重组载体的制作方法

专利名称：重组载体的制作方法
技术领域：
本公开书涉及用于治疗细胞增殖的可复制逆转录病毒载体。本公开书另外涉及使用所述可复制逆转录病毒载体递送和表达异源核酸。
背景技术：
对细胞和受试对象递送基因和异源核酸的有效方法一直是科学研发和疾病和失调的可能疗法的研究目标
发明内容
本公开书提供一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含逆转录病毒GAG蛋白； 逆转录病毒POL蛋白；逆转录病毒包膜；逆转录病毒多聚核苷酸，其包含位于逆转录病毒多聚核苷酸序列3’端的长末端重复(LTR)序列、位于逆转录病毒多聚核苷酸5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和erw核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达；盒，其包含可操作地连接于异源多聚核苷酸的内部核糖体进入位点(IRES)，其中所述盒位于3’ LTR 的5’和编码逆转录病毒包膜的erw核酸域的3’ ；和靶细胞中的逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列，其中与PACE载体(SEQ ID N0:21)相比，RCR在6次传代后保持较高的复制能力。在一个实施方案中，逆转录病毒多聚核苷酸序列来源于鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。在另一个实施方案中，MLV是双嗜性MLV。在另一个实施方案中，逆转录病毒是致癌逆转录病毒或Y逆转录病毒。在另一个实施方案中，靶细胞是具有细胞增殖失调的细胞。细胞增殖失调可选自由(但不限于)肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和卵巢癌、类风湿性关节炎和其它自身免疫疾病组成的组。在一个实施方案中，启动子包括具有如SEQ ID NO :19、20或22的核苷酸1到约核苷酸582所述的序列的 CMV启动子，且可包含对一个或多个核酸碱基的修饰，所述启动子能引导和引发转录。在另一个实施方案中，启动子包括如SEQ ID NO :19、20或22的核苷酸1到约核苷酸582所述的序列。在另一个实施方案中，启动子包括CMV-R-TO域多聚核苷酸。在一个实施方案中， CMV-R-TO域包括与MLV R-TO区域连接的来自人类巨细胞病毒的立即早期启动子。在另一个实施方案中，CMV-R-U5域多聚核苷酸包括如SEQ ID NO 19、20或22的约核苷酸1到约核苷酸1202所述的序列，或与如SEQ ID NO 19、20或22所述的序列具有至少95%同一性的序列，其中所述多聚核苷酸促进与其可操作地连接的核酸分子的转录。在另一个实施方案中，多聚核苷酸的gag和pol来源于致癌逆转录病毒或Y逆转录病毒。gag核酸域可包括SEQ ID NO 19或22的约核苷酸编号1203到约核苷酸2819的序列，或与其具有至少 95%、98%、99%或99. 8%同一性的序列。pol域可包括SEQ ID NO 19或22的约核苷酸编号2820到约核苷酸6358的序列，或与其具有至少95 %、98 %、99 %或99. 9 %同一性的序列。在一个实施方案中，env域编码双嗜性env蛋白。env域可包含SEQ ID NO: 19或22的约核苷酸编号6359到约核苷酸8323的序列，或与其具有至少95 %、98 %、99 %或99. 8 %同一性的序列。载体的IRES域可以是任何IRES，但在一个实施方案中，IRES来源于脑心肌炎病毒。在另一个实施方案中，IRES包括SEQ ID NO 19或22的约核苷酸编号8327到约核苷酸8876的序列，或与其具有至少95 %、98 %或99 %同一性的序列。载体可包含任何数量的不同的异源多聚核苷酸。举例来说，异源多聚核苷酸可包含细胞因子、siRNA, miRNA或RNAi分子、靶向序列、结合域、细胞毒性基因、单链抗体或其任何组合。当异源多聚核苷酸是用于例如siRNA、miRNA或RNAi等非翻译RNA时，不需要 IRES，但也可包括IRES以用于另一种被翻译基因RNA，且可使用任何种类的逆转录病毒。在另一个实施方案中，异源多聚核苷酸包括具有如SEQ ID N0:3、5、ll、13、15或17所述的序列的多聚核苷酸。在另一个实施方案中，异源序列编码包括如SEQ ID NO :4所述的序列的多肽。异源核酸是经人类密码子优化的且编码如SEQ ID NO :4所述的多肽。在另一个实施方案中，异源核酸包括如SEQ ID NO 19或22的约核苷酸编号8877到约9353所述的序列。在一个实施方案中，3’LTR来源于致癌逆转录病毒或、逆转录病毒。在另一个实施方案中，3，LTR包括U3-R-U5域。在另一个实施方案中，3，LTR包括如SEQ ID NO 19的约核苷酸9405到约9998所述的序列，或与其具有至少95%、98%或99. 5%同一性的序列。本公开书提供一种包括如SEQ ID NO :19、20或22所述的序列的多聚核苷酸。本公开书提供一种分离的多聚核苷酸，其从5’到3’包含人类巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区的CMV-R-U5融合体；逆转录酶的引物结合位点PBS ；5’剪接位点；Ψ包装信号；MLV群特异性抗原的gag编码序列；MLV聚合酶多聚蛋白的pol编码序列； 3’剪接位点；MLV品系4070A的包膜蛋白的4070A env编码序列；脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)；经修饰的胞嘧啶脱氨酶编码序列；聚嘌呤束(polypurine tract)；和 U3-R-U5 MLV长末端重复序列。本公开书提供一种治疗患有细胞增殖失调的受试对象的方法，其包含使受试对象与编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的本公开书的多肽的多聚核苷酸在允许多聚核苷酸表达的条件下接触，和使受试对象与5-氟胞嘧啶接触。本公开书还提供一种治疗受试对象的细胞增殖失调的方法，其包含使受试对象与本发明的逆转录病毒接触，其中异源核酸序列编码抑制赘生性细胞增殖的治疗性蛋白。在一个实施方案中，逆转录病毒包含编码具有如SEQ ID NO :4、12、14、16或18所述的序列的多肽的多聚核苷酸。本公开书的一个或多个实施方案的细节阐述于附图和以下具体实施方式
中。根据具体实施方式
和附图并根据权利要求书，其它特征、目标和优势可显而易见。


图IA-C显示野生型酵母胞嘧啶脱氨酶(SEQ ID NO 2)和本公开书的胞嘧啶脱氨酶(SEQ ID NO 4)和本公开书的其它序列的比对。
图2显示细胞杀死数据的曲线图，其显示经修饰的载体与原始野生型⑶相比更为有效。所述曲线图还显示新的经修饰骨架(T5.0007)在细胞杀死方面比老的骨架 (pACE-CD)更为有效。还显示将各种载体构建体和其名称按目录分类的表格。图3A-D显示(a)本公开书的重组逆转录病毒载体的图解；(b)本公开书的多聚核苷酸的质粒图谱；(c和d)本公开书的多聚核苷酸的序列(SEQ ID NO 19)。图4显示在感染的U-87细胞中观察到的y⑶2蛋白的含量高于野生型y⑶蛋白。图5显示如使用PCR扩增所评定，本公开书的载体在12个病毒传代周期后保持遗传稳定。所述图还显示本公开书的载体与载体pACE-CD(KaSahara等人)相比在更长传代后更为稳定。具体来说，pAC3-⑶比pACE-⑶更稳定，证明经改变的骨架使载体更稳定。此夕卜，pACE-y⑶1 (T5. 0001)和-y⑶2 (T5-0002)都比pAC_y⑶稳定得多，证明对转基因的编码序列所作的微小和沉默改变对稳定性具有很大的影响，从而产生优良性质。T5. 0003最不稳定且T5. 0004和T5. 0005似乎与在小鼠肿瘤中显示功效的pACE_CD(W. Wang等人Hum Gene Ther 14:117 2003 ;Tai 等人 Mol Ther 12:842 2005)大致相等。图6显示㈧细胞杀死分析；和⑶用不同载体感染的细胞的胞嘧啶脱氨酶比活性。(A)显示被感染U87细胞暴露于渐增水平的5-FC时本公开书的胞嘧啶脱氨酶和载体比原始PACE-⑶至少一样或更好地杀死被感染细胞。(B)显示本公开书的⑶比活性 (T5. 0007、T5. 0001 和 T5. 0002)均高于 pACE-CD (T5. 0000)，次序为 T5. 0000 < T5. 0007 < T5. 0001 < T5. 0002。图7显示用本公开书的⑶载体体内处理且从用4个5-FC周期处理的小鼠外植的 U-87肿瘤对药物仍然敏感。图8显示小鼠脑癌模型的Kaplan-Meyer生存分析中的给药信息和治疗效果。图9显示同系小鼠模型的Kaplan-Meyer生存分析中的给药信息和治疗效果。图10A-D显示用于产生包含具有⑶、OPRT和UPRT活性的多肽的本公开书的各种实施方案的方案。图11 :A是含有人类初级前体miR-128-l、人类初级前体miR-128-2和与人类Hl启动子连接的人类前体miR-128的多聚核苷酸序列的MLV逆转录病毒载体pAC3骨架(分别命名为 pAC3-miR128-l、pAC3-miR-128-2 和 pAC3_Hl-shRNAmiR128)的图解载体图谱。B 是含有与人类Hl启动子连接的人类前体miR-128的多聚核苷酸序列的MLV逆转录病毒载体 pAC3-yCD2骨架(命名为pAC3-yCD2-Hl_shRNAmiR128)的图解载体图谱。图 12 :A 显示由 qPCR 分析的含 miR-128 载体(pAC3_miR-128-l、pAC3-miR-128_2 和PAC3-Hl-shRNAmiR128)在人类纤维肉瘤细胞HT1080中的复制动力学的比较。所述图是通过将从qPCR获得的C(t)值的倒数与病毒复制期间的各个时间点作图来产生。B显示由 qPCR 分析的含 miR-128 载体(pAC3-miR-128-l、pAC3-miR-128_2 和 pAC3-Hl_shRNAmiR128) 在人类神经胶质瘤细胞U87-MG中的复制动力学的比较。所述图是通过将从qPCR获得的 C(t)值的倒数与病毒复制期间的各个时间点作图来产生。图13显示从用含miR-128载体转导的细胞中的成熟miR-128表达的相对定量。图14显示从用含miR-128载体转导的细胞中的Bmi-I基因表达的相对定量。 图15是含有单拷贝142_3ρΤ靶序列(命名为pAC3-emd-142-3pT)和4个串联重复的142-3pT (命名为pAC3-emd-142-3pT4X)的MLV逆转录病毒载体pAC3_emd的图解载体图谱。图16是含有142-3pT靶序列的单拷贝(命名为pAC3-yCD2-142_3pT)和142_3pT 的4个串联重复序列(命名为pAC3-y⑶2-142-3ρΤ4Χ)的MLV逆转录病毒载体pAC3_y⑶2 的图解载体图谱。图 17 :A 显示由 qPCR 分析的含 142_3pT 载体(pAC3-emd-142_3pT、 pAC3-emd-142-3pT4X、pAC3-yCD2-142-3pT 和 pAC3-yCD2-142_3pT4X)和其母体载体 (pAC3-emd和pAC3-y⑶2)在人类纤维肉瘤细胞HT1080中的复制动力学的比较。所述图是通过将从qPCR获得的C(t)值的倒数与病毒复制期间的各个时间点作图来产生。B显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析的，含GFP载体(pAC3-emd、 pAC3-emd-142-3pT和pAC3-emd-142_3pT4X)在人类纤维肉瘤细胞HT1080中的复制动力学的比较。图 18 :A 显示由 qPCR 分析的含 142_3pT 载体(pAC3-emd-142_3pT、 pAC3-emd-142-3pT4X、pAC3-yCD2-142-3pT 和 pAC3-yCD2-142_3pT4X)和其母体载体 (pAC3-emd和pAC3-y⑶2)在人类神经胶质瘤细胞U87-MG中的复制动力学的比较。所述图是通过将从qPCR获得的C(t)值的倒数与病毒复制期间的各个时间点作图来产生。B显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析的，含GFP载体 (pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT 和 pAC3-emd-142_3pT4X)在人类神经胶质瘤细胞 U87-MG 中的复制动力学的比较。图19显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析的含GFP载体(pAC3-emd)在小鼠和人类造血细胞中的复制动力学。图20 =A显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析的含 GFP 载体(pAC3-emd、pAC3-emd-142_3pT 和 pAC3-emd-142_3pT4X)在小鼠 T 淋巴细胞EL4中的复制动力学的比较。B显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析，含 GFP 载体(pAC3-emd、pAC3-emd-142_3pT 和 pAC3-emd-142_3pT4X) 在人类T淋巴细胞SUP-Tl中的复制动力学的比较。C显示通过在载体传播期间的各个时间点的GFP表达的流式细胞分析所分析，含GFP载体(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT和 pAC3-emd-142-3pT4X)在人类单核细胞U937中的复制动力学的比较。图21A和图21B是在肿瘤内CED输注Toca 511和钆期间从病患狗获得的MRI影像的静止帧。应注意影像左侧的大肿瘤挤压脑的两侧并使中线结构向右位移。白色区域是钆-Toca 511输注物。图21B显示在肿瘤中安置两个导管。图22是pAC3骨架中分别编码人类IFN- y (hIFNg)和小鼠IFN- y (mIFNg)的MLV 逆转录病毒载体的图解载体图谱。图23显示来自用pAC3-mIFNg载体感染的人类纤维肉瘤细胞系HT1080中RNA水平下的mIFN- γ表达。通过RT-PCR来检测表达。图24显示用pAC3_hIFNg载体感染的人类纤维肉瘤细胞系HT1080所分泌的 hIFN- γ蛋白的表达。 图25显示用pAC3_mIFNg载体感染的人类纤维肉瘤细胞系HT1080所分泌的 mIFN- γ蛋白的表达。图26显示在裸小鼠模型中肿瘤内或静脉内递送AC3-GFP载体后，U87细胞中的GFP表达的流式细胞分析。通过流式细胞术测量细胞的GFP阳性百分比。从稚裸小鼠脑分离的细胞、来自组织培养物的U87细胞或以1的感染复数用AC3-GFP(V)体外转导的U87细胞用作对照。实施例27 (静脉内注射GFP载体)。图27显示另外对来自实施例27 (静脉内注射GFP载体)的第1、3和5组进行直方图分析，来测量分离的U87细胞中GFP信号的分布。GFP表达是来自从在载体处理后14 天后的小鼠脑分离的U87肿瘤细胞。图28是pAC3骨架中的编码人类IL_2的MLV逆转录病毒载体的图解载体图谱。各个图式中的类似参考符号表示类似元件。
具体实施方式
除非上下文明确指示，否则如本文和随附权利要求书中所用，单数形式“一”和“所述”包括复数个指代物。因此，举例来说，提及“一细胞”时包括多个所述细胞，且提及“所述试剂”时包括提及一种或一种以上所属领域技术人员已知的试剂，诸如此类。除非另外说明，否则“或”也意味着“和/或”。类似地，“包含”和“包括”可互换使用且不打算具有限制性。应进一步了解，当各个实施方案的描述使用术语“包含”时，所属领域技术人员将认为在一些特定情况下，可替代性地使用措辞“基本上由……组成”或“由……组成”来描述实施方案。除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本公开书所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同。虽然与本文所述的方法和材料类似或相等的方法和材料也可用于所公开的方法和组合物的实施中，但本文描述示例性的方法、装置和材料。描述适用于本文的分子生物学技术(包括载体、启动子的使用和许多其它相关课题)的一般文章包括Berger禾PKimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology 第 152 卷，(Academic Press, Inc. , San Diego, Calif. )(〃 Berger")； Sambrook 等人’ Molecular Cloning__A Laboratory Manual,第 2 片反，第 1-3 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1989( " Sambrook ")以及 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等人编，Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. , (1999年增补)(〃 Ausubel ")。足以在体外扩增方法(包括聚合物链反应(PCR)、 连接酶链反应(LCR)、Qi3-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA))中指导所属领域技术人员例如用于产生本公开书的同源核酸的方案的实例见于Berger、 Sambrook 和 Ausubel,以及 Mullis 等人(1987)美国专利第 4，683，202 号；Innis 等人编， (1990)PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications(Academic Press Inc. San Diego, Calif.)(〃 Innis" ) ；Arnheim & Levinson(1990 年 10 月 1 日)C&EN 36-47 ； The Journal Of NIH Research (1991) 3 81-94 ；Kwoh等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 1173 ；GuatelIi 等人(1990)Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 87 1874 ；Lome 11 等人(1989) J. Clin. Chem 35 1826 ；Landegren等人(1988) Science 241 1077-1080 ；Van Brunt (1990) Biotechnology 8 :291_294 ；Wu 和 Wallace (1989) Gene 4 560 ；Barringer 等人(1990) Gene 89 117 ；和 Sooknanan 和 Malek (1995) Biotechnology 13 :563_564。Wallace 等人，美国专利第5，426，039号描述用于克隆体外扩增的核酸的改良方法。Cheng等人(1994)Nature 369:684-685和其中所引用的参考文献总结了通过PCR扩增大核酸的改良方法，其中产生高达40kb的PCR扩增子。所属领域技术人员将了解，使用逆转录酶和聚合酶基本上可将任何RNA转化为适合于限制性酶切、PCR扩增和测序的双链DNA。参看例如Ausubel、Sambrook 和Berger (所有见上文)。本文讨论的发表内容仅涉及其在本申请的提交日期之前的公开内容。本文中的任何内容不应被理解为承认发明人没有权利因为先前公开书而早于所述公开书。

