范围。对于基因治疗载体，如本发明的细小病毒病毒体，待施用的剂量可以在很大程度上依赖于正被治疗的对象的状况和大小以及治疗制剂、治疗频率和施用途径。继续治疗的治疗方案，包括剂量、制剂以及频率，受到初始应答和临床判断的指导。可以优选注射到组织胞间隙的胃肠外途径，尽管其他具体施用可能需要其他胃肠外途径，如气雾剂的吸入。在某些方案中，将在水性载体中包含基因和基因送递系统的制剂以合适的量注射到组织中。组织靶可以是特定的，如肝组织，或其可以是几个组织的组合，如肌肉组织和肝组织的组合。示例性的组织靶可以包括肝、骨骼肌、心肌、脂肪沉积(adipose cbposit)、肾、 肺、血管内皮、上皮和/或造血细胞。在一实施方案中，肌肉内注射后，对于小动物(小鼠)而言，有效剂量范围可以为介于IxlO12和IxlO13基因组拷贝(gc)/kg之间，对于更大的动物(猫)和人对象而言，介于 IxlO11 和 lxl012gc/kg 之间。在本发明的组合物中，活性核酸、核酸构建体、细小病毒病毒体或药物组合物的量，可以根据诸如个体的疾病状况、年龄、性别和重量的因素而变化。可以调整剂量治疗方案，以便提供最佳的治疗应答。例如可以给予单个大丸剂，可以随时间给予几个分开的剂量，或可以如治疗情形的紧急情况所示按比例增加或减少剂量。配制剂量单位形式的胃肠外组合物是有利的，便于施用和剂量的均勻性。本文所用的“剂量单位形式”指适宜作为待治疗的对象的均勻剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物，和所需的药物载体。本发明剂量单位形式的规格可以通过以下规定活性化合物的独特特性和待实现的具体治疗效果，以及混合用于治疗个体的疾病状况的此类活性化合物领域所固有的限制。
本文所用的“药学可接受的载体”或“赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包被、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及生理上相容的试剂。在一实施方案中，载体适于胃肠外施用，胃肠外施用包括静脉内施用、腹膜内施用或肌肉内施用。可选地，载体可以适于舌下施用或口服施用。药学可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射的溶液或分散体的无菌粉末。药物活性物质的此类介质的使用在本领域中是公知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的情况，考虑了其在本发明药物组合物中的使用。还可以将辅助活性化合物并入本发明的药物组合物中。有关其他治疗剂共给药的指导可以见于例如 Compendium of Pharmaceutical and Specialties (CPS) of the Canadian Pharmacists Association。


图1. AAV2/8_hPB⑶注射对雄性AIP小鼠血红素前体分泌的剂量效应。AIP小鼠具有25-30 %的正常PB⑶活性，是由PB⑶一等位基因的破坏和另一等位基因的部分破坏导致的。LUC是荧光素酶报道构建体；PB⑶是各种剂量的rAAV-PB⑶载体。表示为基因组拷贝 /kg ；Pb是苯巴比妥。图2.在施用hl012vg/kg治疗载体ssAAV2/8_hPB⑶或对照载体ssAAV2/8_Luc后， 在苯巴比妥诱发的急性发作后，PBG和ALA在雌性AIP小鼠中的尿分泌。LUC是荧光素酶报道构建体；PB⑶是各种剂量的rAAV-PB⑶构建体Jb是苯巴比妥。图3.通过蛋白质印迹分析所测量的在雄性AIP小鼠的肝中的PB⑶转基因表达。图4.通过蛋白质印迹分析所测量的在雌性AIP小鼠的肝中的PB⑶转基因表达。图5.在用不同剂量的SSAAV2/8转导的AIP雄性小鼠中注射后3个月的肝PB⑶ 活性。图6.在用携带荧光素酶或PB⑶基因的SSAAV2/8载体转导的AIP雌性小鼠的肝中注射后3个月的PB⑶活性。图7.