专利名称：基因治疗载体和胞嘧啶脱氨酶的制作方法
技术领域：
本公开涉及修饰的胞嘧啶脱氨酶(⑶)。本公开还涉及表达此类修饰⑶的细胞和使用此类修饰CD治疗疾病和病症的方法。
背景技术：
酵母或细菌胞嘧啶脱氨酶将无毒性的抗生素前体药物5-FC转变成细胞毒性的化学治疗剂5-氟尿嘧啶(5-FU)。尚不知晓人(一般而言，哺乳动物)具有编码具有显著胞嘧啶脱氨酶活性的酶的天然存在基因。酵母和细菌胞嘧啶脱氨酶在使用基因递送和病毒载体用于递送酶、然后用5-FC治疗的癌症治疗中得到认可，其中5-FC然后被酶转变成细胞毒性药物(Miller 等，Can Res 62:773-780 2002 ;Kievit 等，Can Res 59:1417-1421 1999)。
发明内容
本文提供将5-FC转变成5-FU的多肽。还提供编码此类多肽的核酸分子、表达此类多肽的细胞、包含此类多核苷酸和多肽的载体以及适宜地使用此类多肽合成5-FU或其衍生物的方法。因此，在多个实施方案中，提供了包含具有SEQ ID NO :2所示序列的胞嘧啶脱氨酶的分离的或重组的多肽。在其它实施方案中，多肽包含具有选自A23L、V108I、I140L 及其任何组合的突变的SEQ ID NO :2。在又一实施方案中，多肽包含SEQ ID NO :4中所示序列并且包括除残基(a) 23、108和140之外的可达50、25、10或5个保守氨基酸取代。通常，本文提供的多肽表现出用于将5-FC转变成5-FU的胞嘧啶脱氨酶活性。本公开还提供包含与SEQ ID而4至少80%、90%、95%、98%或99%相同的序列的多肽，其中多肽在第^位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸，并且其中多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。在又一实施方案中，多肽包含SEQ ID N0:4中所示序列。本公开还提供包含可操作连接至尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)或乳清酸磷酸核糖基转移酶(OPRT)的任何一种前述多肽的融合构建体。在一个实施方案中，融合构建体包含连接至具有UPRT或OPRT活性的第二多肽的第一多肽，所述第一多肽包含具有选自 A23L、V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQ ID NO :2。在又一实施方案中，融合构建体包含具有SEQ ID NO 4中所示序列的第一多肽并且包括除残基23、108和140之外可达 50、25、10或5个保守氨基酸取代，其中第一多肽连接至具有UPRT或OPRT活性的第二多肽。 本公开还提供融合构建体，其包含具有胞嘧啶脱氨酶活性并且含有与SEQ ID N0:4至少 80 %、90 %、95 %、98 %或99 %相同的序列的第一多肽，其中该多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸，并且其中第一多肽连接至包含UPRT 或OPRT活性的第二多肽。在一个实施方案中，具有UPRT或OPRT活性的多肽包含分别在 SEQ ID N0:8和10中所示序列或其变体。在又一实施方案中，包含胞嘧啶脱氨酶活性的第一多肽连接至具有UPRT或OPRT活性的多肽，其中多肽通过肽连接体分开。在另一实施方案中，融合构建体包含选自SEQ ID NO: 12、14、16或18的序列。本公开还提供编码任何前述多肽的多核苷酸。例如，本公开提供多核苷酸，所述多核苷酸编码包含具有选自A23L、V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQ ID NO :2的多肽。在又一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQ ID NO :4所示序列的多肽并且包括除残基 (a) 23、108和140外可达50、25、10或5个保守氨基酸取代。在进一步的实施方案中，本公开提供多核苷酸，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID而4至少80%、90%、95%、98%或99% 相同的序列的多肽，其中多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140 位具有亮氨酸，并且其中多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。在又一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQ ID NO :4的多肽。在又一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQ ID NO :4、6、8、10、11、 12或13所示序列的多肽。本公开提供编码胞嘧啶脱氨酶的人密码子优化的多核苷酸。在一个实施方案中， 人密码子优化的多核苷酸包含SEQ ID NO :3所示序列。在又一实施方案中，多核苷酸包含 SEQ ID N0:5、7或9所示序列。在其它实施方案中，本公开的胞嘧啶脱氨酶或融合构建体使用基因递送系统 (GDS)递送。在另一方面中，编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸使用其为病毒或病毒衍生载体的 GDS递送。病毒载体可以是复制型或者非复制型，并且可以是腺病毒载体、麻疹病毒载体、 疱疹病毒载体、反转录病毒载体(包括慢病毒载体)、弹状病毒载体例如水泡性口炎病毒载体、呼肠孤病毒载体、矽尼卡谷病毒载体、痘病毒载体(包括动物疹或痘病毒衍生的载体)、 细小病毒属载体(包括AAV载体)、甲病毒属载体或本领域技术人员已知的其它病毒载体。 在一个实施方案中，病毒载体可以是能感染正在复制的哺乳动物细胞的可复制型反转录病毒载体。可复制型反转录病毒载体可以包括正反转录病毒(Orthoretrovirus)或更有代表性的Y反转录病毒载体。在一个方面中，可复制型反转录病毒载体包含在编码本公开胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸5’端的内部核糖体进入位点(IREQ。在一个实施方案中，编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸在反转录病毒载体ENV多核苷酸的3’端。在其它实施方案中，提供用本公开的胞嘧啶脱氨酶或融合构建体或者包括本公开多核苷酸或融合构建体的载体转染的宿主细胞。宿主细胞包括真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。宿主细胞还包括原核细胞，例如细菌细胞。本公开还提供治疗细胞增殖性病症(包括癌症)的方法，包括向受试者施用本公开的多核苷酸或多肽和使受试者接触包含5-氟胞嘧啶(5-FC)的细胞毒性药物。