本公开书提供适用于细胞或受试对象的基因或蛋白质递送的方法和组合物。所述方法和组合物可用于治疗受试对象的各种疾病和失调，包括癌症和其它细胞增殖疾病和失调。本公开书提供用于基因递送的可复制逆转录病毒载体。术语“载体”、“载体构建体”和“表达载体”意思是可将DNA或RNA序列(例如外来基因)引入宿主细胞中，以便转化宿主并促进所引入的序列的表达(例如转录和翻译)的运载体。载体典型地包含可传播病原体的DNA，其中通过限制酶技术插入编码蛋白质的外来 DNA0常见类型的载体是“质粒”，其一般是双链DNA的自包含式分子，容易接受其它(外来) DNA且容易引入合适宿主细胞中。已描述了可在多种真核和原核宿主中复制和/或表达的许多载体，包括质粒和真菌载体。非限制性实例包括PKK质粒(Clonetech)、pUC质粒、pET 质粒(Novagen, Inc. ,Madison, Wis.、pRSET 或 pREP 质粒(Invitrogen, San Diego, Calif.) 或pMAL质粒(New England Biolabs,Beverly,Mass.)和许多适当的宿主细胞，其中使用本文公开或引用的方法或者相关领域技术人员已知的方法。重组克隆载体通常包括一种或一种以上用于克隆或表达的复制系统、一种或一种以上用于宿主筛选的标志物(例如抗生素抗性)和一种或一种以上表达盒。术语“表达”意味着允许或导致基因或DNA序列的信息变得明白，例如通过激活对应基因或DNA序列的转录和翻译中所涉及的细胞功能来产生蛋白质。细胞表达DNA序列， 从而形成“表达产物”，例如蛋白质。表达产物自身(例如所得蛋白质)也可被称为由细胞 “表达”。举例来说，当多聚核苷酸或多肽是在外来或天然启动子的控制下在外来宿主细胞中表达或产生时，或在外来启动子的控制下在天然宿主细胞中表达或产生时，所述多聚核苷酸或多肽是重组表达。本公开书提供可复制性病毒载体，其含有编码例如胞嘧啶脱氨酶或其突变体、 miRNA或siRNA、细胞因子、抗体结合域等的异源多聚核苷酸，所述异源多聚核苷酸可被递送到细胞或受试对象中。病毒载体可以是腺病毒载体、麻疹载体、疱疹载体、逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)、弹状病毒载体(rhabdoviral vector)(例如水泡性口炎病毒载体)、呼肠孤病毒载体(reovirus vector)、西尼加谷病毒载体(Seneca Valley Virus vector)、痘病毒载体(poxvirus vector)(包括动物痘或牛痘递送型载体)、细小病毒载体 (parvovirus vector)(包括AAV载体)、α病毒载体或所属领域技术人员已知的其它病毒载体(也参看例如 Concepts in Genetic Medicine, Boro Dropulic 禾口 Barrie Carter 编，Wiley,2008, Hoboken, NJ. ；The Development of Human Gene Therapy, Theodore Friedmann编，Cold Springs Harbor Laboratory Press,Cold springs Harbor,New York, 1999 ；Gene and Cell Therapy, Nancy Smyth Templeton Marcel Dekker Inc., New York,New York, 2000 以及Gene Therapy :Therapeutic Mechanism and Strategies,NancySmyth Templetone禾口 DaniIo D Lasic 编，Marcel Dekker，Inc.，New YorkiNew York, 2000 ； 其揭示内容以引用的方式并入本文中)。在一个实施方案中，病毒载体可以是仅能感染复制中的哺乳动物细胞的可复制逆转录病毒载体。在一个实施方案中，可复制逆转录病毒载体在编码例如胞嘧啶脱氨酶、 miRNA、siRNA、细胞因子、受体、抗体等的异源多聚核苷酸的5'包含内部核糖体进入位点 (IRES)。当异源多聚核苷酸编码例如siRNA、miRNA或RNAi等非翻译RNA时，不需要IRES， 但也可包括IRES以用于另一种被翻译基因，且可使用任何种类的逆转录病毒(见下文)。 在一个实施方案中，多聚核苷酸位于逆转录病毒载体的ENV多聚核苷酸的3’。在其它实施方案中，提供用本公开书的可复制逆转录病毒载体转染的宿主细胞。 宿主细胞包括真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。宿主细胞也可包括原核细胞，例如细菌细胞。还提供用本文提供的载体(例如可复制逆转录病毒载体)转导(转化或转染) 的经工程改造的宿主细胞。经工程改造的宿主细胞可以在经适当改良以用于激活启动子、筛选转化株或扩增编码多聚核苷酸的常规营养培养基中培养。培养条件(例如温度、 PH等)是如先前筛选宿主细胞表达中所用，且对于所属领域技术人员和根据本文引用的参考文献是显而易见的，所述参考文献包括例如Sambrook、Ausubel和Berger，以及例如 Freshney(1994)Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique,第 3 版 (ffiley-Liss,New York)和其中引用的参考文献。适当表达宿主的实例包括细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌 (B. subtilis)、链霉菌(Streptomyces)禾口鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)； 真菌细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris) 和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；昆虫细胞，例如果蝇(Drosophila)和草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)；哺乳动物细胞，例如 CH0、C0S、BHK、HEK 293 或 Bowes 黑色素瘤； 或植物细胞或外植体等。典型地可使用人类细胞或细胞系，然而，可能需要将本公开书的载体和多聚核苷酸克隆到非人类宿主细胞中以用于测序、扩增和克隆。本公开书还提供相对于先前逆转录病毒载体具有提高的稳定性的可复制逆转录病毒载体。在感染和复制期间所述提高的稳定性对于治疗细胞增殖失调很重要。可复制逆转录病毒提供转导效率、转基因稳定性和靶选择性的组合。组合物和方法提供插入物稳定性且维持转基因的转录活性和所编码多肽的翻译活力。 本公开书提供经修饰的逆转录病毒载体。经修饰的逆转录病毒载体可从逆转录病毒家族的成员衍生得到。逆转录病毒家族由三组组成泡沫病毒，例如人泡沫病毒(HFV)； 慢病毒，例如绵羊髓鞘脱落病毒；和致癌病毒(但不是此组内的所有病毒都是致癌的)。术语“慢病毒”以其常规含义使用，用于描述含有逆转录酶的病毒属。慢病毒包括“免疫缺陷病毒”，其包括人免疫缺陷病毒(HIV) 1型和2型(HIV-1和HIV-2)和猴免疫缺陷病毒(SIV)。 基于在病毒成熟期间于电子显微镜下观察的粒子形态，致癌病毒在历史上被进一步再分为 A、B、C和D组。A型粒子代表在被感染细胞的细胞质中看到的B型和D型病毒的不成熟粒子。这些粒子不具有感染性。通过胞质内A型粒子的包膜作用，B型粒子作为成熟病毒粒子从质膜发芽。所述粒子在膜上具有75nm的环形核，长的糖蛋白从其中突出。在发芽后，B 型粒子含有偏心定位的电子致密核心。原型B型病毒是小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。在被C型病毒感染的细胞中没有观察到胞质内粒子。相反，成熟粒子经由月牙C式缩合直接从细胞表面生长出，然后自我闭合并由质膜封闭起来。可见到包膜糖蛋白突出物以及均勻的电子致密核心。出芽可从表面质膜开始或直接进入胞内液泡。C型病毒被研究地最为广泛，且包括许多禽和鼠白血病病毒(MLV)。因为牛白血病病毒(BLV)和人T细胞白血病病毒I和II 型(HTLV-I/II)从细胞表面的出芽形态学，它们被类似地归类为C型粒子。然而，它们还具有规则的六边形形态和比原型C型病毒(例如鼠白血病病毒(MLV))更为复杂的基因组结构。D型粒子与B型粒子的相似之处在于它们都在被感染的细胞质中显示环状结构。D型粒子从细胞表面开始出芽，但病毒粒子包含短的表面糖蛋白突出物。电子致密核心在粒子内也是偏心定位。梅森费舍猴病毒(MPMV)是原型D型病毒。逆转录病毒的分类存在多种方式，但近十年来命名法已趋于标准化(参看 ICTVdB-The Universal Virus Database,ν 4 on the World Wide Web(www)at ncbi. nlm. nih. gov/ICTVdb/ICTVdB/and the text book"Retroviruses”Coffin,Hughs 禾口 Varmus 编， Cold Spring Harbor Press 1997，其公开内容以引用的方式并入本文中)。在一个实施方案中，可复制逆转录病毒载体可包含正向逆转录病毒(Orthoretrovirus)或更典型地包含 Y逆转录病毒载体。逆转录病毒可根据其复制遗传材料的方式来定义。RNA在复制期间转化为DNA。在细胞感染之后，通过被称为逆转录的分子方法从病毒粒子中携带的两个RNA分子产生双链 DNA分子。所述DNA形式作为前病毒共价地整合到宿主细胞基因组中，在细胞和/或病毒因子的帮助下从所述DNA表达病毒RNA。所表达的病毒RNA包装到粒子中且作为感染性病毒粒子释放。逆转录病毒粒子由两个相同的RNA分子构成。每个野生型基因组具有正义单链 RNA分子，其在5’端被加帽并在3’尾端被聚腺苷酸化。二倍体病毒粒子含有与gag蛋白复合的两条RNA链、病毒酶(pol基因产物)和gag蛋白“核心”结构内的宿主tRNA分子。从宿主细胞膜衍生且含有病毒包膜(env)蛋白的脂质双层包围和保护着此衣壳。erw蛋白与病毒的细胞受体结合，且粒子典型地通过受体介导的内吞作用和/或膜融合而进入宿主细胞。在外部包膜脱落后，病毒RNA通过逆转录被拷贝到DNA中。逆转录是由pol区编码的逆转录酶催化且使用包装到病毒粒子中的宿主细胞tRNA作为DNA合成引物。以此方式，RNA基因组被转化为更为复杂的DNA基因组。逆转录所产生的双链线性DNA可能必须或可能不是必须在核内成环形。前病毒现在在每一端具有两个相同的重复序列，所述重复序列被称为长末端重复序列(LTR)。这两个 LTR序列的末端产生被pol产物(催化整合的整合酶蛋白)识别的位点，使得前病毒总是与距离LTR末端两个碱基对(bp)的宿主DNA结合。在两个LTR的末端看到细胞序列的复制， 暗示可换位基因元件的整合模式。认为整合基本上是在靶细胞基因组内随机发生。然而， 通过修饰长末端重复序列，可以控制逆转录病毒基因组的整合。所整合的病毒DNA的转录、RNA剪接和翻译是由宿主细胞蛋白介导。产生以各种方式剪接的转录物。在人类逆转录病毒HIV-1/2和HTLV-I/II的情况下，也使用病毒蛋白来调节基因表达。细胞因子和病毒因子之间的相互作用是病毒潜伏期和表达病毒基因的时间序列的控制中的一个因素。
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逆转录病毒可水平地和垂直地传播。逆转录病毒的有效感染传播需要在具有可特异性识别病毒包膜蛋白的受体的靶细胞上表达，但病毒也可低效地利用不依赖受体的非特异性进入途径。此外，靶细胞类型必须能够支持在病毒结合和穿透之后复制循环的所有阶段。当病毒基因组整合入宿主的生殖细胞系中时，发生垂直传播。前病毒然后从一代传代到另一代，就好像它是细胞基因一样。因此，产生了内源前病毒，其通常潜伏在体内，但在宿主暴露于适当媒介物时可被激活。如上所述，整合的DNA中间物被称为前病毒。先前基因疗法或基因递送系统使用需要在适当辅助病毒存在下或在含有允许衣壳化而不会同时产生污染性辅助病毒的适当序列的细胞系中，转录前病毒并组装到感染性病毒中的方法和逆转录病毒。如下所述，产生本公开书的重组逆转录病毒不需要辅助病毒，这是因为在基因组中提供用于衣壳化的序列，从而提供可复制逆转录病毒载体以用于基因递送或疗法。现有的可复制逆转录病毒载体也容易在水平或垂直传播期间和复制期间从被感染细胞或宿主细胞丢失。这可能是部分因为存在包括重复序列或降低聚合酶效率的额外核苷酸序列。本公开书的逆转录病毒基因组和前病毒DNA具有至少三个基因gag、pol和env， 这些基因可侧接一个或两个长末端(LTR)重复序列，或在前病毒中侧接两个长末端重复序列(LTR)和含有顺式作用序列(例如psi)的序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；且env 基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和/或3’ LTR用于促进病毒粒子RNA的转录和聚腺苷酸化。 LTR含有病毒复制所必需的所有其它顺式作用序列。慢病毒具有其它基因，包括vif、vpr、 tat、rev、vpu、nef 和 vpx (在 HIV-1、HIV-2 和 / 或 SIV 中)。与5’LTR相邻的序列是基因组(tRNA引物结合位点)的逆转录和病毒RNA有效衣壳化入粒子(Psi位点)中所必需的。如果衣壳化(或逆转录病毒RNA包装到感染性病毒粒子中)所必需的序列从病毒基因组丢失，那么将导致顺式缺陷(cis defect)，其防止基因组病毒RNA的衣壳化。这类经修饰的载体是先前基因递送系统(意即缺少病毒粒子衣壳化所必需的元件的系统)中典型使用的载体。在第一实施方案中，本公开书提供一种能感染非分裂细胞、分裂细胞或具有细胞增殖失调的细胞的重组逆转录病毒。本公开书的重组可复制逆转录病毒包含编码病毒GAG、 病毒POL、病毒ENV的多聚核苷酸序列，在封装于病毒粒子内的内部核糖体进入位点(IRES) 之后的异源多聚核苷酸。短语“非分裂”细胞是指未经历有丝分裂的细胞。非分裂细胞可以在细胞周期的任何点(例如GcZGpG1^G2ai)被阻断，只要细胞没有积极地分裂。例如，在间接体内感染中， 可通过所属领域技术人员所用的标准技术(包括照射、阿非迪霉素(aphidocolin)处理、血清饥饿和接触抑制)处理分裂细胞以阻断细胞分裂。然而，应了解间接体内感染通常在不阻断细胞的情况下进行，这是因为许多细胞已被抑制(例如干细胞)。举例来说，不论使用何种机制阻断细胞分裂或细胞在细胞周期中哪一点被阻断，重组慢病毒载体能感染任何非分裂细胞。体内预先存在的非分裂细胞的实例包括神经元、肌肉、肝、皮肤、心脏、肺和骨髓细胞和其衍生物。对于分裂细胞，可使用致癌逆转录病毒载体。“分裂的”细胞意思是经历活跃的有丝分裂或减数分裂的细胞。所述分裂细胞包括干细胞、皮肤细胞(例如成纤维细胞和角质形成细胞)、配子和所属领域中已知的其它分裂细胞。术语分裂的细胞特别关注且涵盖具有细胞增殖失调的细胞，例如赘生性细胞。术语“细胞增殖失调”是指特征为细胞数目异常的状况。所述状况可包括肥大(细胞连续繁殖，导致细胞群体在组织内过度生长)和不足(组织内的细胞缺乏或不足)细胞生长，或细胞过量流入或迁移入身体某区域。细胞群体不一定是被转化、致瘤或恶性细胞，也可包括正常细胞。细胞增殖失调包括与结缔组织的过度生长有关的失调，例如各种纤维化失调，包括硬皮病、关节炎和肝硬化。