在水力注射(hydrodynamic injection)包含野生型PBGD编码序列(PBGD) 和SEQ ID NO 1的合成(即密码子优化)的PB⑶编码序列(coPB⑶)的质粒DNA构建体后，PBGD在野生型小鼠(WT小鼠)和AIP小鼠(AIP小鼠)中体内酶促活性的比较。存在于肝中的载体DNA的水平通过使用与转基因杂交的引物证实。基于Q-PCR的内源管家基因 GADPH和PB⑶转基因的DNA拷贝间的比率表示在PB⑶酶促活性的上方，并且未表现出显著差异。图8和9. AAV2/5-PBGD保护雄性小鼠(图8)和雌性小鼠(图9)免于苯巴比妥诱发的急性卟啉病发作。ALA和PBG在AIP小鼠中的基础水平以及在第一、第二和第三次苯巴比妥诱发的急性卟啉病发作后ALA和PBG水平，表示于用5el2gc/kg剂量的对照载体 (AAV2/5-EalbAAT-荧光素酶)治疗的小鼠和用kl2gc/kg AAV8和AAV5-PB⑶载体治疗的小鼠中。图10.在施用AAV8-PB⑶和AAV5-LUC后，肝勻浆中PB⑶酶促活性(n = 4-6)。图11. Α.在单次注射1. 25xlOngc携带来自人的PBGD cDNA(wt PB⑶)或密码子优化的PB⑶(coPB⑶；SEQ ID NO 1)的ssAAV2/5载体后1、2或3个月，AIP雄性小鼠的肝勻浆中的PBGD酶活性。B.在注射后1、2和3个月，载体拷贝水平的半定量PCR分析。C.来自雄性小鼠的肝的代表性免疫组织化学分析，所述小鼠注射了携带受肝特异性启动子控制的WtPB⑶或coPB⑶转基因的ssAAV2/5载体。D.来自每同期组(cohort)动物的用PB⑶ 抗体染色的细胞的比例。图12.AIP小鼠的周围神经病变的神经学评估。在接受了 3种不同剂量的 rAAV2/8-PBGD的两种性别的AIP小鼠中，确定大轴突(直径5 μ m)的百分比和轴突密度。 未治疗的小鼠和野生型(WT)小鼠充当对照。图13. AIP小鼠运动协调和肌肉性能的滚轮分析(Rotarod analysis)。在本研究开始时，和施用AAV2/8-PBGD 90天后诱发卟啉病发作时，测量雄性和雌性AIP小鼠能停留在旋转的传力杆上的时间长度。通过每对小时腹膜内注射剂量渐增的苯巴比妥，为期4天， 诱发卟啉病发作。
实施例实施例1 :AAV介导的胆色素原脱氨酶的肝特异性表达在急性间歇性卟啉病小鼠模型中回复生物化学改变并防止运动神经病变1. 1材料和方法1. 1. 1动物模型通过Lindberg et al. (Nature genetics，1996)所述的基因寻靶产生急性间歇性卟啉病(AIP)小鼠。Tl和T2转基因系由巴塞尔大学的tos Meyer教授慷慨提供，且纳瓦拉大学的动物实验室已经建立了这些动物的群体。在Tl转基因动物中，已经将新霉素基因插入PB⑶基因的第一个外显子中，并且纯合动物肝中PB⑶活性丢失45%。在T2小鼠中，已经将新霉素基因插入PBGD基因的第一内含子。纯合状况是致死的，且杂合动物表现出肝中 PBGD活性丢失43%。在用苯巴比妥(Pb)和/或雌二醇处理后，所述系既没有表现出卟啉病体症也没有增加血红素前体的尿分泌(数据未显示)。为了进一步降低PBGD活性，进行两个系的杂交育种。携带敲除的Tl和T2等位基因的复合(compound)杂合体动物用作AIP 的疾病模型。这些小鼠在用诸如苯巴比妥的药物处理后，表现出典型的人卟啉病生物化学特征，特别是肝PBGD活性降低，以及血红素前体的尿分泌大量增加。卟啉，主要是尿卟啉和粪卟啉在AIP中也升高，但是尿卟啉的增加的特异性特征不及PBG和ALA水平的增加的特异性特征。诸如滚轮测验的动作测验表明，在施用1 后运动功能降低，且组织病理学发现包括轴突神经病变和随老化而降低的神经传导。1.1.2AAV 载体质粒和序列本研究所用的AAV质粒含有侧翼为来自AAV2的两个ITR的表达盒和适当的填充序列，以便将AAV基因组的大小调整到针对AAV所述的最佳包装容量。转基因表达盒具有下列元件来自AAV2的5’ ITR、具有来自白蛋白增强子的调节序列的肝特异性启动子 felbAATp (Kramer et al·，2003，Mol Ther. 7(3) :375-85)、管家 PBGD cDNA (GenBank acc#X04808)或荧光素酶报道基因(GenBank aCC#M15077)。