本公开提供重组的可复制型反转录病毒(RCR)，包含反转录病毒GAG蛋白；反转录病毒POL蛋白；反转录病毒包膜；包含位于反转录病毒多核苷酸序列3'端的长末端重复 (LTR)序列、位于反转录病毒多核苷酸5'端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构域和erw核酸结构域的反转录病毒多核苷酸，所述启动子适宜于在哺乳动物细胞中表达； 包含可操作连接至异源多核苷酸的内部核糖体进入位点(IRES)的盒，其中盒位于3' LTR 的5'端并且位于编码反转录病毒包膜的erw核酸结构域的3'端；和在靶细胞内进行反转录、包装和整合必需的顺式作用序列，其中与PACE载体(SEQ ID NO :21)相比，RCR在6 次传代后保持了较高的复制能力。在一个实施方案中，反转录病毒多核苷酸序列衍生自鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫科白血病病毒或长臂猿白血病病毒 (GALV)。在另一实施方案中，MLV是双嗜性MLV。在又一实施方案中，反转录病毒是致癌反转录病毒。在又一实施方案中，靶细胞是具有细胞增殖性病症的细胞。细胞增殖性病症可以选自，但不限于，肺癌、结肠-直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、 胰腺癌、黑素瘤、胃癌和卵巢癌、类风湿性关节炎和其它自身免疫病。在一个实施方案中，启动子包括具有SEQ ID NO 19、20或22的从核苷酸1至大约核苷酸582所示序列的CMV启动子并且可包括对一个或更多个核酸碱基的修饰，所述启动子能够指导和起始转录。在仍然进一步的实施方案中，启动子包含SEQ ID NO: 19、20或22从核苷酸1至大约核苷酸582 所示序列。在又一实施方案中，启动子包含CMV-R-TO结构域多核苷酸。在一个实施方案中， CMV-R-U5结构域包含连接至MLV R-U5区的人巨细胞病毒立即早期启动子。在又一实施方案中，CMV-R-U5结构域多核苷酸包含SEQ ID NO :19、20或22从大约核苷酸1至大约核苷酸1202所示序列或者与SEQ ID NO :19、20或22所示序列至少95%相同的序列，其中多核苷酸促进与其可操作连接的核酸分子的转录。在另一实施方案中，所述多核苷酸的gag和 pol衍生自致癌反转录病毒。gag核酸结构域可包含SEQ ID NO 19从大约核苷酸1203至大约核苷酸观19的序列或者与其具有至少95^^98^^99%或99. 8%同一性的序列。pol 结构域可包含SEQ ID NO :19从大约核苷酸洲20至大约核苷酸6358的序列或与其具有至少95%、98%、99%或99. 9%同一性的序列。在一个实施方案中，env结构域编码两性env 蛋白质。env结构域可包含SEQ ID NO :19从大约核苷酸6359至大约核苷酸8323的序列或与其具有至少95 %、98 %、99 %或99. 8 %同一性的序列。载体的IRES结构域可以是任何 IRES，然而，在一个实施方案中，IRES衍生自脑心肌炎病毒。在又一实施方案中，IRES包含 SEQ ID NO :19从大约核苷酸8327至大约核苷酸8876的序列或与其具有至少95^^98%或 99%同一性的序列。在仍然进一步的实施方案中，异源多核苷酸包括具有SEQ ID NO :3,5, 11、13、15或17所示序列的多核苷酸。在又一实施方案中，异源序列编码包含SEQ ID NO 4 所示序列的多肽。异源核酸是人密码子优化的并且编码如SEQ ID NO :4中所示多肽。在又一实施方案中，异源核酸包含SEQ ID NO: 19从大约核苷酸8877至大约9353所示序列。在一个实施方案中，3’ LTR衍生自致癌反转录病毒。在又一实施方案中，3’ LTR包含U3-R-U5 结构域。在仍然进一步的实施方案中，3，LTR包含SEQ ID NO 19从大约核苷酸9405至大约9998所示序列或与其至少95%、98%或99. 5%相同的序列。本公开提供包含SEQ ID NO :19,20或22所示序列的多核苷酸。本公开提供分离的多核苷酸，从5’至3’包含人巨细胞病毒立即早期启动子与 MLV R-U5区的CMV-R-U5融合物；PBS，对于反转录酶的引物结合位点；5’剪接位点；Ψ包装信号；MLV组特异性抗原的gag编码序列；MLV聚合酶多蛋白的pol编码序列；3’剪接位点； MLV株4070A包膜蛋白的4070A env编码序列；来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点 (IRES)；修饰的胞嘧啶脱氨酶编码序列；多嘌呤段；和U3-R-U5 MLV长末端重复。本公开提供治疗患有细胞增殖性病症的受试者的方法，包括使受试者与具有胞嘧啶脱氨酶活性的本公开多肽的多核苷酸在多核苷酸表达的条件下接触，和使受试者与 5-氟胞嘧啶接触。
本公开还提供治疗受试者中细胞增殖性病症的方法，包括使受试者与本公开的反转录病毒接触，其中异源核酸序列编码抑制赘生性细胞增殖的治疗蛋白质。在一个实施方案中，反转录病毒包含编码具有SEQ ID NO :4、12、14、16或18所示序列的多肽的多核苷酸。本公开的一个或更多个实施方案的细节在附图
和下面的说明书中描述。根据说明书和附图以及根据权利要求书，其它特征、目的和优点将是显而易见的。附图简述图IA-D显示(a)本公开重组反转录病毒载体的示意图；(b)本公开多核苷酸的质粒图谱；(c和d)本公开的多核苷酸的序列(SEQ ID NO 19)。图2A-D显示包含具有⑶、OPRT和UPRT活性的多肽的本公开各个实施方案产生的方案。图3显示观察到与感染的U-87细胞内野生型y⑶蛋白相比y⑶2蛋白水平更高。图4显示包含本公开⑶多肽的载体的稳定性和与本公开的其它载体的比较。图5A-B显示，当感染的细胞暴露于增加水平的5-FC时，与野生型y⑶活性 (T5. 0007)相比，本公开的胞嘧啶脱氨酶活性和载体提供相当的或更好的表达，并且因此杀死感染的大鼠RG2 (5A)或U87细胞(5B)。图6显示感染的U87细胞内T5. 0002 (yCD2)的比活性高于T5. 0001 (部分优化的 yCD)，T5. 0001 高于 T5. 0007 (野生型 yCD)。不同图中相同参考符号表示着相同的元素。详细描述如本文和后附权利要求书中所使用，单数形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“该(the) ” 包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，当提到“一细胞(a cell)”时包括多数的此类细胞并且当提到“该试剂(the agent)”时包括提到本领域技术人员已知的一种或多种试剂，等等。同样，“或”的使用意思是指“和/或”，除非另外说明。类似地，“包含/包括 (comprise，comprises，comprising)，，、“包括(includes，including)，，可互换并且不旨在是限制性的。还应当进一步理解，当使用术语“包含/包括”描述各种实施方案时，本领域技术人员将理解在一些特别情况下实施方案可选地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”描述。除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施所公开的方法和组合物，但是本文描述示例性的方法、装置和材料。上面以及本文通篇所讨论的出版物被提供，原因仅仅在于它们的公开先于本申请的提交日。但无论如何不能解释为承认发明人因在先公开而无权占先于此类公开。胞嘧啶脱氨酶(EC 3. 5. 4. 1)是催化下列化学反应的酶胞嘧啶+H2O —尿嘧啶+NH3因此，该酶的两个底物是胞嘧啶和H2O,而其两个产物是尿嘧啶和NH3。该酶属于水解酶家族，这些酶作用于肽键之外的碳-氮键，特别是环脒中的碳-氮键。该酶类的系统名称是胞嘧啶氨基水解酶。该酶也叫作异胞嘧啶脱氨酶。该酶参与嘧啶代谢。