细胞增殖失调包括赘生失调，例如头颈癌。头颈癌包括例如口癌、食道癌、咽喉癌、喉癌、甲状腺癌、舌癌、唇癌、唾液腺癌、鼻癌、副鼻窦癌、鼻咽癌、上鼻道癌和鼻窦癌、嗅神经母细胞瘤、鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、鼻腔鼻窦未分化癌(SNUC)、脑肿瘤(包括胶质母细胞瘤)或血液肿瘤。还包括区域淋巴结癌，所述区域淋巴结包括颈淋巴结、喉前淋巴结、肺食管旁淋巴结和下颂下淋巴结(Harrison' s Principles of Internal Medicine(Isselbacher 等人编，McGraw-Hill，Inc.，第 13 版，第 1850-1853 页，1994)。其它癌症类型包括(但不限于)肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、淋巴瘤、 口腔癌、胰腺癌、白血病、黑色素瘤、胃癌、皮肤癌和卵巢癌。细胞增殖疾病还包括类风湿性关节炎(0’ Dell NEJM 350:2591 2004)和特征通常为免疫系统细胞不当增殖的其它自身免疫失调(Mackay 等人 NEJM 345 340 2001)。异源核酸序列与IRES可操作地连接。如本文所用，术语“异源”核酸序列或转基因是指(i)在野生型逆转录病毒中通常不存在的序列，( )来源于外来物种的序列，或(iii) 如果来自相同物种，那么可从其原始形式经实质改变。或者，在细胞中通常不表达的未改变的核酸序列是异源核酸序列。取决于本公开书的逆转录病毒载体的预期用途，可向逆转录病毒载体中插入任何数目的异源多聚核苷酸或核酸序列。举例来说，在体外研究中可使用常用的标志基因或报告基因，包括抗生素抗性和荧光分子(例如GFP)。编码任何期望多肽序列的其它多聚核苷酸序列也可插入本公开书的载体中。当寻求异源核酸序列的体内递送时，可使用治疗性序列和非治疗性序列两者。举例来说，异源序列可编码涉及与细胞增殖失调相关的特定基因或与疾病或失调有关的其它基因相关的的治疗性分子，包括反义分子(miRNA、siRNA)或核酶。异源序列可以是自杀基因(例如HSV-tk或PNP或胞嘧啶脱氨酶；经修饰或未经修饰)、 生长因子或治疗性蛋白(例如因子IX、IL2等)。适用于本公开书的其它治疗性蛋白在所属领域中也容易鉴别。在一个实施方案中，载体内的异源多聚核苷酸包含已经经优化用于在人类细胞中表达的胞嘧啶脱氨酶。在另一个实施方案中，胞嘧啶脱氨酶包含已经人类密码子优化的序列，所述序列包含与野生型胞嘧啶脱氨酶相比增加胞嘧啶脱氨酶稳定性(例如降解减少或热稳定性提高)的突变。在另一个实施方案中，异源多聚核苷酸编码融合构建体，所述构建体包含与编码具有UPRT或OPRT活性的多肽的多聚核苷酸可操作地连接的胞嘧啶脱氨酶 (经人类密码子优化或未经优化，突变或未突变)。在另一个实施方案中，异源多聚核苷酸包括本公开书的CD多聚核苷酸(例如SEQ ID NO :3、5、11、13、15或17)。在另一个实施方案中，可复制逆转录病毒载体可包含编码包括胞嘧啶脱氨酶(如本文所述)的多肽的异源多聚核苷酸，且许多载体可进一步包含包括作为病毒启动子的初级转录物的一部分或连接于启动子的多聚核苷酸的miRNA或siRNA分子，所述启动子可以
17是细胞型或组织特异型。微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA。其位于编码或非编码基因的内含子、非编码基因的外显子或基因间区域内。miRNA基因由RNA聚合酶II转录，产生被称为初级前体 miRNA (pri-miRNA)的前体多聚核苷酸。核中的pri_miRNA由核糖核酸酶Drosha加工，产生 miRNA前体(pre-miRNA)，其形成短发夹结构。随后，pre-mi RNA通过输出蛋白(Exportin)5 被输送到细胞质，且被称为切酶(Dicer)的另一种核糖核酸酶进一步加工，产生活性的成熟 miRNA。成熟miRNA的长度约为21个核苷酸。通过与被靶向基因的mRNA的3’未翻译区域结合，并通过抑制蛋白质翻译或降解mRNA来抑制蛋白表达，所述成熟miRNA发挥其功能。miRNA涉及包括发育、细胞增殖、分化和癌症发展的生物过程。miRNA制谱(profiling) 研究表明一些miRNA表达是组织特异性的或在某些组织中富集。举例来说，miR-142-3p、 miR-181和miR-223表达已被证明在人类和小鼠的造血组织中富集(Baskervi 11 e等人， 2005 RNA 11,241-247 ;Chen 等人，2004 Science 303,83-86) 已经观察到一些miRNA在若干肿瘤中受到上调(致癌miRNA)或下调(阻遏miRNA) (Spizzo等人，2009 Cell 137，586el)。举例来说，miR-21在胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、 前列腺癌、结肠癌、胃癌、食道癌和宫颈癌、子宫平滑肌肉瘤、DLBCL、头颈癌中过度表达。对比之下，let-7的成员已被报导在胶质母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和结肠癌中受到下调。癌症中的miRNA表达的内稳态的重新建立是抑制或逆转癌症发展的必要机制。由于miRNA在癌症中调节的重要功能，开发潜在治疗方法的焦点已经集中在致癌 miRNA的反义介导性抑制(antigomer)。然而，miRNA替换可能代表同样有效的策略。在这种方法中，治疗上最有用的miRNA是在肿瘤中表达水平很低，但在正常组织中表达水平很高且因此可被耐受的miRNA。在癌症中被下调的miRNA可用作抗癌剂。实例包括mir-128_l、let_7、miR_26、 miR-124 和 miR-137(Esquela-Kerscher 等人，2008 Cell Cycle 7，759-764 ;Kumar 等人， 2008Proc Natl Acad Sci USA 105，3903-3908 ;Kota 等人，2009 Cell 137，1005-1017 ; Silber 等人，2008 BMC Medicine 6:141-17)。已报导了 miR-128 表达在中枢神经系统中水平很高，且已观察到其在胶质母细胞瘤中受到下调(Sempere等人，2004 Genome Biology 5 :R13. 5-11 ;Godlewski 等人，2008Cancer Res 68 : (22) 9125-9130)。miR-128 是由两种不同的基因miR-128-1和miR-128-2编码。这两种基因被加工成相同的成熟序列。已报导 Bmi-I 和 E2F3a 是 miR-128 的直接靶标(Godlewski 等人，2008Cancer Res 68: (22)9125-9130 ;Zhang 等人，2009 J. Mol Med 87:43-51)。此外，已观察到 Bmi-I 表达在各种人类癌症中被上调，所述癌症包括神经胶质瘤、套细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin' s lymphoma)、乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌。此外， 已经证明Bmi-I是不同组织干细胞自我更新所必需的，所述干细胞包括神经元干细胞以及神经胶质瘤中的“类干”细胞群体。虽然miRNA介导的细胞功能抑制的可能性已经有了许多的体外证明，但仍然很难像其它分子那样以产生体内作用所必需的效率将这些物质作为寡聚核苷酸或在病毒载体中递送(例如Li等人Cell Cycle 5:2103-21092006)。非复制性载体似乎在任何情况下
18都不足以有效地将治疗基因递送到很大一部分肿瘤中。然而，也很难发现如何利用复制性载体递送miRNA类型的药剂。特定来说，并不清楚如何将额外RNA序列并入可复制逆转录病毒的RNA基因组中，和如何维持复制效率并保持添加物稳定地并入基因组中。已经利用复制缺陷性逆转录病毒和慢病毒载体通过例如CMV或LTR等聚合酶II 启动子来稳定地表达pri-mi RNA，且证明可产生成熟miRNA。然而，这些载体不是必须经历逆转录病毒或慢病毒的完整生命周期达到复制病毒所必需的次数。基因组必须能经受比简单进入、整合和转录更多的事件。与使用基于RNA的病毒表达miRNA有关的问题包括(1) 病毒RNA基因组在RNA加工期间转录后步骤的完整性；(2)所插入盒在复制期间的稳定性； 和(3)作为从LTR启动子转录的病毒RNA的部分的pri-miRNA的适当加工，从而产生成熟 miRNA。因此，已经广泛利用在非复制性逆转录病毒和慢病毒载体中并入III型RNA聚合酶III启动子(例如U6和Hl启动子)来表达功能性小干扰RNA(SiRNA)，产生短发夹结构 RNA (Bromberg-White 等人，2004 J Virol 78 :9，4914-4916 ;Sliva 等人，2006 Virology 351,218-225 ；Haga 等人，2006，Transplant Proc 38(10) :3184_8)。用切酶裂解环序列，产生长度为21-22个核苷酸的成熟siRNA。shRNA可在细胞中稳定表达以便下调靶基因表达。 然而，通过向重组可复制逆转录病毒载体中并入所述盒、表达和切酶加工来产生成熟miRNA 仍然存在问题。在一个实施方案中，本发明提供一种重组可复制逆转录病毒载体，其含有初级前体miRNA的异源多聚核苷酸序列。在另一个实施方案中，初级前体miRNA是人类来源。在另一个实施方案中，初级前体RNA序列位于env基因下游。在另一个实施方案中，本发明提供一种重组可复制逆转录病毒载体，其含有位于 env基因下游的人类初级前体miR-128-2的异源多聚核苷酸序列(SEQ ID NO :32)。在癌症中被下调的miRNA可并入用于治疗基因递送的载体中，例如let_7、 miR-26、miR-124 和 miR-137 (Esquela-Kerscher 等人，2008 Cell Cycle 7，759-764; Kumar 等人，2008 Proc Natl Acad Sci USA 105，3903-3908 ;Kota 等人，2009Cell 137， 1005-1017 ;Silber 等人，2008 BMC Medicine 6:141-17)。在另一个实施方案中，本发明提供一种重组可复制逆转录病毒载体，其含有位于 env基因下游的与人类Hl启动子连接的短发夹结构人类pre-miR-128的异源多聚核苷酸序列(SEQ ID N0:33和SEQ ID NO :34)。在癌症中被下调的miRNA可并入用于治疗基因递送的载体中，例如 let-7、miR-26、miR-124 和 miR-137 (Esquela-Kerscher 等人，2008 Cell Cycle 7，759-764 ;Kumar 等人，2008Proc Natl Acad Sci USA 105，3903-3908 ;Kota 等人， 2009 Cell 137，1005-1017 ;Silber 等人，2008 BMC Medicine 6:141-17)。反义核酸是与特异性mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(Weintraub， Scientific American，262 :40，1990)。在细胞中，反义核酸与对应mRNA杂交，形成双链分子。因为细胞无法翻译双链mRNA，所以反义核酸干扰mRNA的翻译。优选约15个核苷酸的反义低聚物，这是因为其容易合成且在引入靶细胞中时相比大分子引起问题的可能性较小。使用反义方法抑制体外基因翻译在所属领域中是众所周知的(Marcus-Sakura，Anal. Biochem. ，172 :289，1988)。
反义核酸可用于阻断突变蛋白或显性激活基因产物(例如在阿尔茨海默氏病 (Alzheimer' s disease)中积聚的淀粉状前体蛋白)的表达。所述方法也可用于治疗亨廷顿氏病(Huntington' s disease)、遗传性中白金森综合症(hereditary Parkinsonism) 和其它疾病。特别关注与细胞增殖失调有关的基因的阻断。反义核酸也可用于抑制与毒性有关的蛋白的表达。使用寡聚核苷酸阻碍转录被称为三螺旋(三螺旋)策略，这是因为寡聚物在双螺旋DNA周围缠绕，形成三螺旋。因此，这些三螺旋化合物可被设计用于识别选定基因上的独
(Maher ^X, Antisense Res. and Dev. ，1 (3) 227,1991 ；Helene, C. ， Anticancer Drug Design,6(6) :569，1991)。核酶是能够以与DNA限制性内切酶类似的方式特异性地裂解其它单链RNA的RNA 分子。通过修饰编码这些RNA的核苷酸序列，有可能工程改造识别RNA分子中的特异性核苷酸序列并将其裂解的分子(Cech，J. Amer. Med. Assn.，260 :3030，1988)。所述方法的主要优点在于，因为这些分子是序列特异性的，所以只有具有特定序列的mRNA才被失活。如本文所用，术语“RNA干扰”(RNAi)是指由短的干扰核酸(siRNA或微小 RNA(miRNA))介导的序列特异性翻译后基因沉默过程。术语“能介导RNA干扰的介质”是指 siRNA以及当在细胞内转录时编码siRNA的DNA和RNA载体。术语siRNA或miRNA打算涵盖能介导序列特异性RNA干扰的任何核酸分子，例如短干扰RNA (siRNA)、双链RNA (dsRNA)、 微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡聚核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰寡聚核苷酸、化学修饰siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。用于设计发夹双螺旋的茎长度的合适范围包括20-30个核苷酸、30-50个核苷酸、 50-100个核苷酸、100-150个核苷酸、150-200个核苷酸、200-300个核苷酸、300-400个核苷酸、400-500个核苷酸、500-600个核苷酸和600-700个核苷酸的茎长度。用于设计发夹双螺旋的环长度的合适范围包括4-25个核苷酸、25-50个核苷酸或更长(如果发夹双螺旋的茎长度很长)的环长度。在某些情况下，具有长度超过21个核苷酸的双螺旋区域的发夹结构可促进有效的siRNA指导的沉默，与环序列和长度无关。本公开书的复制性逆转录病毒载体可通过表达经工程改造的siRNA或 miRNA (Dennis, Nature, 418 1222002)而用于治疗疾病，所述siRNA或miRNA关闭或降低控制患病细胞(包括肿瘤细胞)增殖或存活的关键基因的表达。所述靶标包括例如Rad 51 等基因，Rad 51是DNA修复中的关键酶，且在没有它的情况下细胞生长会受到显著限制。 其它靶标包括控制细胞生长的许多信号传导路径分子(Marquez & McCaffrey Hum Gene Ther. 19 :272008)。siRNA或miRNA可与从本公开书的相同或不同逆转录病毒载体表达细胞毒性基因组合使用。合适的细胞毒性基因的实例包含本公开书的胞嘧啶脱氨酶或经修饰的胞嘧啶脱氨酶。在使用中，逆转录病毒载体将通过肿瘤或其它靶组织复制，且在生长抑制发生之前，病毒首先整合入宿主基因组中并在所述细胞的生长被抑制之后继续制造病毒。用于筛选功能性miRNA或siRNA序列的方法在所属领域中是已知的。一般来说，设计有效siRNA或 miRNA序列中的关键特征通常是避免“脱靶”作用。然而，对于使用对肿瘤细胞具有高特异性的复制载体(例如本公开书的复制载体)来说，这些副作用不是非常重要，因为预期细胞最终都会死亡。本公开书的逆转录病毒载体可使用来自对应蛋白质没有被显著靶向的其它