添加牛生长激素聚腺苷酸化序列[bGH poly (A)] ( ^ 2326-2533 GenBank acc#M57764)，即土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WP拙)(碱基1021-1750 GenBank acc#J04514)，以增强转录(Donelloet al. , 1998 J Virol. 72(6) :5085-92)，和来自 AAV2 的 3，ITR。这两个 AAV 质粒称为 ssAAV-polyA-felbAAT-PB⑶-WPRE (表达治疗基因)和 ssAAV-polyA-EalbAAT-荧光素酶-WPRE (表达报道基因GFP)。AAV载体的制备通过在293细胞中磷酸钙介导共转染3种不同质粒pAdDeltaF6、p5E18_VD2/8 和治疗基因(AAV-polyA-felbAAT-PB⑶-WPRE)或报道基因(AAV-po 1 yA-Ea 1 bAAT-Lucif erase-WPRE), (Hermens et al,1999 Hum Gene Ther. 10(11) :1885-91 ；and Gao et al 2002, Proc Natl Acad Sci USA，盟(18) :11854-9)产生 AAV2/8 载体。简而言之，通过磷酸钙，用pAdDeltaF6、p5E18_VD2/8和靶载体共转染293细胞，并且在转染后48小时， 通过冻融细胞，收获病毒。通过离子交换柱层析和碘克沙醇梯度离析随后过滤和针对磷酸缓冲盐溶液(PBQ-5%蔗糖进一步浓缩，纯化病毒。通过以三个重复进行的Q-PCR TaqMan(AppliedBiosystems)分析，利用引物 pr300fw5，CCCTGTTTGCTCCTCCGATAA3，pr301r ν 5，GTCCGTATTTAAGCAGTGGATCCA 3，扩增hAAT启动子区的95bp片段，测定基于基因组拷贝/ml的病毒滴度。通过十二烷基硫酸钠聚酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定蛋白质组成和纯度。1.1. 3实验设置初步测验为了测验感染能力和评估AAV2/8载体的PB⑶表达，用9xl012vg剂量的 AAV2/8-PB⑶注射2个AIP动物，并在第6天处死它们。原理验证测定(Proof-of-principle assay)通过比较注射AAV2/8-hB⑶后AIP小鼠肝中PB⑶表达水平，我们评估了 AAV2/8介导的肝转导。用总计100-200 μ 1对应于kl2vg/kgAAV2/8-hPB⑶或AAV2/8-荧光素酶对照载体，经由尾静脉静脉内注射12-25周龄的C57B1/6背景中的复合杂合体AIP小鼠(每组10只小鼠，5只雄性，5只雌性)。用5ellvg/kg或5el0vg/kg AAV2/8_hPBGD注射2个其他(与以前的年龄相同)5只AIP雄性小鼠组。包括额外的野生型和AIP小鼠组。剂量方案显示在表2中。表2.通过Q-PCR测定的所用的载体剂量(Gcs)
权利要求
1.包含编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的核酸，其中至少320个编码所述人胆色素原脱氨酶的密码子与SEQ ID NO 1中的密码子相同，或其中至少305个编码所述人胆色素原脱氨酶的密码子与SEQ ID NO :3中的密码子相同。
2.权利要求1的核酸，其中通过Needleman和^msch全局比对算法测定，所述编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列与SEQ ID NO :1或3的全长具有至少95%的相同性。
3.权利要求1或2的核酸，其中所述核苷酸序列编码SEQID NO :2或4的氨基酸序列。
4.权利要求3的核酸，其中所述核苷酸序列具有SEQID NO :1或3的核苷酸序列。