更加具体而言，胞嘧啶脱氨酶是参与嘧啶代谢途径的酶，通过该酶外源胞嘧啶经水解脱氨基作用转化成尿嘧啶。了胞嘧啶脱氨酶(CD酶或CD)活性已经展示于原核生物和低等真核生物中，但是它们在哺乳动物中缺乏(Koechlin等，1966，Biochem. Pharmacol. 15,435-446 ；Polak 等，1976，Chemotherapy 22，137-153)。分别编码酿酒酵母和大肠杆菌两种生物CD酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae, S. cerevisiae) FCYl基因和大肠杆菌(E. colDcoda基因是已知的并且它们的序列已经公布(EP 402 108 ； Erbs 等，1997，Curr. Genet. 31，1-6 ;W0 93/01281)。CD 酶也将胞嘧啶类似物 5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨成为5-氟尿嘧啶(5-FU)，其是高度细胞毒性的化合物，特别是当其被转变成5-氟-UMP(5-FUMP)时。因为编码该酶的基因的钝化突变或者因为该酶天然缺乏 (例如哺乳动物细胞)而缺乏CD酶活性的细胞对5-FC有抗性(Jund和Lacroute, 1970， J. Bacteriol. 102，607-615 ；Kilstrup 等，1989，J. Bacteriol.，171,2124-2127)。另一方面，已经证明可以将5-FC敏感性传递给已经转移入编码⑶酶活性的序列的哺乳动物细胞 (Huber 等，1993，Cancer Res. 53，4619-4626 ；Mullen 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,33-37 ；WO 93/0U81)。因此，⑶的使用在基因治疗、特别是抗癌基因治疗情况下是有利的。然而，5-FC敏感性取决于细胞系而极大不同。在例如以表达大肠杆菌coda基因的反转录病毒转导的PANC-I (胰腺的癌)和SK-BR-3 (乳腺癌)人肿瘤细胞系中观察到低敏感性(Harris等，1994，Gene Therapy 1，170-175)。该现象被解释为由CD酶的酶作用所形成的5-FU向细胞毒性5-FUMP的内源转变缺乏或差。在哺乳动物细胞中正常由乳清酸磷酸核糖基转移酶(0PRT酶)实现的这一步骤可能在某些肿瘤中缺乏并且因此使得基于 CD酶的基因治疗无效。在原核生物和低等真核生物中，通过尿嘧啶磷酸核糖基转移酶的作用(UPRT酶活性)尿嘧啶被转变成UMP0该酶也将5-FU转变成5-FUMP。重要的是，细菌尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRT)与哺乳动物细胞的乳清酸磷酸核糖基转移酶(OPRT)或尿苷-5'- 一磷酸合酶功能等效。这些酶介导5-氟尿嘧啶(5-FU)(尿嘧啶的氟化类似物) 向5-氟尿苷5' —磷酸(5-FUMP)的转变。5-氟尿苷5' —磷酸之后通过哺乳动物嘧啶从头合成途径被转变成5-FdUDP和FdUTP。每一 5-FdUTP是胸苷酸合酶(Thy-A)的不可逆抑制剂并且导致dTTP饥饿。广泛公认的是，这种转变是实现5-氟尿嘧啶的细胞毒性作用必需途径之一并且细菌来源的细菌尿嘧啶磷酸核糖基转移酶能够向哺乳动物乳清酸磷酸核糖转移酶一样将5-氟尿嘧啶转变成相同的活性代谢物。在UPRT酶活性或OPRT酶活性缺乏情况下，源于5-FC被CD酶的脱氨作用产生的5-FU不被转变成细胞毒性的5-FUMP(Jimd 和 Lacroute，1970, J.Bacteriol. 102，607-615)。如本文所述，本公开提供编码多肽的多核苷酸和包含具有胞嘧啶脱氨酶活性的第一多肽与包含UPRT或OPRT活性的第二多肽融合的多肽。此种融合构建体可用于将尿嘧啶或其衍生物转变成一磷酸类似物，并且具体而言将5-FU转变成5-FUMP。如将在下面更加详细地描述，本公开至少部分地基于催化5-FC转变成5-FU的新的多肽的产生和表达。在一个实施方案中，提供了已经被工程改造而具有将5-FC转变成5-FU的改良催化特性的新多肽。此种多肽包括已经被改变成在指定残基处包括氨基酸取代的变体。虽然这些变体将在下面更加详细地描述，但是应当理解，本公开的多肽可包含一个或更多个修饰的氨基酸。修饰的氨基酸的存在将在例如(a)增加多肽体内半寿期，(b)降低或增加多肽抗原性，和(C)增加多肽保存稳定性中是有利的。一个或多个氨基酸通过例如重组产生过程中的共翻译或者翻译后修饰(例如在哺乳动物细胞中在表达过程中N-X-S/T基序处的N-连接糖基化)或者通过合成手段修饰。因此，“突变体”、“变体” 或者“修饰的”蛋白质、酶、多核苷酸、基因或者细胞意思是指已经被改变或衍生，或者以一定方式与亲本蛋白质、酶、多核苷酸、基因或者细胞不同或者改变的蛋白质、酶、多核苷酸、 基因或细胞。突变体或修饰的蛋白质或酶通常，虽然不是必须，从突变体多核苷酸或基因表达。“突变”意思是指产生突变体蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞的任何过程或者机制。这包括其中蛋白质、酶、多核苷酸或基因序列被改变的任何突变，和源于此突变的在细胞中的任何可检测的改变。有代表性地，突变以单个或多个核苷酸残基的点突变、缺失或插入出现在多核苷酸或者基因序列中。突变包括基因的蛋白质编码区内出现的多核苷酸改变以及蛋白质编码区序列外的区域(例如但不限于调节序列或启动子序列)的改变。基因中的突变可以是“沉默的”，即不反映在表达时的氨基酸改变，产生基因的“序列保守”变体。这通常在一个氨基酸对应于一个以上密码子时发生。修饰的氨基酸的非限定性实例包括糖基化氨基酸、硫酸化氨基酸、异戊二烯化 (例如法呢基化、栊牛儿基栊牛儿基化)氨基酸、乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸，等等。足以指导技术人员修饰氨基酸的参考文献在文献中到处都是。实例方案存在于Walker (1998) ftOtein Protocols on CD-ROM (Humana Press, Towata, N. J.)中。本文描述了用于产生、分离和使用本公开的修饰的CD多肽和多核苷酸的重组方法。除了重组生产外，多肽可以通过使用固相技术的直接肽合成(例如，Stewart等(1969) Solid-Phase Peptide Synthesis(WH Freeman Co,San Francisco)；禾口Merrifield(1963) J. Am. Chem.SoC. 85 :2149-2154)产生。