20物种的细胞制得。所述细胞包括狗细胞系或鸡细胞系。或者，病毒可以通过在人类293衍生细胞或允许有效瞬时转染的其它细胞系上的瞬时转染来制得。对于所述用途来说，病毒不需要利用IRES，且siRNA或miRNA序列可仅在病毒基因组的适宜位点插入。所述位点包括包膜下游和复制性逆转录病毒的3’LTR上游的区域。或者，polIII转录单元可以插入具有适当siRNA或miRNA的病毒基因组中，典型地插入3’包膜基因下游。可插入一些不同的 siRNA或miRNA序列以确保靶基因的有效下调或一个以上基因的下调。合适的序列和靶标可以从所属领域技术人员已知的来源获得。例如· MIT/ICBP siRNA Database http: (//)web. mit. edu/sirna/- “ The MIT[Massachusetts Institute of Technology]/ICBP[Integrative Cancer Biology Program] siRNA Database是大学范围的科研成果，其用于分类这些实验上被确认的试剂且使所述信息可供MIT团体内部和外部的其它研究者使用(Massachusetts Institute of Technology)。· RNAi Central-http:(//)katahdin. cshl. org :9331/RNAi_web/scripts/ main2.pl RNAi resources，包括 siRNA 和 shRNA 设计工具(Hannon Lab, Cold Spring Harbor Laboratory)。# The RNAi ffeb-http:(//)www. rnaiweb. com/General resource。· siDIRECT-http: (//) genomics, jp/sidirect/用于哺乳动物 RNA 干扰的在线靶特异性 siRNA 设计(University of Tokyo，Japan)。· siRNA Database-含有针对各种生物体中的所有已知mRNA序列的siRNA靶标的综合性siRNA数据库(Protein Lounge系统生物学网站的部分)。· siRNA Database and Resources for RNA Interference Studies http: (//) www. rnainterference. org/· siRNA Selector-http:(//)bioinfo. wistar. upenn. edu/siRNA/siRNA. htm.贞用一组规则基于热动力学参数(Khvorova等人，2003 ；Schwarz等人，2003)和由Dharmacon 开发的序列相关决定因素(Reynolds等人，2004)来评估siRNA功能性。针对UniGene数据库使用BLAST来确定特异性(Wistar Institute)。· siRNA Target Finder http: (//)www(. )ambion. com/techlib/misc/siRNA_ finder, html (Ambion)。本公开书的复制性逆转录病毒也可表达天然存在的siRNA的靶标，所述靶标在表达上受限于特定细胞类型，使得载体复制在那些细胞类型中被显著抑制。基于鼠白血病病毒的重组可复制逆转录病毒载体的产生可允许高转导水平和因此体内基因递送的高效率。使用可复制逆转录病毒载体的一个主要问题在于先前所报导的病毒传播失控(Donahue 等人，J.Exp Med. 1992，176 :1124-1135 ;Calmes 等人，Blood 2005，106 :2530_2533 ； Seggewiss等人，Blood 2006,107:3865-3867)。因为病毒的性质，病毒传播最初可以在淋巴细胞内发生且随后传播到外周组织。对于抗肿瘤目的，以一定水平天然复制的一些体内正常细胞是造血细胞、肠壁细胞和一些内皮细胞。这些正常细胞是在循环中可有效感染病毒的潜在位点。一般来说这是不合需要的。例如这些正常细胞等细胞的任何离群感染(stray infection)可通过在这些细胞类型中包括天然存在的miRNA或miRNA组合的靶标来抑制。已经展示了使用miRNA靶标抑制免疫反应的一些可行性(Brown等人，Nat
21Biotechnol. 2007 25:1457-67)。这些靶标是与天然存在的miRNA序列具有同源匹配的小 RNA序列。这些序列可以插入本发明载体的任何适宜位点中，一般不会对载体活力造成显著有害的后果，除非在期望类型的细胞中。载体可如本文所述来制备和使用。在一个实施方案中，本发明提供一种重组可复制逆转录病毒载体，其在与IRES连接的转基因(例如yCD2或GFP)下游含有miR-142_3p靶序列(142_3pT，SEQ ID NO 35)的单拷贝。除了 miR181和miR-223以外，其它组织或细胞富含的miRNA的靶序列也可并入载体中以限制病毒以特异性组织或细胞型方式传播。举例来说，miR-133和miR206在肌肉组织中的表达水平很高(Kelly 等人，2008 Nature Medicine 14:11 1278-1283)。在另一个实施方案中，本发明提供一种重组可复制逆转录病毒载体，其在与IRES 连接的转基因(例如y⑶2或GFP)下游含有142-3pT(SEQ ID NO 36)的4个拷贝。除了 miR181和miR-223以外，其它组织或细胞富含的miRNA的靶序列也可并入载体中以限制病毒以特异性组织或细胞型方式传播。举例来说，miR-133和miR206在肌肉细胞中的表达水平很高。本发明提供miRNA的单个靶序列、多个靶序列或其组合的灵活性，且因此提供限制病毒在体外和体内(例如造血细胞和/或肌肉细胞)以组织和/或细胞特异性方式的失控传播(Kelly 等人，2008 Nature Medicine 14:11 1278-1283)。miRNA靶标可以插入转基因的3’，但在3’ LTR或IRES上游之前，和包膜3’端之后。一般来说，靶标不会插入蛋白质编码序列中。在其它实施方案中，异源多聚核苷酸可包含细胞因子，例如白细胞介素、Y干扰素等。可以从本公开书的逆转录病毒载体表达的细胞因子包括(但不限于)IL-I α、 IL-lbeta、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、 IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20 禾口 IL-21、抗 CD40、CD40L、IFN-y 和 TNF-α、可溶形式的TNF-α、淋巴毒素-α (LT_ α，也称为TNF-β )、LT_ β (在复合异源三聚体 LT-α 2-β 中发现)、0PGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-lBBL、DcR3、0X40L、TNF-γ (国际公开案第WO 96/14328号)、AIM-I(国际公开案第WO 97/33899号)、endokine_ α (国际公开案第 WO 98/07880 号)、0PG 和 neutrokine-α (国际公开案第 WO 98/18921 号)、0X40 和神经生长因子(NGF)，和可溶形式的Fas、CD30、CD27、CD40和4_IBB、TR2(国际公开案第WO 96/34095号)、DR3 (国际公开案第WO 97/33904号)、DR4 (国际公开案第WO 98/32856号)、 TR5(国际公开案第WO 98/30693号)、TRANK、TR9(国际公开案第WO 98/56892号)、TR10 (国际公开案第WO 98/54202号)、312C2(国际公开案第WO 98/06842号)和TR12，和可溶形式的⑶154、⑶70和⑶153。血管生成蛋白可用于一些实施方案中，尤其对于从细胞系产生蛋白质来说。所述血管生成因子包括(但不限于)神经胶质瘤源性生长因子(⑶GF)、血小板源性生长因子-A(PDGF-A)、血小板源性生长因子-B(PDGF-B)、胎盘生长因子(PIGF)、 胎盘生长因子-2 (PI GF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子_A (VEGF-A)、 血管内皮生长因子-2 (VEGF-2)、血管内皮生长因子B(VEGF-3)、血管内皮生长因子B-I 86(VEGF-B186)、血管内皮生长因子-D(VEGF-D)、血管内皮生长因子-D(VEGF-D)和血管内皮生长因子-E (VEGF-E)。成纤维细胞生长因子可通过本公开书的载体递送，且包括(但不限于)FGF-I、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10, FGF-IU FGF-12、FGF-13、FGF-14和FGF-15。造血生长因子可使用本公开书的载体递送，所述生长因子包括(但不限于)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(沙格司亭(sargramostim))、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(非格司亭(filgrastim))、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF、 CSF-1)、红细胞生成素(阿法依泊汀(印oetinalfa))、干细胞因子(SCF、c_kit配体、青灰因子)、巨核细胞集落刺激因子、PIXY321 (GMCSF/IL-3)融合蛋白等。本公开书的重组病毒一般能够将核酸序列转移到靶细胞中。术语“调节核酸序列”总体是指启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起点、增强子等，这些序列总体用于受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。 并不是所有的这些控制序列都必须存在，只要所选的编码序列能在适当宿主细胞中复制、 转录和翻译即可。所属领域技术人员容易从公开数据库和材料鉴别调节核酸序列。此外， 所属领域技术人员可鉴别适用于预期用途(例如体内、体外或体外)的调节序列。内部核糖体进入位点(“IRES”)是指在通常处于IRES的3’的编码序列翻译期间促进核糖体进入或滞留的核酸片段。在一些实施方案中，IRES可包含剪接受体/供体位点，但优选的IRES缺少剪接受体/供体位点。核糖体通常经由位于所有真核信使RNA的 5’端的帽序列进入mRNA。然而，这一普遍规律存在例外。在一些病毒mRNA中缺乏帽序列表明在这些RNA的内部位点上存在可允许核糖体进入的替代结构。迄今为止，已经在未加帽病毒mRNA的5’非编码区中鉴别了许多此类结构(根据其功能命名为IRES)，尤其例如在细小核糖核酸病毒中，例如脊髓灰质炎病毒(Pelletier等人，1988，Mol. Cell. Biol.，8， 1103-1112)和 EMCV 病毒(脑心肌炎病毒)(Jang 等人，J. Virol.，1988，62，2636-2643)。本公开书提供IRES在可复制逆转录病毒载体的情况中的用途。术语“启动子区”在本文中以其普通意义使用，是指包含DNA调节序列的核苷酸区域，其中调节序列来源于能结合RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列的转录的基因。 调节序列可与期望基因序列同源或异源。举例来说，可利用多种启动子，包括上文所述的病毒或哺乳动物启动子。异源核酸序列典型地处于病毒LTR启动子-增强子信号或内部启动子的控制下， 且逆转录病毒LTR内保留的信号仍可导致载体有效地整合到宿主细胞基因组中。因此，本公开书的重组逆转录病毒载体、期望序列、基因和/或基因片段可在一些位点中和不同调节序列的控制下插入。举例来说，插入位点可以是病毒增强子/启动子邻近位点(即5’LTR 驱动的基因座位)。或者，期望序列可插入调节序列远端位点(例如env基因3’的IRES序列)中或存在两个或两个以上异源序列的地方，一个异源序列可处于第一调节区的控制下且第二异源序列可处于第二调节区的控制下。其它远端位点包括病毒启动子序列，其中一个或多个期望序列的表达是通过启动子邻近顺反子的剪接，可使用内部异源启动子(例如 SV40或CMV)或内部核糖体进入位点(IRES)。在一个实施方案中，本公开书的逆转录病毒基因组含有在IRES下游包含克隆位点以用于插入期望/异源多聚核苷酸的IRES。在一个实施方案中，IRES位于逆转录病毒载体中env基因的3’，但位于期望异源多聚核苷酸的5’。因此，编码期望多肽的异源多聚核苷酸可操作地连接于IRES。在另一个实施方案中，包括靶向多聚核苷酸序列作为本公开书的重组逆转录病毒载体的部分。靶向多聚核苷酸序列是靶向配体(例如肽激素(例如调蛋白(heregulin))、 单链抗体、受体或受体的配体)、组织特异性或细胞类型特异性调节元件(例如组织特异性或细胞类型特异性启动子或增强子)或靶向配体与组织特异性/细胞类型特异性调节元件
23的组合。优选地，靶向配体可操作地连接于逆转录病毒的erw蛋白，从而产生嵌合逆转录病毒env蛋白。病毒GAG、病毒POL和病毒ENV蛋白可来源于任何合适的逆转录病毒(例如 MLV或慢病毒源性的)。在另一个实施方案中，病毒ENV蛋白是非逆转录病毒源性的(例如 CMV 或 VSV)。在一个实施方案中，本公开书的重组逆转录病毒可以将病毒靶向于特定细胞类型 (例如平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、间质干细胞、骨髓细胞、软骨细胞、上皮细胞、肠细胞、乳房细胞、赘生性细胞、神经胶质瘤细胞、神经元细胞和所属领域中已知的其它细胞)的方式遗传改造使得逆转录病毒载体的重组基因组被递送到非分裂靶细胞、分裂靶细胞或具有细胞增殖失调的靶细胞。在一个实施方案中，逆转录病毒载体是通过结合于在细胞外表面上具有分子的细胞而靶向于细胞。所述靶向逆转录病毒的方法利用靶向配体在逆转录病毒包膜上表达，以便帮助病毒靶向于具有与逆转录病毒表面上的靶向配体相互作用的受体或结合分子的细胞或组织。在病毒感染细胞之后，病毒将其核酸注入细胞且逆转录病毒遗传物质可整合入宿主细胞基因组。在另一个实施方案中，靶向操作利用细胞或组织特异性调节元件，以促进病毒基因组在主动利用调节元件的被靶向细胞中的表达和转录，如下文更详细地描述。转移的逆转录病毒遗传物质然后在宿主细胞内被转录和翻译成蛋白质。靶向调节元件典型地连接于 5，和/或3，LTR,从而产生嵌合LTR0通过将目的异源多聚核苷酸连同编码例如特异性靶细胞上的受体的配体的另一个基因插入本公开书的病毒载体，载体现在具有靶标特异性。病毒载体可通过连接例如糖、 糖脂或蛋白质而具有靶标特异性。靶向可使用靶向病毒载体的抗体来完成。所属领域技术人员将了解或容易确定，可插入与病毒包膜连接的病毒基因组或蛋白中以允许含有目的核酸序列的病毒载体的靶特异性递送的特异性多聚核苷酸序列。因此，在一个实施方案中，本公开书包括嵌合env蛋白，其包含可操作地连接于靶向多肽的逆转录病毒ENV蛋白。靶向多肽可以是细胞特异性受体分子、细胞特异性受体的配体、细胞特异性抗原表位的抗体或抗体片段，或所属领域中容易鉴别的可结合靶细胞或与靶细胞相互作用的任何其它配体。靶向多肽或分子的实例包括使用生物素-链霉亲和素作为连接子的二价抗体^tierme-Julan等人，J. Of General Virol.，73， 3251-3255(1992) ；Roux 等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 86,9079-9083(1989))；在包膜上含有编码针对半抗原的单链抗体可变区的序列的重组病毒(Russell等人，Nucleic Acids Research，21，1081-1085 (1993))；将肽激素配体克隆到逆转录病毒包膜中(Kasahara等人，Science，266，1373-1376(1994))；嵌合 EPO/env 构建体(Kasahara 等人，1994)；针对亲嗜性MLV包膜中的低密度脂蛋白(LDL)受体的单链抗体，导致表达LDL受体的HeLa细胞的特异性感染(Somia 等人，Proc. Natl. Acad, ki USA, 92, 7570-7574 (1995))；类似地，ALV 的宿主范围可通过并入整合素配体而改变，使得病毒现在能跨物种以特异性地感染大鼠胶质母细胞瘤细胞(Valsesia-Wittmann 等人，J. Virol. 68，4609-4619 (1994))；且 Dornberg 和其合作者(Chu 和 Dornburg，J.Virol 69,2659-2663(1995))已经报导了脾坏死病毒(SNV) (一种禽类逆转录病毒)的组织特异性靶向，其使用含有针对肿瘤标志物导向的单链抗体的包膜。
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本公开书提供一种产生能感染靶细胞的重组逆转录病毒的方法，其包括用以下载体转染合适宿主细胞和回收重组病毒所述载体包含编码病毒gag、病毒pol和病毒env的多聚核苷酸序列，和可操作地连接于调节核酸序列的异源多聚核苷酸。本公开书的逆转录病毒和方法提供可复制逆转录病毒，其不需要辅助病毒或其它核酸序列或蛋白质以便传播和产生病毒粒子。举例来说，本公开书的逆转录病毒的核酸序列编码例如本文分别讨论的群特异性抗原和逆转录酶(以及成熟和逆转录所必需的整合酶和蛋白酶)。病毒gag和pol可来源于慢病毒(例如HIV)或致癌病毒或γ逆转录病毒 (例如MoMLV)。此外，本公开书的逆转录病毒的核酸基因组包括编码病毒包膜(ENV)蛋白的序列。env基因可来源于任何逆转录病毒。erw可为允许人类和其它物种的细胞转导的双嗜性包膜蛋白，或可为只能转导小鼠和大鼠细胞的亲嗜性包膜蛋白。此外，可能需要通过将包膜蛋白与抗体或用于靶向于特定细胞类型的受体的特定配体连接来靶向重组病毒。如上所述，逆转录病毒载体可通过插入例如糖脂或蛋白质而具有靶标特异性。靶向操作通常通过使用抗体将逆转录病毒载体靶向于特定细胞类型上的抗原(例如在某些组织中发现的细胞类型，或癌细胞类型)来实现。所属领域技术人员将认识到或不经过多实验即可容易地确定，用于将逆转录病毒载体递送于特定靶标的特定方法。在一个实施方案中，erw基因来源于非逆转录病毒(例如CMV或VSV)。逆转录病毒源性的env基因的实例包括(但不限于)莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠类肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus) (HaMuSV)、鼠类乳腺致癌病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)。也可使用其他env基因，例如水泡性口炎病毒(VSV)(蛋白质G)、巨细胞病毒包膜(CMV)或流感病毒血细胞凝集素(HA)。在一个实施方案中，逆转录病毒基因组来源于致癌逆转录病毒，且更具体地来源于哺乳动物致癌逆转录病毒。“来源”意思是母体多聚核苷酸序列是已经通过插入或去除天然存在的序列(例如插入IRES、插入编码目的多肽或抑制核酸的异源多聚核苷酸、用来自不同逆转录病毒或病毒的更有效的启动子交换野生型启动子等)而被修饰的野生型致癌病毒。不同于本领域标准方法所产生的重组逆转录病毒，这些病毒存在缺陷且需要帮助以产生感染性载体粒子，本公开书提供可复制逆转录病毒。在另一个实施方案中，本公开书提供使用调节序列靶向的逆转录病毒载体。可利用细胞或组织特异性调节序列(例如启动子)来靶向基因序列在特异性细胞群体中的表达。本文其它地方描述用于本公开书的合适哺乳动物和病毒启动子。因此，在一个实施方案中，本公开书提供在逆转录病毒基因组的5’端具有组织特异性启动子元件的逆转录病毒。 典型地，组织特异性调节元件/序列位于逆转录病毒基因组的LTR的U3区中，包括例如用于赘生性细胞的细胞或组织特异性启动子和增强子(例如肿瘤细胞特异性增强子和启动子)，和诱导型启动子(例如四环素)。本公开书的转录控制序列也可包括与编码超抗原、细胞因子或趋化因子的基因天然连接的天然存在的转录控制序列。在一些情况下，可能需要调节表达。举例来说，取决于期望表达水平，可利用具有不同活性强度的不同病毒启动子。在哺乳动物细胞中，经常使用CMV立即早期启动子来提供强转录活化。当期望转基因的表达水平降低时，也已经使用了效力较低的CMV启动子的经修饰形式。当期望转基因在造血细胞中表达时，可使用逆转录病毒启动子，例如来自MLV 或MMTV的LTR。可使用的其它病毒启动子包括SV40、RSV LTR、HIV-I和HIV-2LTR、例如来自E1A、E2A或MLP区的腺病毒启动子、AAV LTR、花椰菜花叶病毒、HSV-TK和禽类肉瘤病毒。可使用类似的组织特异性或选择性启动子来实现在特异性组织或细胞中的转录， 以便降低对非靶向组织的潜在毒性或不当影响。举例来说，可使用例如PSA、前列腺碱性蛋白(probasin)、前列腺酸性磷酸酶或前列腺特异性腺激肽释放酶(hl^)来靶向前列腺中的基因表达。乳清辅助蛋白(WAP)可用于乳房组织表达(Andres等人，PNAS 84:1299-1303，