5.包含编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的核酸构建体，其中至少320个编码所述人胆色素原脱氨酶的密码子与SEQ ID NO 1中的密码子相同，或其中至少305个编码所述人胆色素原脱氨酶的密码子与SEQ ID NO :3中的密码子相同。
6.权利要求5的核酸构建体，其中通过Needleman和^msch全局比对算法测定，所述编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列与SEQ ID NO :1或3的全长具有至少95%的相同性。
7.权利要求5或6的核酸构建体，其中所述核苷酸序列编码SEQID NO :2或4的氨基酸序列。
8.权利要求7的核酸构建体，其中所述核苷酸序列具有SEQID NO :1或3的核苷酸序列。
9.权利要求5-8中任一项的核酸构建体，其中所述编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列可操作地连接于用于在人细胞中表达的启动子。
10.权利要求9的核酸构建体，其中所述启动子是肝特异性启动子。
11.权利要求10的核酸构建体，其中所述肝特异性启动子选自α1抗胰蛋白酶(AAT) 启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、白蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、肝控制区(HCR)-Ap0CII杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因增强子 (Ealb)元件组合的AAT启动子以及载脂蛋白E启动子。
12.权利要求11的核酸构建体，其中所述启动子具有SEQID NO 5的序列。
13.权利要求1-8中任一项的核酸构建体，其中所述构建体是病毒基因治疗载体的形式，优选细小病毒载体。
14.细小病毒病毒体，其包含权利要求1-4中任一项的核酸或权利要求5-13中任一项的核酸构建体。
15.权利要求14的细小病毒病毒体，其用作药物或用于人或动物体的治疗。
16.权利要求14或15的细小病毒病毒体，其用于治疗胆色素原脱氨酶缺乏所引起的疾病状况。
17.权利要求16的细小病毒病毒体，其中所述疾病状况是急性间歇性卟啉病。
18.药物组合物，其包含权利要求14的细小病毒病毒体和药学可接受载体。
19.权利要求14的细小病毒病毒体在制备用于治疗胆色素原脱氨酶缺乏所引起的疾病状况的药物中的用途。
20.用于将编码胆色素原脱氨酶的核苷酸序列送递到哺乳动物的方法，所述方法包括a.提供权利要求14的细小病毒病毒体或权利要求18的药物组合物；以及b.在使得蛋白以在所述哺乳动物中提供治疗效果的水平表达的条件下，给所述哺乳动物施用所述细小病毒病毒体。
21.治疗胆色素原脱氨酶缺乏所引起的疾病状况的方法，其中所述方法包括给患有胆色素原脱氨酶缺乏的对象施用有效量的权利要求14的细小病毒病毒体或权利要求18的药物组合物的步骤，优选地所述疾病状况是急性间歇性卟啉病。
全文摘要
本发明涉及编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列，所述序列经优化用于在哺乳动物细胞中更高地表达。本发明还涉及包含此类优化的合成编码序列的DNA构建体，其用于胆色素原脱氨酶缺乏所引起的诸如急性间歇性卟啉病的疾病状况的基因治疗。因此，本发明涉及包含编码人胆色素原脱氨酶的核苷酸序列的核酸或核酸构建体，其中至少320个编码人胆色素原脱氨酶的密码子与SEQ ID NO1中的密码子相同，或其中至少305个编码人胆色素原脱氨酶的密码子与SEQ ID NO3中的密码子相同。
文档编号C12N15/09GK102227500SQ200980147755
公开日2011年10月26日 申请日期2009年9月29日 优先权日2008年9月29日
发明者A·丰塔内利亚斯罗马, G·冈萨雷斯阿萨吉诺拉萨, H·彼得里, J·M·普列托巴尔图埃纳, J·特威斯克, M·A·帕内达罗德里格斯, M·S·罗德里格斯培尼亚, S·J·H·范德芬特 申请人:阿姆斯特丹分子治疗(Amt)有限公司, 顶端生物医药项目公司