肽合成可以使用手工技术开展或者自动开展。自动合成可以使用例如 Applied Biosystems 431 肽合成仪(Perkin Elmer, Foster City, Calif.)按照制造商提供的说明书实现。通过例证方式，编码大肠杆菌(Anderson等，1992，Eur. J. Biochem 204，51-56)、 乳酸链球菌(Lactococcus lactis) (Martinussen 禾口 Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457-6463)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis) (Kim 等，1997，Biochem Mol. Biol. Int 41,1117-1124)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) (Martinussen 等，1995， J. Bacteriol. 177，271-274) UPRT酶的核酸序列可以在本公开背景中使用。然而，使用酵母 UPRT酶，并且特别是由酿酒酵母FURl基因编码的UPRT酶，其序列公开于Kern等(1990， Gene 88，149-157)中，通过引用整合入本文。通过明示方式，基因的序列和相应UPRT酶的那些序列可以在文献中和专门的数据库(SWISSPR0T，EMBL,Genbank Medline，等)中找到。在本文中互换使用的术语“蛋白质”或“多肽”包含称作氨基酸的化学结构块通过称作肽键的化学键连接在一起的一个链或更多个链。“酶”意思是指尤其是或多或少催化或促进一种或更多种化学或生物化学反应的任何物质，优选全部或大部分由蛋白质组成。术语“酶”还可指催化多核苷酸(例如RNA或DNA)。“天然”或“野生型”蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞意思是指天然存在的蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞。因此，在几个实施方案中，提供分离的或重组的多肽，其包含具有选自A23L、
11V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQ ID NO :2。在又一实施方案中，多肽包含SEQ ID NO 4中所示序列并且包括除残基(a) 23、108和140外可达50、25、10或5个保守氨基酸替代。通常，本文提供的多肽表现出用于将5-FC转变成5-FU的胞嘧啶脱氨酶活性。本公开还提供包含与SEQ ID NO :4至少80%、90%、95%、98%或99%相同的序列的多肽，其中多肽在第^位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸，并且其中多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。在又一实施方案中，多肽包含SEQ ID N0:4中所示序列。本公开还提供包含可操作连接至尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)或乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)的任何一个前述多肽的融合构建体。在一个实施方案中，融合构建体包含连接至具有UPRT或OPRT活性的第二多肽的第一多肽，所述第一多肽包含具有选自A23L、 V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQ ID NO :2。在又一实施方案中，融合构建体包含具有SEQ ID NO :4中所示序列并且包括除残基23、108和140之外可达50、25、10或5个保守氨基酸替代的第一多肽，其中第一多肽连接至具有UPRT或OPRT活性的第二多肽。本公开还提供融合构建体，其包含具有胞嘧啶脱氨酶活性并包含与SEQ ID而彳至少日。1^、^1^、 95%、98%或99%相同的序列的第一多肽，其中多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸，并且其中第一多肽连接至包含UPRT或OPRT活性的第二多肽。在一个实施方案中，具有UPRT或OPRT活性的多肽分别包含SEQ ID NO 8和 10所示序列或其变体。在又一实施方案中，包含胞嘧啶脱氨酶活性的第一多肽连接至具有 UPRT或OPRT活性的多肽，其中多肽通过肽连接体分开。在另一实施方案中，融合构建体包含选自SEQ ID NO 11,12或13的序列。术语“可操作连接”或“可操作结合”指调节序列与调节序列所调节多核苷酸之间或者两个不同的多肽或编码此种多肽的多核苷酸之间的功能性连接或者结合。包含具有⑶活性多肽和包含UPRT或OPRT活性多肽的融合构建体可以被工程改造成包含切割位点以帮助蛋白质回收或者其他连接体部分。有代表性地，连接体将是肽连接体部分。连接体部分的长度被选择来优化⑶多肽和UPRT或OPRT多肽的生物学活性，并且可以无需过度实验而经验性确定。连接体部分应该足够长且足够灵活以便底物与⑶多肽相互作用以及底物与UPRT或OPRT多肽相互作用。连接体部分是长度上大约1个和30个氨基酸残基之间，有代表性的大约2个和15个氨基酸残基之间的肽。连接体部分的实例是一Gly—Gly—、GGGGS(SEQ ID NO :22)、(GGGGS)n(SEQ ID NO :23)、 (SGGGG)n (SEQ ID NO :24)、GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO 25), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO: 26)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO :27)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO :28)或 EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO :29)。连接部分描述于例如 Huston 等，Proc. Nat' 1 Acad. Sci 85 :5879,1988 ；Whitlow 等，Protein Engineering 6 :989,1993 ；和 Newton 等， Biochemistry 35 =545,1996中。其他适宜的肽连接体是描述于美国专利号4，751，180和 4，935，233中的那些，该两篇文献通过引用并入本文。编码期望肽连接体的DNA序列可以使用任何适宜的常规技术以与编码CD多肽和后随UPRT或OPRT多肽的多核苷酸相同的读码框插入在编码⑶多肽和后随UPRT或OPRT多肽的多核苷酸之间。例如，编码连接体的化学合成的寡核苷酸可以连接在两个编码多核苷酸之间。在特别的实施方案中，包含2至4个分开结构域(例如CD结构域和UPRT或0PRT)的融合多肽由肽连接体分开。