1987)。表1列举可使用的其它启动子/调节域。“组织特异性调节元件”是能驱动基因在一种组织中转录同时在其它组织类型中大体上保持“沉默”的调节元件(例如启动子)。然而，应了解组织特异性启动子在其沉默的那些组织中可具有可检测量的“背景”或“基础”活性。启动子在靶组织中被选择性地活化的程度可用选择性比(靶组织中的活性/对照织中的活性)表示。就此而言，可用于实施本公开的组织特异性启动子典型地具有大于约5的选择性比。选择性比优选地大于约15。在某些适应症中，可能需要在施用本公开书的重组可复制逆转录病毒(RRCR)之后的特定时间活化转录。这可以用可由激素或细胞因子调节的启动子进行。举例来说，在适应症是产生特异性类固醇或特异性类固醇导向的性腺组织的治疗应用中，使用受雄激素或雌激素调节的启动子可能是有利的。可由激素调节的所述启动子包括MMTV、MT-1、蜕皮激素和RuBisco。可使用其它受激素调节的启动子，例如响应于甲状腺、垂体和肾上腺激素的启动子。可使用的细胞因子和免疫蛋白响应启动子包括K和T激肽原(Kininogen) (Kageyama 等)κ, 1987)、 c_fos、TNF-α 、C β.I^SS (C-reactive protein) (Arcone 等)κ,
1988)、结合珠蛋白(haptoglobin)(Oliviero 等人，1987)、血清淀粉样蛋白 A2、C/EBP α、 IL-U IL-6 (Poli 和 Cortese, 1989)、补体 C3 (Wilson 等人，1990)、IL-8、α -1 酸性糖蛋白 (Prowse和Baumann，1988)、α -1抗胰蛋白酶、脂蛋白脂酶(Zechner等人，1988)、血管紧张素原(angiotensinogen) (Ron 等人，1990)、纤维蛋白原(fibrinogen)、c-jun(可由佛波醇酯(phorbol ester)、TNF- α、UV辐射、视黄酸和过氧化氢诱导)、胶原酶(由佛波醇酯和视黄酸诱导)、金属硫蛋白(可由重金属和糖皮质激素诱导)、基质降解酶(Mromelysin) (可由佛波醇酯、白细胞介素-1和EGF诱导)、α-2巨球蛋白和α-1抗胰凝乳蛋白酶 (antichymotrypsin)。也可使用肿瘤特异性启动子(例如骨钙素(osteocalcin)、缺氧反应
(hypoxia-responsive element ；HRE)、MAGE_4、CEA、α -甲月台胃白(α -fetoprotein)、 GRP78/BiP和酪氨酸酶)来调节肿瘤细胞中的基因表达。此外，所述启动子清单不应解释为穷尽性的或限制性的，所属领域技术人员将知晓可与本文所公开的启动子和方法结合使用的其它启动子。表1组织特异性启动子
26组织_启动子_
胰腺胰岛素弹性蛋白淀粉酶
pdr-1 pdx-1葡糖激酶肝脏白蛋白PEPCK HBV增强子
A曱胎蛋白载脂蛋白Ccx-I 抗胰蛋白酶卵黄蛋白原，NTF-AB转曱状腺素蛋白 (Transthyretin) 骨骼肌肌球蛋白H链肌肉肌酸激酶
肌肉肌萎缩蛋白钙蛋白酶p94 (Dystrophin Calpain p94 Skeletal)
α-肌动蛋白快速肌钙蛋白1 (oc-actin fast troponin 1) 皮肤角蛋白K6、角蛋白Kl
肺CFTR人细胞角蛋白18 (Κ18)
肺表面活性蛋白A、B和C CC-IO Pl 平滑肌sm22 α SM-cx-肌动蛋白
内皮内皮素(Endothelin )-1、E-选择素(selectin )、von Willebrand
因子 TIE (Korhonen 等人，1995 )、KDR/flk-Ι 黑素细胞
酪氨酸酶
脂肪组织脂蛋白脂肪_ Zechner等人,1988 )、降脂肪蛋白(Adipsin)
(Spiegelman等人，1989)、乙酰辅酶A羧化酶(Pape和 Kim, 1989)、磷酸甘油脱氢酶(Dani等人，1989)、脂肪细胞P2 (Hunt 等人，1986) 乳房乳清酸性蛋白(WAP) ( Andres等人PNAS 84:1299-1303
1987)
血液β-球蛋白
应进一步了解，某些启动子虽然在活性上不受限于单一组织类型，但仍然可能显示选择性，因为其在一组组织中可能有活性，而在另一组组织中活性较低或沉默。所述启动子也称为“组织特异性”，且预期用于本公开书。举例来说，在各种中枢神经系统(CNS)神经元中有活性的启动子可在治疗上用于防止因中风所致的伤害，中风可影响许多不同的大脑区域。因此，本公开书中所用的组织特异性调节元件适用于调节异源蛋白以及可用作本发明逆转录病毒载体中的靶向多聚核苷酸序列。在另一个实施方案中，本公开书提供包括重组逆转录病毒源性的构建体的质粒。 质粒可以直接引入靶细胞或细胞培养物中，例如NIH 3T3或其它组织培养细胞。所得细胞将逆转录病毒载体释放到培养基中。本公开书提供一种多聚核苷酸构建体，其从5’到3’包含可用于起始转录的启动子或调节区；Psi包装信号；gag编码核酸序列；pol编码核酸序列；erw编码核酸序列；内部核糖体进入位点核酸序列；编码标志物、治疗或诊断多肽的异源多聚核苷酸；和LTR核酸序列。如本文其它地方所述和如下所示，本公开书的多聚核苷酸构建体的各种链段(例如重组可复制逆转录病毒多聚核苷酸)部分取决于期望宿主细胞、表达时间或量和异源多聚核苷酸而经工程改造。本公开书的可复制逆转录病毒构建体可分为多个结构域，它们可由所属领域技术人员单独修饰。举例来说，启动子可包括具有如SEQ ID NO 19、20或22的核苷酸1到约核苷酸 582中所述的序列的CMV启动子，且可包含对一个或多个(例如2-5、5-10、10-20、20-30、 30-50、50-100个或以上核酸碱基)核酸碱基所作的修饰，只要经修饰的启动子能够引导和起始转录即可。在一个实施方案中，启动子或调节区包含CMV-R-TO域多聚核苷酸。 CMV-R-TO域包含来自人类巨细胞病毒的立即早期启动子和MLV R-TO区的融合体。在一个实施方案中，CMV-R-TO域多聚核苷酸包含如SEQ ID NO 19、20或22的约核苷酸1到约核苷酸1202所述的序列，或与如SEQ ID NO 19、19或22所述的序列具有至少95%同一性的序列，其中所述多聚核苷酸促进与其可操作地连接的核酸分子的转录。多聚核苷酸的gag域可来源于多种逆转录病毒，但典型地来源于致癌逆转录病毒且更具体地来源于哺乳动物致癌逆转录病毒。在一个实施方案中，gag域包含来自约核苷酸1203到约核苷酸观19的序列或与所述序列具有至少95^^98^^99%或99. 8% (四舍五入到十分位)同一性的序列。多聚核苷酸的Pol域可来源于多种逆转录病毒，但典型地来源于致癌逆转录病毒且更具体地来源于哺乳动物致癌逆转录病毒。在一个实施方案中，pol域包含来自约核苷酸编号观20 到约核苷酸6358的序列或与所述序列具有至少95% ,98^^99%或99. 9% (四舍五入到十分位)同一性的序列。多聚核苷酸的erw域可来源于多种逆转录病毒，但典型地来源于致癌逆转录病毒或Y-逆转录病毒且更具体地来源于哺乳动物致癌逆转录病毒或Y-逆转录病毒。在一些实施方案中，env编码域包括双嗜性env域。在一个实施方案中，env域包括来自约核苷酸编号6359到约核苷酸8323的序列或与所述序列具有至少95^^98^^99%或 99.8% (四舍五入到十分位)同一性的序列。多聚核苷酸的IRES域可从任何内部核糖体进入位点获得。在一个实施方案中，IRES来源于脑心肌炎病毒。在一个实施方案中，IRES 域包含来自约核苷酸编号8327到约核苷酸8876的序列或与所述序列具有至少95%、98% 或99% (四舍五入到十分位)同一性的序列，只要所述域允许核糖体进入即可。异源域可包含本公开书的胞嘧啶脱氨酶。在一个实施方案中，CD多聚核苷酸包含经人类密码子优化
28的序列。在另一个实施方案中，CD多聚核苷酸编码具有胞嘧啶脱氨酶的突变多肽，其中所述突变赋予增加的热稳定性，这使得解链温度(Tm)升高10°C，从而允许在更为宽广的温度范围下的持续动力学活性和提高的蛋白质累积水平。在一个实施方案中，胞嘧啶脱氨酶包含如SEQ ID NO 19或22的约核苷酸编号8877到约9353所述的序列。异源域之后可紧跟聚嘌呤富集域。3’ LTR可来源于任何数目的逆转录病毒，典型地致癌逆转录病毒且优选地哺乳动物致癌逆转录病毒。在一个实施方案中，3’ LTR包括U3-R-TO域。在另一个实施方案中，LTR包括如SEQ ID NO 19的约核苷酸9405到约9998所述的序列，或与其具有至少 95%、98%或99.5% (四舍五入到十分位)同一性的序列。本公开书还提供一种重组逆转录病毒载体，其从5’到3’依次包含CMV-R_U5，即人类巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区的融合体；PBS，即逆转录酶的引物结合位点；5，剪接位点；Ψ包装信号；gag,即MLV群特异性抗原的ORF ；pol,即MLV聚合酶多聚蛋白的ORF ；3，剪接位点；4070Aenv,即MLV品系4070A的包膜蛋白的ORF ；IRES,即脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点；经修饰的胞嘧啶脱氨酶(经热稳定化和密码子优化)；PPT， 即聚嘌呤束；和U3-R-U5，即MLV长末端重复序列。这个结构在图3中进一步描绘。本公开书还提供一种包括如SEQ ID N0:19、20或22所述的序列的逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可用于治疗多种疾病和失调，包括许多细胞增殖疾病和失调 (参看例如美国专利第 4，405，712 和 4，650，764 号；Friedmann, 1989，Science, 244 1275-1281 ；Mulligan,1993, Science,260 :926-932, R.Crystal,1995, Science 270 404-410，其各自以全文引用的方式并入本文中；另外也参看The Development of Human Gene Therapy, Theodore Friedmann 编，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1999. ISBN 0_87969-5观-5，其以全文引用的方式并入本文中)。本公开书还提供用于治疗细胞增殖失调的基因疗法。所述疗法通过将适当的治疗性多聚核苷酸(例如反义分子、核酶、自杀基因、siRNA)引入到患有增殖失调的受试对象的细胞中来实现其治疗作用。多聚核苷酸构建体可使用本公开书的重组逆转录病毒载体来递送，尤其当所述载体是基于能感染分裂细胞的MLV时。此外，如本文所述的治疗方法(例如基因疗法或基因递送方法)可在体内或体外进行。优选在基因治疗之前去除大部分肿瘤，例如通过外科手术或通过放射。在一些方面， 逆转录病毒治疗可在外科手术、化学治疗或放射治疗之后或之前进行。因此，本公开书提供一种能感染非分裂细胞、分裂细胞或赘生性细胞的重组逆转录病毒，其中重组逆转录病毒包含病毒GAG ；病毒POL ；病毒ENV ；可操作地连接于IRES的异源核酸；和包装、逆转录和整合所必需的顺式作用核酸序列。重组逆转录病毒可以是慢病毒 (例如HIV)，或可以是致癌病毒。如上文对于产生重组逆转录病毒的方法所述，本公开书的重组逆转录病毒可进一步包括VPR、VIF、NEF、VPX、TAT、REV和VPU蛋白的至少一种。不希望受特定理论束缚，相信这些基因/蛋白产物中的一种或一种以上对于增加所产生的重组逆转录病毒(例如NEF)的病毒滴度至关重要，或可能是感染和包装病毒粒子所必需的。本公开书还提供一种将核酸转移到靶细胞以提供特定核酸(例如异源序列)的表达的方法。因此，在另一个实施方案中，本公开书提供一种在靶细胞中引入和表达异源核酸的方法，其包含用本公开书的重组病毒感染靶细胞，和在靶细胞中表达异源核酸。如上文所述，靶细胞可以是任何细胞类型，包括分裂、非分裂、赘生性、永生化、经修饰细胞和所属领域技术人员知晓的其它细胞类型，只要它们能被逆转录病毒感染即可。可能需要通过用本公开书的方法引入核酸序列(例如异源核酸序列)来调整细胞中的基因表达，其中核酸序列例如产生反义或核酶分子。术语“调整”表示当基因过度表达时抑制基因表达，或者当基因表达不足时增强基因表达。当细胞增殖失调与基因表达相关时，可使用在翻译水平上干扰基因表达的核酸序列。这种方法利用例如反义核酸、核酶或三螺旋介质，通过用反义核酸或三螺旋介质屏蔽特异性mRNA，或通过用核酶裂解特异性mRNA 来阻断特定mRNA的转录和翻译。可能需要将编码生物反应调节剂(例如细胞因子)的核酸转移到细胞或受试对象中。所述类别包括免疫增强剂，包括编码被分类为“白细胞介素”的许多细胞因子的核酸。 这些生物反应调节剂包括例如白细胞介素1到15，以及本文其它地方所述的其它反应调节剂和因子。虽然不一定根据相同机制工作，但所述类别也包括干扰素且尤其是Y干扰素、 肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。其它多肽包括例如血管生成因子和抗血管生成因子。可能需要将所述核酸递送到骨髓细胞或巨噬细胞以治疗酶缺陷或免疫缺陷。也可将编码生长因子、毒性肽、配体、受体或其它生理学上重要的蛋白质的核酸引入特定靶细胞中。本公开书可用于递送促进药物特异性靶向和作用的异源多聚核苷酸。举例来说， EGF受体家族成员HER2 (参看例如SEQ ID NO 23和24)是药物曲妥珠单抗(trastuzumab) (赫赛汀(Here印tin) ，Genentech)的结合靶标。曲妥珠单抗是抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)的介导物。活性利用免疫组织化学优先被靶向于2+和3+级过度表达的HER2表达细胞，而不是 1+级禾口非表达细胞(Herceptin prescribing information, Crommelin 2002)。 通过在低HER2肿瘤中引入表达HER2或截短HER2 (只表达胞外域和跨膜域)的载体来增强 HER2的表达可促进ADCC的最佳触发并克服在临床应用上观察到的快速出现HER2抗性。用yCD2 (包含SEQ ID NO 19的约8877到9 取代HER2的胞内域可允许HER2 的细胞表面表达和y⑶2的胞质定位。HER2胞外域(EOT)和跨膜域(TM) (SEQ ID NO 23的约 175 到 2200 位的约 2026bp)可通过 PCR 扩增(Yamamoto 等人，Nature 319 :230-234, 1986 ；Chen 等人，Cane. Res. ,58 1965-1971，1998)或化学合成(BioBasic Inc.，Markham, Ontario，Canada)，并插入载体 pAC3-yCD2SEQ ID NO :19 中的 IRES 与 yCD2 基因之间(例如在SEQ ID NO 19的约核苷酸8876与8877之间)。或者，yCD基因可被切除并用编码HER2 多肽或其片段的多聚核苷酸取代。仅具有ECD和TM域的赫赛汀结合域IV(1910到2200位的约^Obp)的另一种截短HER2可如上文所述被扩增或化学合成并使用(Landgraf 2007 ； Garrett 等人，J. of Immunol.，178 :7120-7131，2007)。具有融合于 IV 和 TM 域的天然信号肽(175-237位的约69bp)的所述截短形式的另一种修饰体可如上文所述被化学合成和使用。所得病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。或者，如上所述的HER2和修饰体可在含有不同ENV基因或其它适当表面蛋白的单独载体中表达。这种载体可以是编码目的包膜和基因的可复制性(Logg等人J. Mol Biol. 369 1214 2007)或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J. Virol 65:1202 1991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人类细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu 2000，Baum 等人，Mol. Therapy，13 (6) 1050-1063，2006)。