特定序列的“保守氨基酸取代”或简单地说“保守变异”指一个氨基酸或系列氨基酸被基本相同的氨基酸序列置换。技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或一定百分比的氨基酸的各个取代、缺失或添加导致在其中改变导致氨基酸缺失、氨基酸添加或以化学相似氨基酸进行氨基酸取代的“保守变体”。提供功能相似的氨基酸的保守取代表在本领域众所周知。例如，一个保守取代组包括丙氨酸(A)、丝氨酸( 和苏氨酸(T)。另一保守取代组包括天冬氨酸(D)和谷氨酸 (E)。另一保守取代组包括天冬酰胺(N)和谷氨酰胺⑴)。又一保守取代组包括精氨酸(R) 和赖氨酸(K)。另一保守取代组包括异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)。 另一保守取代组包括苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。因此，所列多肽序列(例如SEQ ID NO :2、4、6、8、10、11、12、13等)的“保守氨基酸取代”包括以同一保守取代组的保守选择氨基酸对多肽序列氨基酸的一定百分比进行取代，有代表性地小于10%。因此，本公开多肽的保守取代变异可包含以同一保守取代组的保守取代变异进行的100、75、50、25或10个取代。酶的“活性”是其催化反应的能力(即“功能”)的量度，并且可以表示为产生反应产物的速率。例如，酶活性可以表示为每单位时间或每单位酶产生的产物的量(例如浓度或重量)或者以亲和性或解离常数表示。如在本文可互换使用，“胞嘧啶脱氨酶活性”、“胞嘧啶脱氨酶生物学活性”或“胞嘧啶脱氨酶功能活性”指根据标准技术体内或体外测定的、由本公开的胞嘧啶脱氨酶蛋白或多肽对胞嘧啶脱氨酶底物所发挥的活性。用于测量胞嘧啶脱氨酶活性的测定法在本领域已知。例如，胞嘧啶脱氨酶活性可以通过测定5-FC转变成5-FU 或胞嘧啶转变成尿嘧啶的速率来测量。5-FC、5-FU、胞嘧啶和尿嘧啶的检测可以通过层析和本领域已知的其它方法开展。本领域技术人员将理解，所公开的核酸构建体的许多保守变异产生功能相同的构建体。例如，如上所述，由于遗传密码子的简并性，“沉默取代”(即核酸序列中的不导致所编码多肽改变的取代)是编码氨基酸的每一核酸序列的隐含特征。本领域技术人员将理解， 由于遗传密码子的简并性，可以产生许多编码修饰的本公开胞嘧啶脱氨酶多肽的核苷酸序列，它们当中一些与本文所明确公开核酸序列具有相当大的同一性。例如，密码子AGA、AGG、 CGA、CGC、CGG和CGU均编码精氨酸。因此，在本公开核酸中密码子指定为精氨酸的每一位置中，密码子可以改变成上述的相应密码子而不改变所编码的多肽。应当理解，RNA序列中的U对应于DNA序列中的T。相似的，在氨基酸序列中一个或少数几个氨基酸的“保守氨基酸取代”是以具有高度相似特性的不同氨基酸的取代，并且由于与所公开构建体高度相似也容易鉴定。每一所公开序列的此类保守变异是本文所提供多肽的一特征。“保守变体”是这样的蛋白质或酶，其中给定氨基酸残基已经被改变而没有改变蛋白质或酶的总体构象和功能，包括但不限于以具有相似特性(包括极性或非极性特征、 大小、形状和电荷)的氨基酸进行的氨基酸取代。在蛋白质或酶中除了所指出为保守的那些氨基酸之外的氨基酸可不同，使得任何两个相似功能的蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分数可变化并且可以是例如至少30%、至少50%、至少70%、至少80%或至少90%，如根据比对方案所测定。如本文中所提到，“序列相似性”意思是指核苷酸或蛋白质序列相关的程度。两个序列之间的相似性程度可以基于序列同一性和/或保守百分数。本文中的“序列同一性”意思是指两个核苷酸或氨基酸序列不变化的程度。“序列比对”意思是指为了评价相似性程度将两个或更多个序列排队以达到最大同一性(并且对于氨基酸序列而言为保守性)水平的过程。用于比对序列和评价相似性/同一性的许多方法在本领域中是已知的，例如其中相似性基于MEGALIGN算法的Cluster方法以及BLASTN、 BLASTP 和 FASTA (Lipman 和 Pearson, 1985 ；Pearson 和 Lipman，1988)。当使用所有的这些程序时，优选的设置是导致最高序列相似性的那些设置。例如，对于特定的所比对氨基酸序列对，“同一性”或“同一性百分数”可以指通过ClustalW分析(W 1. 8版，可从European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK得到)得到的氨基酸序列同一性百分数，所述分析为计算比对中相同匹配的数量并将此相同匹配的数量除以(i)所比对序列的长度和 ( )96的较大者，并且使用下列默认ClustalW参数以实现慢/精确配对比对-缺口罚分 10 ；缺口延长罚分0. 10 ；蛋白质加权矩阵=Gonnet series ；DNA加权矩阵=IUB ；切换慢/快配对比对=SLOW 或 FULL Alignment。当两个序列使用所确定的氨基酸取代矩阵(例如BL0SUM62)、缺口存在罚分和缺口延长罚分以便得到对于该序列对的可能的最高分数进行相似性得分比对时，该两个序列是“最佳比对的”。氨基酸取代矩阵及它们在定量两个序列之间相似性中的使用是本领域众所周知的并且描述于例如Dayhoff等(1978)，“ Atlas of Protein Sequence and Structure,“第 5 卷，增刊 3 (编者 Μ. 0. Dayhoff)第 345-352 页的〃 A model of evolutionary change in proteins " , Natl. Biomed. Res. Found. , Washington, D. C.禾口 Henikoff 等(1992) Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. USA 89 :10915-10919 中。BL0SUM62 矩阵(图 10)常常用作序列比对方案例如Gapped BLAST 2. O中的默认得分取代矩阵。对于向所比对序列之一引入单个氨基酸缺口赋予缺口存在罚分，并且对于插入在已经开放的缺口中的每一额外的空氨基酸位置赋予缺口延长罚分。比对由每一序列中比对开始和结束的氨基酸位置限定，并且任选地，由在一个或两个序列中插入缺口或多个缺口以得到最高可能得分限定。虽然最佳比对和得分可以人工实现，但是通过使用计算机执行的比对算法，如描述于 Altschul 等(1997) Nucl. Acids Res. 25 :3389-3402 并且可在 National Center for Biotechnology Information (NCBI)网址(www.ncbi.nlm.nih.gov)公开获得的 gapped BLAST 2. O容易地开展。最佳比对，包括多重比对，可以使用例如通过NCBl网站可获得并且描述于 Altschul 等(1997) Nucl. Acids Res. 25 :3389-3402 中的 PSI-BLAST 进行。对于与参照序列最佳比对的氨基酸序列，氨基酸残基“对应于”参照序列中在比对中残基与其配对的位置。“位置”由数字表示，该数字基于参照序列中每一氨基酸相对于 N-末端的位置顺序确定每一氨基酸。由于当确定最佳比对时必须考虑的缺失、插入、截断、 融合等原因，如通过简单地从N-末端开始计数所确定，通常测试序列中氨基酸残基数字将不必要与参照序列中的其对应位置的数字相同。例如，在所比对测试序列中存在缺失的情况下，在发生缺失位点处将没有氨基酸对应于参照序列中的位置。在所比对参照序列中存在插入的情况下，该插入将不对应于参照序列中的任何氨基酸位置。在截断或融合的情况下，在参照序列或者比对序列中存在不对应相应序列中任何氨基酸的氨基酸序列段。特定多肽的非保守修饰是未表征为保守取代的任何氨基酸取代的那些修饰。例如，跨上述6个组边界的任何取代。这包括碱性或酸性氨基酸取代中性氨基酸(例如Asp、 Glu、Asn或Gln取代Val、lie、Leu或Met)、芳香族氨基酸取代碱性或酸性氨基酸(例如Phe, Tyr或Trp取代Asp、Asn, Glu或Gln)或者不以相似氨基酸置换氨基酸的任何其它取代。碱性侧链包括赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)；酸性侧链包括天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；不带电荷的极性侧链包括甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺⑴)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)；非极性侧链包括丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、 异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W) ；β分支侧链包括苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)；芳香族侧链包括酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、 组氨酸(H)。因此，在多肽中特定位置上的一些氨基酸残基被从保守氨基酸取代“排除”。例如， 本公开提供包含SEQ ID NO :4所示序列的多肽。在一些实施方案中，多肽可以以如上所述保守氨基酸取代来改变，然而，期望某些残基不被取代，例如位置23、108和140上的残基。“亲本”蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞是使用任何方法、工具或技术从其衍生或制造任何其它蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞的任何蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞，并且不管亲本自身是天然的还是突变体。亲本多核苷酸或基因标码亲本蛋白质或酶。当多核苷酸、多肽或其它成分部分或者完全地与其所天然伴随的成分(其它蛋白质、核酸、细胞、合成试剂等)分开时，则多核苷酸、多肽或其它成分是“分离的”。当核酸或多肽是人工的或者工程化的或者衍生自人工的或者工程化的蛋白质或核酸时，则核酸或多肽是“重组体”。例如，插入至载体或者任何其它异源位置(例如重组生物的基因组中)使得其与天然发现在正常情况下位于多核苷酸侧翼的核苷酸序列不再相关的多核苷酸是重组多核苷酸。从重组多核苷酸体外或体内表达的蛋白质是重组多肽的实例。同样，天然不存在的多核苷酸序列(例如天然存在基因的变体)是重组体。在其它实施方案中，提供编码本公开胞嘧啶脱氨酶多肽或融合构建体的分离的多核苷酸。在一个方面中，本公开提供分离的或重组的多核苷酸，在本文中称作“CD优化的多核苷酸”、“CD多核苷酸”或“CD-融合多核苷酸”。术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸分子”用于指核苷酸(A、C、T、U、G等或者天然存在或人工的核苷酸类似物)的聚合物，例如 DNA或RNA，或者其表示法，例如字符串等，这取决于相关的语境。给定的多核苷酸或互补多核苷酸可以从任何指定的核苷酸序列确定。本公开的一个实施方案涉及编码胞嘧啶脱氨酶或者突变体胞嘧啶脱氨酶多肽或其生物学活性部分的分离的多核苷酸。如本文所使用，术语“核酸分子”或者“多核苷酸”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA和RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或者双链的。在一个实施方案中，CD优化的多核苷酸或CD多核苷酸包括从生物体如细菌或酵母菌株分离的天然存在核酸的重组、工程化或分离形式。示例性的CD多核苷酸包括编码 SEQ ID NO :2中所示野生型多肽的那些。在本公开的另一实施方案中，⑶多核苷酸通过将一个或更多个天然存在的、分离的或者重组的CD多核苷酸多样化(例如重组和/或突变) 而产生。如在本文别处更加详细地描述，可以产生这样的多样化CD多核苷酸，其编码具有优良功能特性(例如与用作多样化过程中本源或亲本的CD多核苷酸所编码多肽相比提高的催化功能、提高的稳定性或者更高表达水平)的CD多肽。示例性的多核苷酸包括SEQ ID NO 3和5和编码本公开⑶变体多肽的那些。本公开的多核苷酸在例如本公开⑶多肽的重组产生(即表达)中具有多种多样
15的用途，并且用作进一步多样化产生(例如重组反应或突变反应)以便产生新的和/或改良的CD同系物的本源物等等。重要的是注意到，CD多核苷酸的某些特定的、重要的和可信的用途不需要多核苷酸编码具有相当大的CD活性或者甚至变体CD活性的多肽。例如，不编码活性酶的CD多核苷酸可以是用于多样化过程中以取得具有期望功能特性(例如高k。at或k。at/Km、低Km、对热和其它环境因素的高稳定性、高转录或翻译速率、抵抗蛋白水解切割等)的CD多核苷酸变体或非CD多核苷酸的亲本多核苷酸的宝贵来源。CD多核苷酸，包括编码CD多肽和其变体、CD多肽片段、相关融合蛋白或其功能等效物的核苷酸序列，用于指导⑶多肽在适宜宿主细胞如细菌细胞中表达的重组DNA分子中。由于遗传密码子的固有简并性，编码基本相同或者功能等效氨基酸序列的其它核酸序列也可以用于克隆和表达⑶多核苷酸。术语“宿主细胞”，如本文所使用，包括易于以核酸构建体转化的任何细胞类型。术语“转化”意思是指引入外源(即外面的或细胞外的)基因、DNA或RNA序列至宿主细胞中，使得宿主细胞将表达所引入的基因或序列以产生期望的物质，有代表性地是由所引入基因或序列编码的蛋白质或酶。所引入的基因或序列可包括调节或控制序列，例如起始序列、终止序列、启动子序列、信号序列、分泌序列或细胞遗传机器所使用的其它序列。接受并表达所引入DNA或RNA的宿主细胞已经“被转化”并且是“转化体”或“克隆”。引入至宿主细胞的DNA或RNA可以来自任何来源，包括与宿主细胞相同属或种的细胞，或者不同属或种的细胞。如本领域技术人员将理解的那样，修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达可以是有利的。