举例来说，多聚核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID NO 19的GAG和POL和y⑶2基因被缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV-g的异嗜性ENV域，且IRES或启动子(例如RSV)可操作地直接连接于 HER2、HER2 ECDTM、HER2 ECDIVTM 或 HER2 SECDIVTM。用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生携带被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的一种病毒的基因组的子代病毒粒子。这一点同样适用于假型逆转录病毒粒子的其它包膜。举例来说，上述来源的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和HER2(或变异体)的子代病毒粒子。所得病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。最近，已经将Y逆转录病毒XMRV与具有在前列腺组织中显示强复制优先性的病毒的人类前列腺癌联系起来(R. khlaberg等人PNAS106 16351-163562009)。所述病毒似乎非常类似于异嗜性MLV。在本发明的一个实施方案中，提供非复制性逆转录病毒载体，其具有治疗基因(胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶、其它前药活化基因、干扰素、IL-2、IL-12、其它细胞因子、P53其它抗癌基因、抗癌miRNA等)与能由XMRV gag和gagpol功能物互补的包膜基因，例如双嗜性包膜、GALV包膜、VSVg蛋白包膜或所属领域技术人员已知的其它包膜。非复制性载体多聚核苷酸作为DNA或RNA分子利用以下物质中的一种被递送到患者或动物前列腺癌非病毒或物理递送系统；异源病毒递送系统，例如腺病毒载体；或以所制造的逆转录病毒粒子的形式。一旦被递送后，非复制性载体将通过XMRV互补而传播，且邻近细胞将发生感染，直至到达XMRV感染边界为止，此时XMRV互补不再可用。治疗基因然后可仅在 XMRV感染区域具有作用(例如在施用前药后)。可使用本发明的复制性逆转录病毒载体实现相同的拯救作用。这种策略(与治疗基因互补的非复制性载体)可用于任何逆转录病毒疾病(HIV感染、HTLVl感染、其它与逆转录病毒相关的癌症)或任何病毒或病毒相关疾病 (在宫颈癌、EBV相关淋巴瘤或癌瘤等中的HPV感染和HPV E6 & E7表达)。发展曲妥珠单抗抗性的另一方面涉及干扰曲妥珠单抗活性所必需的胞内信号传导。抗性细胞显示缺少 PTEN 和 p27kipl 表达较低(Fujita,Brit J. Cancer, 94 =247,2006 ； Lu 等人，Journal of the National Cancer Institute, 93 (24) : 1852-1857，2001 ;Kute 等人，Cytometry Part A 57A :86_93，2004)。举例来说，编码 PTEN (SEQ ID NO :25)的多聚核苷酸可被重组产生或化学合成(BioBasic Inc.，MarWiam，Canada)，并可操作地直接插入载体pAC3-y⑶2 SEQ ID NO :19或22中的y⑶2多聚核苷酸之后，或连同先前所述的连接子序列一起插入，或代替yCD2插入。在另一个实施例中，编码PTEN的多聚核苷酸可如上合成并插入IRES与y⑶2序列之间，或连同先前所述的连接子一起插入。或者，PTEN可在含有不同ENV基因或其它适当表面蛋白的单独载体中表达。这种载体可以是编码目的包膜和基因的可复制性(Logg等人J. Mol Biol. 369 :1214 2007)或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J.Virol 65:12021991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人类细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu，Rev Med
31Virol. 2000, Baum, Mol. Ther. 13(6) 1050-1063，2006)。举例来说，多聚核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID NO 19的GAG和POL和yCD2基因被缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV_g 的异嗜性ENV域，且IRES或启动子(例如RSV)可操作地直接连接于PTEN。用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生带有被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的一种病毒的基因组的子代病毒粒子[Emi 1991]。这一点同样适用于假型逆转录病毒粒子的其它包膜。举例来说，上述来源的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和PTEN(或变异体)或只编码PTEN的子代病毒粒子。所得病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。类似地，编码p27kipl (SEQ ID NO :27和观)的多聚核苷酸可被化学合成 (BioBasic Hie.，Markham，Canada)，并可操作地直接插入载体pAC3_yCD2 SEQ ID NO :19 中的y⑶2基因之后，或连同连接子序列一起插入。在另一个实施例中，编码p2^dpl的多聚核苷酸可如上合成并插入IRES与yCD2序列之间，或连同先前所述的连接子一起插入或代替y⑶2基因插入。或者，p27kipl可在含有不同ENV基因或其它适当表面蛋白的单独载体中表达。 这种载体可以是编码目的包膜和基因的可复制性(CR. Logg等人J. Mol Biol. 369 :1214 2007)或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J. Virol 65:1202 1991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人类细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白O^alu 2000, Baum 2006，上文)。举例来说，多聚核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID N0:19的 GAG和POL和y⑶2基因被缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV_g的异嗜性ENV域，且IRES或启动子(例如RSV)可操作地直接连接于p2Aipl。用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生一种病毒的基因组被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的子代病毒粒子[Emi 1991]。这一点同样适用于假型逆转录病毒粒子的其它包膜。举例来说，如上所述来源于SEQ ID NO: 19和22的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和p2^dpl (或变异体)的子代病毒粒子。所得病毒可与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗和5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。在另一个实施例中，CD20是药物利妥昔单抗(rituximab) (Rituxan , Genentech) 的结合靶标。利妥昔单抗是补体依赖性细胞毒性(CDC)和ADCC的介导物。根据流式细胞术测量，具有较高平均荧光强度的细胞显示提高的利妥昔单抗敏感性(van Meerten等人， Clin Cancer Res 2006 ；12 (13) :4027-4035,2006) 通过在低 CD20B 细胞中引入表达 CD20 的载体来增强⑶20表达可促进ADCC的最佳触发。举例来说，编码CD20(SEQ ID NO : 和30)的多聚核苷酸可被化学合成(BioBasic Inc.，Markham, Canada)，并连同先前所述的连接子序列一起可操作地直接插入载体 pAC3-yCD2 (-2) SEQ ID NO 19或22中的yCD2基因之后，或代替yCD2基因插入。在另一个实施例中，编码⑶20的多聚核苷酸可如上合成并插入IRES与y⑶2序列之间，或连同先前所述的连接子一起插入。作为另一个替代方案，⑶20序列可在通过Mil和Notl消化切除 CD基因后插入pAC3-yCD2载体中。在另一个实施例中，编码⑶20 (SEQ ID NO 29和30)的多聚核苷酸可被化学合成(BioBasic Inc.，Markham, Canada)，并插入含有非双嗜性ENV基因或其它适当表面蛋白的载体中CTedder等人，PNAS，85 :208_212，1988)。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人类细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、 GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu 2000, Baum 2006)。举例来说，多聚核苷酸可包括如下序列，其中SEQ ID NO 19的GAG和POL和yCD2基因被缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV_g的异嗜性ENV域，且IRES或启动子(例如RSV)可操作地直接连接于⑶20。用VSVG假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生含有被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的一种病毒的基因组的子代病毒粒子[Emi 1991]。这一点同样适用于假型逆转录病毒粒子的其它包膜。举例来说，如上所述来源于SEQ ID NO :19或22的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和CD20的子代病毒粒子。所得病毒可与美罗华(Rituxan)和/或5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。类似地，用仅编码CD20标志物的载体感染肿瘤可导致肿瘤可通过使用美罗华来治疗。嘧啶合成代谢中所涉及的酶和辅因子的水平可构成限制。与敏感细胞系相比， 0PRT、胸苷激酶(TK)、尿苷磷酸激酶和嘧啶核苷磷酸化酶在5-FU抗性癌细胞中的表达水平很低(Wang等人，Cancer Res.，64 :8167_8176，2004)。大群体分析显示酶水平与疾病结果的相关性(Fukui 等人，Int，1. J. OF Mol. Med.，22 :709-716, 2008)。可利用 CD 和其它嘧啶合成代谢酶(PAE)的共表达来增加活性且因此增加氟嘧啶药物的治疗指数。为了进一步增加含yCD2/PAE载体的遗传稳定性(参看例如图幻，可化学合成在序列中具有随机突变的酶编码基因。这些突变可以是基本上随机的，或可以仅由每个氨基酸的摆动位置上的突变组成。突变序列的文库如先前对于SEQ ID NO: 11和13所述插入y⑶2 基因下游或代替yCD2基因插入，以产生质粒文库，其可接着通过瞬时转染细胞或同等物而用于产生感染粒子文库。可用编码融合多肽的逆转录病毒感染敏感细胞并用适当化学物进行筛选。DNA改组或“分子育种”允许改组遗传信息，从而产生具有期望特性的重组体。已经利用DNA改组改良了不同的蛋白质和酶(Stemmer 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91(22) 10747-51 ；Stemmer 1994 Nature 370(6488) :389-91)。基因重组是推动许多病毒进化的主要动力。在逆转录病毒中，两个共包装逆转录病毒基因组之间的重组可以每复制周期高达40%的速率发生。每个复制周期中的高重组速率使得遗传信息能被快速改组，从而在短时间内产生具有新突变模式和表型的重组体。举例来说，含有来自6种鼠类白血病病毒的重组亲嗜性包膜序列的文库的逆转录病毒的分子育种产生具有新向性的病毒克隆。使用相同方法，筛选具有提高的稳定性和加工产率的一些病毒克隆(Soong等人，2000 Nat Genet 25(4) :436-9 ;Powell 等人，2000 Nat Biotechnol 18(12) :1279-82)。并入本发明中的多聚核苷酸序列有时不稳定，从而导致多聚核苷酸序列随着时间会从病毒基因组中缺失。其原因尚未完全了解，但清楚使用本发明筛选已经在异源多聚核苷酸序列内获得最佳重组的重组病毒克隆的序列依赖性分子育种可用于筛选具有较大载体稳定性的病毒克隆。举例来说，HSV-TK编码序列(SEQ ID NO 37)在一些情形中没有预期中稳定。重组逆转录病毒载体的分子育种涵盖用于筛选具有较大载体稳定性的重组载体的HSV-TK简并编码序列的库。可化学合成(Bio Basic Inc, Markham, Canada)随机突变疱疹胸苷激酶(TK)。合成序列可插入SEQ ID NO 19中的y⑶2序列的3’，或在切除⑶2基因后独自插入pAC3-yCD2载体骨架中。如先前所述包装逆转录病毒载体混合物。用载体感染小鼠成纤维细胞LMTK细胞或人类143Tk细胞并在HAT培养基中筛选TK活性(Hiller等人，Mol. Cell Biol. 8 (8) :3298-3302,1988)。在 HAT 培养基中再次筛选的新鲜 LMTK_/143Tk_ 细胞的抗性细胞上清液的连续传代允许筛选表达TK的稳定载体。可分离TK+抗性细胞并用标准PCR型技术拯救TK序列以用于突变分析(Cowell等人，CDNA Library Protocols，由 Humana Press发行，1996)。以此方式，筛选功能蛋白表达和逆转录病毒载体构建体的基因组稳定的序列。类似策略可用于 UPRT(SEQ ID NO :11，13)、OPRT(SEQ ID NO :15，17) (Olah 等人，Cancer Res. 40 :2869-2875,1980 ；禾口 Suttle，Somatic Cell & Mol. Genet.，15 (5) 435-443,1989)和其它目的基因。此外，通过PCR在IRES-插入基因中筛检连续传代的全长插入物之后，连续传代策略可用于非筛选基因和基因组DNA。可纯化全长插入物，并重新克隆到病毒载体中，然后进行再测试。所述程序可进行若干循环以筛选最稳定的基因。所述策略也可用于具有或不具有肿瘤的动物和甚至患者组织中的传代。或者，OPRT, UPRT, TK或其它PAE可在含有不同ENV基因或其它适当表面糖蛋白的单独载体中表达。这种载体可以是编码目的包膜和基因的可复制性(Logg等人J. Mol Biol. 369 1214 2007)或非复制性“第一代”逆转录病毒载体(Emi等人J. Virol 65:1202 1991)。在后一种情况下，已有的病毒感染会提供互补gag和pol以允许“非复制性”载体从任何先前感染细胞进行感染传播。替代性ENV和糖蛋白包括能感染人类细胞的异嗜性和多嗜性ENV和糖蛋白，例如来自MLV的NZB品系的ENV序列和来自MCF、VSV、GALV和其它病毒的糖蛋白(Palu 2000，Baum 2006，上文)。举例来说，多聚核苷酸可包括如下序列，其中GAG和POL基因被缺失，ENV对应于NZB MLV或VSV_g的异嗜性ENV域，且IRES或启动子(例如RSV)可操作地直接连接于0PRT、UPRT, TK或其它PAE基因。用VSV-g假型病毒和双嗜性逆转录病毒混合感染细胞会产生一种病毒的基因组被另一种病毒的包膜蛋白衣壳化的子代病毒粒子[Emi等人，J. Virol. 65 :1202，1991]。这一点同样适用于假型逆转录病毒粒子的其它包膜。举例来说，如上所述来源于SEQ ID N0 19和22的逆转录病毒所造成的感染会产生能在被感染细胞中编码yCD2和OPRT的子代病毒粒子。所得病毒可与5-FC结合用于治疗受试对象的细胞增殖失调。本公开书的重组逆转录病毒可用于治疗神经元失调，所述逆转录病毒例如可任选地含有外源基因，例如编码受体的基因或编码配体的基因。如上所述，所述受体包括响应于多巴胺、GABA、肾上腺素、去甲肾上腺素、5-羟色胺、谷氨酸盐、乙酰胆碱和其它神经肽的受体，如上所述。可在神经元失调中提供治疗作用的配体的实例包括多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、Y-氨基丁酸和5-羟色胺。必需配体在被感染供体细胞分泌之后发生扩散和摄取在受试对象的神经细胞在产生所述基因产物方面存在缺陷的失调中是有益的。 经遗传改造以分泌神经营养因子(例如神经生长因子(NGF))的细胞可能用于防止胆碱能神经元退化，所述神经元如果不经治疗可能会死亡。或者，被移植入患有基底神经节失调(例如帕金森症(Parkinson' s disease)) 的受试对象中的细胞可被修饰以含有编码多巴胺前体L-DOPA的外源基因。帕金森症的特征在于中脑黑质中缺少以基底神经节作为主要靶器官的多巴胺神经元。可用本公开书的方法类似地治疗的其它神经元失调包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿
34氏病、因中风引起的神经元损伤和脊髓损伤。阿尔茨海默氏病的特征在于基底前脑的胆碱能神经元退化。这些神经元的神经递质是乙酰胆碱，其是所述神经元的生存所必需的。可用所述的本公开书的方法植入被含有促进这些神经元生存的因子的外源基因的本公开书的重组逆转录病毒感染的胆碱能细胞。在中风后，海马以及皮层细胞的CAl中的细胞发生选择性损失，这可能是这些患者的认知和记忆损失的基础原因。一旦被鉴别出来，负责CAl 细胞死亡的分子可通过本公开书的方法抑制。举例来说，反义序列或编码拮抗剂的基因可被转移到神经元细胞中并植入大脑海马区。对于因蛋白产物缺乏引起的疾病，基因转移可将正常基因引入被感染组织以用于取代治疗，以及利用反义突变来产生疾病的动物模型。举例来说，可能需要将因子IX编码核酸插入用于感染肌肉或肝细胞的逆转录病毒中。本公开书还提供用于治疗细胞增殖失调或免疫失调的基因疗法。所述疗法通过将反义或显性阴性编码多聚核苷酸引入具有增殖失调的细胞中来实现治疗作用，其中所述多聚核苷酸结合于细胞增殖失调的相关基因并防止其翻译或表达。可使用本公开书的重组逆转录病毒载体递送适用于治疗或调节细胞增殖失调(例如反义多聚核苷酸)的异源核酸。 在另一个实施方案中，通过引入本公开书的CD多聚核苷酸、表达多聚核苷酸以产生包含胞嘧啶脱氨酶活性的多肽和使细胞与可产生细胞毒性量的5-FU的量的5-氟胞嘧啶接触可产生细胞毒性量的5-FU的时间来治疗细胞增殖失调。目前已有许多化学治疗剂在市面销售，其具有从完全缓解到暂时缓解的不同程度的效果和复发率达到预期的延长寿命。市面销售的一些癌症治疗剂是以肿瘤的血管生成特性为目标。组合物以肿瘤的血管生成为目标，设法减少供应给肿瘤或癌细胞的血液和营养物，从而减小肿瘤并延长受试对象的寿命。VEGF是已知在肿瘤生长中起作用的血管生成因子。因此，已经开发了作为抗癌剂的VEGF拮抗剂。人类VEGF介导正常和恶性脉管系统中的新生血管生成；其在大多数恶性肿瘤中过度表达，且高含量已经与许多患者的较高转移风险和不良预后有关。当VEGF在体外血管生成模型中与其受体相互作用时，发生内皮细胞增殖和新血管形成。在动物模型中，已经证明了 VEGF诱导血管内皮细胞增殖/迁移，维持新形成血管的存活，并提高血管通透性。VEGF拮抗剂靶向VEGF信号传导路径或负向调节VEGF信号传导路径。实例包括VEGF抑制剂(例如直接抑制VEGF (例如VEGF-A、-B、-C或-D)的介质，例如通过结合VEGF (例如抗VEGF抗体，例如贝伐单抗(bevacizumab) (AVASTIN )或兰尼单抗 (ranibizumab) (LUCENTIS )，或其它抑制剂，例如派加他尼(pegaptanib)、NE0VASTAT 、 AE-941、VEGF Trap和PI-88))、VEGF表达调节剂(例如INGN-Ml、口服四硫钼酸盐(oral tetrathiomolybdate),2-甲氧基雌二醇、2-甲氧基雌二醇纳米晶体分散液、贝伐西尼钠(bevasiranib sodium)、PTC-299、Veglin)、VEGF 受体抑制剂(例如 KDR 或 VEGF 受体 III(Flt4)，例如抗KDR抗体、VEGFR2抗体(例如 CDP-791)、IMC-1121B、VEGFR2 阻断剂(例如 CT-322))、VEGFR表达调节剂(例如VEGFRl表达调节剂Sirna_027)或VEGF受体下游信号传导抑制剂。在本文所述的一些方面，VEGF拮抗剂是贝伐单抗、派加他尼、兰尼单抗、索拉非尼 (sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、AE_941、VEGF Trap、帕唑帕尼(pazopanib)、凡德他尼 (vandetanib) >EftkiiM (vatalanib) ^0 / ^ (cediranib)、^:会HA月安(fenretinide) 鲨胺(squalamine)、INGN-M1、口服四硫钼酸盐、四硫钼酸盐、Panzem NCD,2-甲氧基雌二
35醇、AEE-788、AG-013958、贝伐西尼钠、AMG-706、阿西替尼(axitinib)、BIBF_1120、CDP_791、 CP-547632、PI-88、SU-14813、SU-6668、XL-647、XL-999、IMC-1121B、ABT-869、BAY-57-9352、 BAY-73-4506、BMS-582664、CEP-7055、CHIR-265、CT-322、CX-3542、E-7080、ENMD-1198、 0SI-930、PTC-299、Sirna-027、TKI-258、Veglin、XL-184 或 ZK-304709。贝伐单抗(AVASTATIN ) (rhuMAb-VEGF)(抗VEGF单克隆抗体)是针对血管内皮生长因子(VEGF)的重组人类/鼠类嵌合单克隆抗体。贝伐单抗是通过将鼠类抗VEGF单克隆抗体的VEGF结合残基工程改造到人类免疫球蛋白-I(IgGl)的框架区中来制备(ftx)d Info Avastin，2004)。只有7%的氨基酸序列来源于鼠类抗体，其余93%来自IgGl。贝伐单抗通过识别两种人类VEGF受体类型(flt-Ι和flk-Ι)的结合位点来结合和中和所有人类VEGF形式。在动物模型中，已经显示抗体可通过抑制VEGF所诱导的血管生成来稳定化已形成的肿瘤或抑制肿瘤生长。贝伐单抗的药物动力学在0. :3mg/kg或以上的剂量后是线性的(AnOn，2002)。在晚期癌症患者(n = 25)中静脉内输注0.3、1、3和10mg/kg达90分钟后，贝伐单抗的峰值血清浓度分别在 5 到 9mcg/mL、21 到 39mcg/mL、52 到 92mcg/mL 和 186 到 294mcg/mL 范围内；在重复剂量(每周一次)下观察到轻微累积，但这并不显著且药物动力学仍然保持线性。在每周一次、每2周一次或每3周一次施用1到20mg/kg后，于100天内获得贝伐单抗的稳态水平。贝伐单抗的推荐剂量是每2周一次历经30分钟静脉内输注5毫克/千克，直到疾病发展减轻为止。贝伐单抗应该在化学治疗后面进行。单一介质贝伐单抗的功效尚未确定。 贝伐单抗(其可与吉西他滨(gemcitabine)和多西他赛(docetaxel)共同施用，或在化学治疗之前或之后一周内施用)是以约lmg/kg到约15mg/kg、优选约5mg/kg静脉内施用。本公开书的方法和组合物可用于包括使用贝伐单抗的疗法的组合疗法。如本文所述，本公开的包含治疗介质(例如，细胞毒性基因)的复制逆转录病毒(RCR)可用于治疗细胞细胞增殖失调。本公开的RCR的优点包括其能够感染复制中的细胞癌细胞。当载体的转基因包括细胞毒性基因(例如，编码将肺细胞毒性介质转化为细胞毒性介质的基因)时，提供杀死癌细胞的能力。本公开书提供治疗例如癌症和赘瘤等细胞增殖失调的方法，其包含施用本公开书的RCR载体，随后用化学治疗剂或抗癌剂进行治疗。在一方面，RCR载体在施用化学治疗剂或抗癌剂之前施用于受试对象，持续允许RCR感染和复制的一段时段。然后在可减少增殖或杀死癌细胞的时段和剂量下用化学治疗剂或抗癌剂治疗受试对象。在一方面，如果化学治疗剂或抗癌剂治疗减少但不杀死癌/肿瘤(例如部分缓解或暂时缓解)，那么受试对象随后可用非毒性治疗剂(例如5-FC)治疗，所述非毒性治疗剂可在表达来自RCR的细胞毒性基因(例如胞嘧啶脱氨酶)的细胞中转化为毒性治疗剂。使用所述方法，本公开书的RXCR 载体在肿瘤细胞复制过程中传播，所述细胞然后可通过用抗癌剂或化学治疗剂处理而被杀死，且进一步杀死可使用本文所述的RCR处理过程来进行。在本公开书的另一个实施方案中，异源基因可包含靶抗原(例如癌抗原)的编码序列。在这个实施方案中，用包含编码靶抗原的异源多聚核苷酸的RCR感染包含细胞增殖失调的细胞以提供靶抗原的表达(例如癌抗原的过度表达)。然后对受试对象施用包含特异性地与靶抗原相互作用的靶向同源部分的抗癌剂。靶向同源部分可操作地连接于细胞毒性剂或自身可以是抗癌剂。因此，被包含靶向抗原编码序列的RCR感染的癌细胞增加靶标在癌细胞上的表达，从而提高细胞毒性靶向作用的效率/功效。已经显示阻断免疫系统细胞之间的相互作用可具有显著的活化性或抑制性免疫作用(Waldmann Annu Rev Med. 57 :652006)。举例来说，已经显示阻断 CTLA-4 (CD 152)与 B7. 1(^80)的相互作用(其调节T细胞活化)可引起免疫刺激，推测这是通过阻断此抑制性相互作用而实现的(Peggs等人Curr. Opin. Immunol. 18 =206,2006)。所述阻断可能用针对CTLA-4的抗体或用可溶性B7. 1来实现。全身施用这些类型的分子会具有不合需要的全身作用，其可在最小程度上导致有害副作用或甚至在一种以8激动剂的情况中导致死亡 (Suntharalingam 等人 NEJM 355 1018 2006)。Pf izer —直在开发一种该类抗 CTLA-4 阻断抗体(CP-675，206)作为抗癌剂，但是因为显著的副作用，最近已经停止开发。局部递送阻断分子(其在感染编码可释放到胞外空间中的所述分子的可复制性载体之后从肿瘤释放到局部环境中)会提供局部免疫调节并避免这些严重副作用。阻断分子是抗体、单链抗体、 天然配体的可溶形式或结合所述受体的其它肽。在另一个实施方案中，本公开书的RCR可包含含有与同源抗原或配体特异性地相互作用的结合域(例如抗体、抗体片段、抗体域或受体配体)的编码序列。包含结合域的编码序列的RCR然后可用于感染患有细胞增殖失调的受试对象的细胞，例如癌细胞或赘生性细胞。被感染细胞然后表达结合域或抗体。然后可将可操作地连接于细胞毒性剂或自身具有细胞毒性的抗原或同源物施用于受试对象。细胞毒性同源物然后选择性地杀死表达结合域的被感染细胞。或者，结合域自身可以是抗癌剂。如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个免疫球蛋白可变域或免疫球蛋白可变域序列的蛋白质。举例来说，抗体可包含重(H)链可变区(本文缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文缩写为VL)。在另一个实施例中，抗体包含两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”涵盖抗体的抗原结合片段(例如单链抗体、Fab片段、F(ab' )2、Fd片段、Fv片段和dAb片段)以及完整抗体。VH和VL区可进一步细分为被称为“互补决定区”(CDR)的高变区，其间散布有被称为“框架区”(FR)的更保守区域。框架区和CDR的范围已被精确定义(参看Kabat，E.A.等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242，和 Chothia，C.等人(1987) J. Mol. Biol. 196 :901-917)。本文使用Kabat定义。每个VH和VL典型地由三个CDR和四个I7R构成，它们从氨基端到羧基端以如下顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。“免疫球蛋白域”是指来自免疫球蛋白分子的可变域或恒定域的区域。免疫球蛋白域典型地含有2个由约7个β股形成的β折叠，和保守二硫键(参看例如A.F.Williams 和 A. N. Barclay 1988 Ann. Rev Immunol. 6 :381-405)。如 Chothia 等人(1992)J. Mol. Biol. 227 :799-817 ；Tomlinson 等人(1992) J. Mol. Biol. 227 :776-798)；和 Tomlinson 等人 (1995)EMBO J. 14(18) :4628-38中所述，可自免疫球蛋白可变域的序列推断其高变环的典型结构。如本文所用，“免疫球蛋白可变域序列，，是指可形成免疫球蛋白可变域结构的氨基酸序列。举例来说，所述序列可包含天然存在的可变域的全部或部分氨基酸序列。举例来说，序列可省略1个、2个或以上N或C端氨基酸、内部氨基酸，可包含一个或多个插入或其
37它末端氨基酸，或可包含其它改变。在一个实施方案中，包含免疫球蛋白可变域序列的多肽可与另一个免疫球蛋白可变域序列结合以形成靶结合结构(或“抗原结合位点”)，例如与 Tiel相互作用(例如结合或抑制Tiel)的结构。抗体的VH或VL链可进一步包含全部或部分重链或轻链恒定区，从而分别形成重免疫球蛋白链或轻免疫球蛋白链。在一个实施方案中，抗体是两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链通过例如二硫键互相连接。重链恒定区包含三个域CHI、CH2和CH3。轻链恒定区包含CL域。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区典型地介导抗体与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。术语 “抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其子类型)的完整免疫球蛋白。免疫球蛋白的轻链可为κ或λ型。在一个实施方案中，抗体被糖基化。抗体可对于抗体依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性发挥功能。术语“单特异性抗体”是指对于特定靶标(例如表位)显示单一结合特异性和亲和力的抗体。所述术语包括“单克隆抗体”，其是指例如从同系分离细胞群体作为单一分子物种产生的抗体。“单克隆抗体组合物”是指抗体或其片段在包含抗体的单一分子物种的组合物中的制剂。在一个实施方案中，单克隆抗体由哺乳动物细胞产生。可组合一种或一种以上单克隆抗体物种。抗体的一个或多个区域可以是人源的或有效地是人源的。举例来说，一个或多个可变区可以是人源的或有效地是人源的。举例来说，一个或多个CDR可以是人源的，例如HC CDRU HC CDR2、HC CDR3、LC CDRl、LC CDR2 和 LC CDR3。每个轻链 CDR 可以是人源的。HC ⑶R3可以是人源的。一个或多个框架区可以是人源的，例如HC或LC的FR1、FR2、FR3和 FR4。在一个实施方案中，所有框架区都是人源的，例如来源于人类体细胞，例如产生免疫球蛋白的造血细胞或非造血细胞。在一个实施方案中，人类序列是例如由生殖系核酸编码的生殖系序列。一个或多个恒定区可以是人源的或有效地是人源的。在另一个实施方案中， 至少70、75、80、85、90、92、95或98%的框架区(例如，总地来说FRl、FR2和FR3，或总地来说FR1、FR2、FR3和FR4)或整个抗体可以是人源的或有效地是人源的。举例来说，FRUFR2 和FR3总地来说可与编码重链或轻链序列的座位的人类生殖系V链段所编码人类序列具有至少 70、75、80、85、90、92、95、98 或 99%的同一性。全部或部分抗体可由免疫球蛋白基因或其链段编码。示例性人类免疫球蛋白基因包括 κ、λ、α (IgAl 和 IgA2)、y (IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε 和 μ 恒定区基因，以及多种免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链(约25Kd或214个氨基酸)是由NH2 端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH端的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白重链(约50Kd或446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和一种其它上述恒定区基因(例如Y (编码约330个氨基酸))编码。轻链是指包含轻链可变域的任何多肽。重链是指包含重链可变域的任何多肽。如本文所用的术语全长抗体的“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“片段”) 是指保留与目的靶标特异性地结合的能力的全长抗体的一个或多个片段。术语全长抗体的 “抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CHl域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，其是包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其是由VH和CHl域组成；(iv)Fv片段，其是由抗体单臂的VL和VH 域组成；(v)dAb 片段(Ward 等人，(1989) Nature 341 :544-546)，其是由 VH 域组成；和(vi) 保留功能的分离互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个域VL和VH由单独基因编码， 但VL和VH可使用重组方法通过合成连接子接合，使得其可作为单一蛋白链制备，其中VL 和VH区域配对形成被称为单链Fv(scFv)的单价分子。