遗传密码子是冗余的，有64种可能的密码子，但是大多数生物体优先使用这些密码子的亚组。在物种中最经常使用的密码子称作最佳密码子，并且不十分经常使用的那些密码子归类为稀有或者低利用密码子(见例如^iang等(1991)Gene 105:61-72)。密码子可以被取代以表现宿主的优先密码子使用，这是一个有时被称作“密码子优化”或者 “控制物种密码子偏倚性”的过程。可以制备包含特定原核或真核宿主优选的密码子的优化的编码序列(还可见 Murray等(1989) Nucl. Acids Res. 17 :477-508)，以例如增加翻译速度或者产生具有期望特征(例如与从非优化序列产生的转录物相比更长的半寿期)的重组RNA转录物。还可以修饰翻译终止密码子以表现宿主偏倚性。例如，对于酿酒酵母(S. cerevisiae)和哺乳动物的优选终止密码子分别是UAA和UGA。对于单子叶植物的优选终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌优选使用UAA作为终止密码子(Dalphin等(1996) Nucl. Acids Res. 24 :216-218)。密码子使用偏倚性指蛋白质编码性DNA序列(基因)中密码子存在频率在生物体当中的差异。密码子是编码多肽链中特定氨基酸残基的一系列三个核苷酸(三联体)。由于在DNA中有四种核苷酸，即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)，所以具有 64种可能的三联体来编码20种氨基酸，和三个翻译终止(无义)密码子。由于该冗余性， 除了两种氨基酸外的所有氨基酸由多于一个三联体编码。不同的生物体常常对编码同一氨基酸的数个密码子中的一个显示出特定的偏好。这些偏好是如何出现的是分子进化的辩论激烈的领域。普遍接受的是，密码子优先性反映出对于翻译优化的突变偏倚性和自然选择之间的平衡。在快速生长的微生物如大肠杆菌(Escherichia coli)或酿酒酵母(面包酵母)中的优化密码子反映出它们各自的基因组tRNA库的组成。认为优化密码子帮助实现最快的翻译速率和高准确性。由于这些因素的结果，预期翻译选择在高度表达的基因中更强，在上述生物体中的确如此。在不表现出高生长速度或者存在小基因组的其它生物中，通常缺乏密码子使用优化，并且密码子优先性通过在该特定基因组中所见的特征突变偏倚性确定。 该情况的实例是智人(Homo sapiens)(人)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。表现出中等水平密码子使用优化的生物包括黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(线虫)或者拟南芥(Arabidopsis thaliana)(墙水芹)。术语“密码子优化的序列”通常指已经通过将具有小于约20%使用频率的任何密码子替换掉而针对特定宿主物种优化的核苷酸序列。除了密码子优化之外，通过消除假的多腺苷化序列、消除外显子/内含子剪接信号、消除转座子样重复和/或优化GC含量，已经对于在特定宿主物种中表达优化的核苷酸序列在本文中称作“表达增强序列”。表1 人密码子选择和密码子优先性。对于每一密码子，该表显示人编码区每一密码子的使用频率(每一千)(第一列)和在同义密码子当中每一密码子的相对频率(第二列)。
权利要求
1.分离的多核苷酸，包含编码SEQ ID NO :4的多肽的人密码子优化的多核苷酸，其中所述多肽包含胞嘧啶脱氨酶(CD)活性。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID NO :3所示序列并且包含1-50个沉默突变。
3.权利要求1或2的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID NO :3。
4.权利要求1的分离的多核苷酸，还包含编码具有UPRT或OPRT活性的多肽的UPRT或 OPRT多核苷酸，所述具有UPRT或OPRT活性的多肽可操作连接至具有⑶活性的多肽。
5.权利要求4的分离的多核苷酸，其中UPRT或OPRT多核苷酸是密码子优化的。
6.权利要求4的分离的多核苷酸，其中UPRT或OPRT多核苷酸通过连接体与编码具有 CD活性的多肽的多核苷酸分开。
7.分离的多核苷酸，包含编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的第一编码序列；和编码具有URPT或OPRT活性的多肽的第二编码序列， 其中第一编码序列可操作连接至第二编码序列。
8.权利要求7的分离的多核苷酸，其中第一和第二编码序列通过编码肽连接体的序列分开。
9.权利要求7的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含SEQID NO: 12、14或16 中所示序列的多肽。
10.基本上纯的通过权利要求1、2、4或7的多核苷酸的表达产生的多肽。
11.包含权利要求1、2、4或7的多核苷酸的载体。
12.权利要求11的载体，其中所述载体是质粒。
13.权利要求11的载体，其中所述载体是表达载体。
14.权利要求11的载体，其中所述载体包括病毒载体。
15.权利要求14的载体，其中所述病毒载体包括可复制型反转录病毒。
16.含有权利要求12、13、14或15的载体的宿主细胞。
17.包含权利要求1、4或7的多核苷酸的宿主细胞。
18.权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括人细胞。
19.权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括包含细胞增殖性病症的细胞。
20.权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括稳定转化的人细胞。
21.权利要求20的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含细胞增殖性病症。
22.权利要求19或21的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含多形性成胶质细胞瘤。
23.权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞被体内转化。
24.重组的可复制型反转录病毒(RCR)，包含 反转录病毒GAG蛋白；反转录病毒POL蛋白； 反转录病毒包膜；反转录病毒多核苷酸，包含反转录病毒多核苷酸序列3'端的长末端重复(LTR)序列、 反转录病毒多核苷酸5'端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构域和env核酸结构域，所述启动子适于在哺乳动物细胞中表达；盒，包含可操作连接至包含权利要求1的多核苷酸的异源核酸的内部核糖体进入位点 (IRES)，其中所述盒位于3' LTR的5'位置和编码所述反转录病毒包膜的erw核酸结构域的3'位置；和对于在靶细胞中反转录、包装和整合必需的顺式作用序列。
25.权利要求M的反转录病毒，其中反转录病毒多核苷酸序列衍生自鼠白血病病毒 (MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫科白血病病毒或长臂猿白血病病毒(GALV)。
26.权利要求M或25的反转录病毒，其中MLV是双嗜性MLV。
27.权利要求M的反转录病毒，其中所述反转录病毒是Y反转录病毒。
28.权利要求M的反转录病毒，其中所述靶细胞是具有细胞增殖性病症的细胞。
29.权利要求M的反转录病毒，其中所述靶细胞是赘生性细胞。
30.权利要求观的反转录病毒，其中所述细胞增殖性病症选自肺癌、结肠-直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和卵巢癌、类风湿性关节炎或其它自身免疫病。
31.权利要求M的反转录病毒，其中启动子序列与生长调节基因关联。
32.根据权利要求M的反转录病毒，其中启动子序列包括组织特异性启动子序列。
33.根据权利要求32的反转录病毒，其中组织特异性启动子序列包含至少一个雄激素应答元件(ARE)。
34.根据权利要求33的反转录病毒，其中雄激素应答元件衍生自前列腺碱性蛋白启动子。
35.根据权利要求32的反转录病毒，其中组织特异性启动子序列包含前列腺碱性蛋白启动子。
36.根据权利要求M的反转录病毒，其中启动子包括具有SEQID NO :19,20或22的从核苷酸1至大约核苷酸582所示序列的CMV启动子并且可包含对一个或更多个核酸碱基的修饰，所述启动子能够指导和起始转录。
37.权利要求M的反转录病毒，其中启动子包含SEQID NO 19或20的从核苷酸1至大约核苷酸582所示的序列。
38.权利要求M的反转录病毒，其中启动子包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。
39.权利要求38的反转录病毒，其中CMV-R-U5结构域包含连接至MLVR-U5区的人巨细胞病毒立即早期启动子。
40.权利要求39的反转录病毒，其中CMV-R-U5结构域多核苷酸包含SEQID NO :19、20 或22的从大约核苷酸1至大约核苷酸1202所示的序列或与SEQ ID NO :19、20或22所示的序列至少95%相同的序列，其中多核苷酸促进与其可操作连接的核酸分子的转录。
41.权利要求M的反转录病毒，其中多核苷酸的gag衍生自Y反转录病毒。
42.权利要求41的反转录病毒，其中gag核酸结构域包含SEQID NO 19从大约核苷酸编号1203至大约核苷酸观19的序列或者与其具有至少95^^98^^99%或99. 8%同一性的序列。
43.权利要求M的反转录病毒，其中多核苷酸的pol结构域衍生自Y反转录病毒。
44.权利要求43的反转录病毒，其中pol结构域包含SEQID NO 19从大约核苷酸编号观20至大约核苷酸6358的序列或与其具有至少95%、98%、99%或99. 9%同一性的序列。
45.权利要求M的反转录病毒，其中env结构域包含SEQID NO :19从大约核苷酸编号6359至大约核苷酸8323的序列或与其具有至少95%、98%、99%或99. 8%同一性的序列。
46.权利要求M的反转录病毒，其中IRES衍生自脑心肌炎病毒。
47.权利要求46的反转录病毒，其中IRES包含SEQID NO 19从大约核苷酸编号8327 至大约核苷酸8876的序列或与其具有至少95^^98%或99%同一性的序列。
48.权利要求M的反转录病毒，其中异源核酸包含具有SEQID NO :3、5、11、13、15或 17所示序列的多核苷酸。
49.权利要求M的反转录病毒，其中异源核酸编码包含SEQID NO :4所示序列的多肽。
50.权利要求M的反转录病毒，其中异源核酸是人密码子优化的并且编码SEQID NO 4中所示的多肽。
51.权利要求M的反转录病毒，其中异源核酸包含SEQID NO :19从大约核苷酸编号 8877至大约9353所示的序列。
52.权利要求51的反转录病毒，其中3’LTR衍生自、反转录病毒。
53.权利要求52的反转录病毒，其中3’LTR包含U3-R-U5结构域。
54.权利要求52的反转录病毒，其中3，LTR包含SEQID NO 19从大约核苷酸9405至大约9998所示序列或者与其至少95%、98%或99. 5%相同的序列。
55.权利要求M的反转录病毒，其中反转录病毒多核苷酸包含SEQID N0:19、20或22 所示的序列。
56.分离的多核苷酸，从5’至3’包含来自人巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区的CMV-R-U5融合物； PBS，反转录酶的引物结合位点； 5’剪接位点； Ψ包装信号；MLV组特异性抗原的gag编码序列； MLV聚合酶多蛋白的pol编码序列； 3’剪接位点；MLV株4070A包膜蛋白的4070Aenv编码序列； 来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)； 修饰的胞嘧啶脱氨酶编码序列； 多嘌呤段；和U3-R-U5 MLV长末端重复。
57.权利要求56的多核苷酸，其中反转录病毒多核苷酸包含SEQID N0:19、20或22所示的序列。
58.权利要求56的多核苷酸，其中反转录病毒多核苷酸序列衍生自鼠白血病病毒 (MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫科白血病病毒或长臂猿白血病病毒(GALV)。
59.权利要求58的多核苷酸，其中MoMLV是双嗜性MoMLV。
60.治疗患有细胞增殖性病症的受试者的方法，包括使受试者与权利要求1、7或56的多核苷酸在使得多核苷酸表达的情况下接触和使受试者与5-氟胞嘧啶接触。
61.权利要求60的方法，其中多核苷酸整合入受试者的细胞内。
62.权利要求60的方法，其中多核苷酸通过反转录病毒载体递送。
63.权利要求62的方法，其中反转录病毒载体包含SEQID NO 19、20或22所示的序列。
64.权利要求60的方法，其中细胞增殖性病症是多形性成胶质细胞瘤。
65.权利要求60的方法，其中细胞增殖性病症选自肺癌、结肠-直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和卵巢癌、类风湿性关节炎或其它自身免疫病。
66.治疗受试者中细胞增殖性病症的方法，包括使受试者与权利要求M的反转录病毒接触和使受试者与5-氟胞嘧啶接触。
67.权利要求66的方法，其中异源核酸编码包含SEQID NO :4、12、14、16或18所示序列的多肽。
68.权利要求66的方法，其中反转录病毒多核苷酸包含SEQID NO :19、20或22所示的序列。
全文摘要
本公开提供修饰的胞嘧啶脱氨酶(CD)。本公开还涉及表达或包含此类修饰CD的细胞和载体以及使用此类修饰CD治疗疾病和病症的方法。
文档编号C12N15/867GK102227501SQ200980147509
公开日2011年10月26日 申请日期2009年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者克里斯托弗·R·洛格, 哈利·E·格鲁贝尔, 奥马尔·佩雷斯, 道格拉斯·乔利 申请人:托卡根公司