参看例如Bird等人(1988) Science 242 :423-426 ；和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883。抗体片段可使用包括所属领域技术人员已知的常规技术的任何适当技术来获得。 术语“单特异性抗体”是指对于特定靶标(例如表位)显示单一结合特异性和亲和力的抗体。所述术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，其在本文中是指单一分子组合物的抗体或其片段的制剂。如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别 (例如 IgM 或 IgGl)。本公开书提供一种治疗患有细胞增殖失调的受试对象的方法。受试对象可以是任何哺乳动物，且优选是人。用本公开书的重组可复制逆转录病毒载体接触受试对象。接触可在体内或体外进行。施用本公开书的逆转录病毒载体的方法在所属领域中已知，且包括例如全身施用、局部施用、腹膜内施用、肌肉内施用、颅内施用、脑脊髓施用以及在肿瘤或细胞增殖失调部位直接施用。其它施用途径也在所属领域中已知。因此，本公开书包括可用于治疗细胞增殖失调的各种医药组合物。本公开书的医药组合物是通过使用载剂、赋形剂和添加剂或助剂，将根据本公开书的含有可用于治疗或调节细胞增殖失调的异源多聚核苷酸序列的逆转录病毒载体制成适合于施用于受试对象的形式来制备。经常使用的载剂或助剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石粉、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素和其衍生物、动物和植物油、聚乙二醇和溶剂，例如无菌水、醇类、甘油和多元醇。静脉内运载体包括流体和营养补充物。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其它医药学上可接受的载剂包括水溶液、无毒赋形剂(包括盐)、防腐剂、缓冲剂等，如例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, 第 15 版 Easton :Mack Publishing Co. ,1405-1412, 1461-1487(1975)和 The National Formulary XIV.,第 14 版 Washington :American Pharmaceutical Association(1975)中所述，其内容以引用的方式并入本文中。医药组合物的各种组分的PH和确切浓度根据所属领域的常规技术来调节。参看Goodman和Gilman 白勺 The Pharmacological Basis for Therapeutics ( . 7 片反)。举例来说且不构成限制，可用于治疗细胞增殖失调的逆转录病毒载体包含双嗜性 ENV蛋白、GAG和POL蛋白、U3区逆转录病毒基因组中的启动子序列，和逆转录病毒基因组在靶细胞中复制、包装和整合所必需的所有顺式作用序列。以下实施例打算说明但不限制本公开书。虽然所述实施例代表可能被使用的实施例，但仍可替代性地利用所属领域技术人员已知的其它程序。
实施例 实施例1.将pACE-GFPemd的载体骨架修饰成pAC3_GFPemd并插入胞嘧啶脱氨酶基因序列以代替GFP.用图3E所示的3种方式修饰pACE-GFPemd质粒的先前骨架 (US6899871，Wang等人Hum Gene Ther 14:117 2003)。所述修饰是通过PCR介导的寡聚
39核苷酸引导的诱变来进行(Logg等人，J. Mol Biol 369 :1214，2007 ；也参看“Molecular Biology and Biotechnology，，J Μ. Walker, R. Rapley 编，Royal Society of Chemistry, London UK，2000)。进行以下修饰。1)双嗜性env基因3’端的pl5区的核酸序列起初来源于亲嗜性包膜-用来自4070A双嗜性包膜的对应序列取代此序列；所编码的包膜氨基酸在两个构建体中相同。2、修饰IRES序列3’端以允许插入有PstIl位点的选定转基因能更容易地插入，并去除IRES转基因位点任一端的微小不完全重复序列。3)去除3’ LTR下游的残余病毒序列。所得质粒是pACE-emdGFP (aka pACE_GFP、pACE-eGFP和T5. 0006)，其用作编码胞嘧啶脱氨酶和其变异体的载体的基础。最初使用两种插入编码盒的方法。第一种方法产生序列5’ ΤΤΑΤΑΑΤ3’，且第二种方法紧邻ATG起始密码子上游产生5’ ΤΤΑΤΑΑ3’。 第二种方法比较简单，因为其涉及载体中的简单I3StIl和Notl酶切割序列和合成胞嘧啶脱氨酶基因，以及随后的再连接。利用这两种方法用⑶opt (⑶1)和⑶opt+3pt (⑶幻(参看图 2)编码序列制备具有胞嘧啶脱氨酶插入物的载体，且如实施例3中所述通过瞬时转染细胞来制备感染性病毒制剂。然后在培养物中以0. 1的MOI感染U87细胞，且细胞生长直到100%被感染为止。如实施例6中所述，分析100%被感染细胞的细胞提取物的胞嘧啶脱氨酶活性，并发现所述酶的比活性对于具有任一种上游序列但在其它方面相同的构建体是相等的。因此，在图2的表中，pACE-eGFP(T5. 0006)和pACE_yCD(T5. 0007)具有第一个上游序列，而进一步测试的所有其它构建体具有第二个上游序列。随后用简单PStIl和Not 1 切割常规构建具有不同基因插入物的载体。关于初始转染的可复制逆转录病毒的病毒构建体的示意图，请参看以下图3A。CMV 是人类CMV立即早期启动子，U3、R和TO是病毒长末端重复序列(LTR)的对应区域。(iag、 pol和env是病毒蛋白编码区。图:3B和3D显示质粒结构和本公开书的序列。本公开书的载体与Tai等人，Mol. Ther. 12 =842,2005的载体相比提供许多差别。 Tai等人的载体已被改变以消除3’ LTR下游的MLV序列的约70bp。包膜中的ClaI位点下游的DNA序列被变为双嗜性包膜序列。这种改变不会改变包膜的氨基酸序列。此外，已经消除了 IRES-⑶盒任一侧的小重复序列以避免因同源重组所致的不稳定。这些改变还出乎意料地使载体在宿主细胞中复制和传代期间的稳定性提高(图5)。已经认识到，在逆转录和第一次整合到被处理细胞中之后，DNA前病毒和任何后续子代逆转录病毒在每一端具有来自MLV的常规LTR结构。已经显示这种构形在多个感染周期后是稳定的(参看以下图5)。实施例2对野生型酵母胞嘧啶脱氨酶基因的遗传增强已经进行了两组改变(1)3个位置突变，其改变3个氨基酸(A23L、I140L和 V108I)以增加酵母胞嘧啶脱氨酶蛋白的热稳定性；和( 其它基因序列修饰，用于增强人类密码子使用序列以提高在人类细胞中的蛋白翻译效率而不会对氨基酸序列造成其它改变。CD的序列设计包括CD优化型、CD-UPRT (+/_连接子)和CD-OPRTase (+/-连接子)。 最终胞嘧啶脱氨酶编码序列可在5’端包含PSIl位点(全长)且在3’端包含Notl位点和用于PSIl/Notl盒策略的poly A尾巴。盒是从商业供应商(BioBasic Inc. , Markham, Ontario, Canada)定购并由其提供。包含酵母胞嘧啶脱氨酶的以下序列用于克隆、优化和突变(带框核酸包含限制位
40点I^sil和Notl，用于随后克隆方法中)
权利要求
1.一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白；逆转录病毒包膜；逆转录病毒多聚核苷酸，其包含在所述逆转录病毒多聚核苷酸序列的3’端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多聚核苷酸的5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达；包含可操作地连接于异源多聚核苷酸的内部核糖体进入位点(IRES)的盒，其中所述盒位于所述3’ LTR的5’和编码所述逆转录病毒包膜的所述env核酸域的3’ ；和在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列，其中与包含SEQ ID N0:21的载体(pACE)相比，所述RCR在6次传代后保持较高的复制能力。
2.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述逆转录病毒多聚核苷酸序列来源于鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。
3.根据权利要求1或2所述的逆转录病毒，其中所述MLV是双嗜性MLV。
4.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述逆转录病毒是Y逆转录病毒。
5.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述靶细胞是具有细胞增殖失调的细胞。
6.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述靶细胞是赘生性细胞。
7.根据权利要求5所述的逆转录病毒，其中所述细胞增殖失调选自由肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和卵巢癌、类风湿性关节炎或其它自身免疫疾病组成的组。
8.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述启动子序列与生长调节基因关联。
9.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述启动子序列包括组织特异性启动子序列。
10.根据权利要求9所述的逆转录病毒，其中所述组织特异性启动子序列包含至少一个雄激素反应元件(ARE)。
11.根据权利要求10所述的逆转录病毒，其中所述雄激素反应元件来源于前列腺碱性蛋白(probasin)启动子。
12.根据权利要求9所述的逆转录病毒，其中所述组织特异性启动子序列包括前列腺碱性蛋白启动子。
13.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述启动子包括具有如SEQID N0:19、20 或22的核苷酸1到约核苷酸582所述的序列的CMV启动子，且可包含对一个或多个核酸碱基的修饰，所述启动子能引导和起始转录。
14.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述启动子包括如SEQID N0:19、20或 22的核苷酸1到约核苷酸582所述的序列。
15.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述启动子包括CMV-R-U5域多聚核苷酸。
16.根据权利要求15所述的逆转录病毒，其中所述CMV-R-U5域包括与MLVR-U5区域连接的来自人类巨细胞病毒的立即早期启动子。
17.根据权利要求16所述的逆转录病毒，其中所述CMV-R-U5域多聚核苷酸包括如SEQ ID NO :19、20或22的约核苷酸1到约核苷酸1202所述的序列，或与如SEQ ID NO :19、20 或22所述的序列具有至少95%同一性的序列，其中所述多聚核苷酸促进与其可操作地连接的核酸分子的转录。
18.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述gag多聚核苷酸来源于Y逆转录病ο
19.根据权利要求18所述的逆转录病毒，其中所述gag核酸域包括SEQID N0:19或22 的约核苷酸编号1203到约核苷酸2819的序列，或与其具有至少95 %、98 %、99 %或99. 8 % 同一性的序列。
20.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述多聚核苷酸的pol域来源于Y逆转录病毒。
21.根据权利要求20所述的逆转录病毒，其中所述pol域包括SEQID NO 19或22的约核苷酸编号2820到约核苷酸6358的序列，或与其具有至少95 %、98 %、99 %或99. 9 %同一性的序列。
22.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述env域包括SEQID N0:19或22的约核苷酸编号6359到约核苷酸8323的序列，或与其具有至少95 %、98 %、99 %或99. 8 %同一性的序列。
23.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述IRES来源于脑心肌炎病毒。
24.根据权利要求23所述的逆转录病毒，其中所述IRES包括SEQID N0:19或22的约核苷酸编号8327到约核苷酸8876的序列，或与其具有至少95 %、98 %或99 %同一性的序列。
25.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸包括具有如SEQID NO :3、 5、11、13、15或17所述的序列的多聚核苷酸。
26.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸编码包括如SEQID N0:4所述的序列的多肽。
27.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸是经人类密码子优化的且编码如SEQ ID NO 4所述的多肽。
28.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸包括如SEQID NO: 19或22 的约核苷酸编号8877到约9353所述的序列。
29.根据权利要求28所述的逆转录病毒，其中所述3’LTR来源于γ逆转录病毒。
30.根据权利要求29所述的逆转录病毒，其中所述3’LTR包括U3-R-TO域。
31.根据权利要求29所述的逆转录病毒，其中所述3，LTR包括如SEQID Ν0:19或22 的约核苷酸9405到约9998所述的序列，或与其具有至少95%、98%或99. 5%同一性的序列。
32.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述逆转录病毒多聚核苷酸包括如SEQ ID NO :19、20或22所述的序列。
33.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸序列编码生物反应调节剂。
34.根据权利要求33所述的逆转录病毒，其中所述生物反应调节剂包括免疫增强细胞因子。
35.根据权利要求34所述的逆转录病毒，其中所述免疫增强细胞因子选自由白细胞介素1到15、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)组成的组。
36.根据权利要求34所述的逆转录病毒，其中所述免疫增强细胞因子是干扰素。
37.根据权利要求36所述的逆转录病毒，其中所述干扰素是γ干扰素。
38.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸编码将非毒性前药转化为毒性药物的多肽。
39.根据权利要求38所述的逆转录病毒，其中将非毒性前药转化为毒性药物的所述多肽是胸苷激酶、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)或胞嘧啶脱氨酶。
40.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸序列编码靶向部分。
41.根据权利要求40所述的逆转录病毒，其中所述靶向部分包括癌抗原。
42.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸序列编码结合域。
43.根据权利要求42所述的逆转录病毒，其中所述结合域包括受体域、抗体或抗体片段。
44.根据权利要求1所述的逆转录病毒，其中所述异源核酸序列包括抑制性多聚核苷酸。
45.根据权利要求44所述的逆转录病毒，其中所述抑制性多聚核苷酸包括RNAi或 siRNA序列。
46.一种分离的多聚核苷酸，其从5’到3’包含人类巨细胞病毒的立即早期启动子与MLV R-U5区的CMV-R-U5融合体； PBS，即逆转录酶的引物结合位点； 5’剪接位点； Ψ包装信号；MLV群特异性抗原的gag编码序列； MLV聚合酶多聚蛋白的pol编码序列； 3’剪接位点；MLV品系4070A的包膜蛋白的4070A env编码序列； 脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)；其中所述4070A env编码序列和所述IRES包括SEQ ID NO :19或22的约核苷酸编号 6359到约核苷酸8876的序列，或与其具有至少95%、98%或99%同一性的序列； 异源核酸序列； 聚嘌呤束；和U3-R-U5 MLV长末端重复。
47.根据权利要求46所述的多聚核苷酸，其中所述逆转录病毒多聚核苷酸包括如SEQ ID NO :19、20或22所述的序列。
48.根据权利要求46所述的多聚核苷酸，其中所述逆转录病毒多聚核苷酸序列来源于鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫白血病病毒(FeLV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。
49.根据权利要求48所述的多聚核苷酸，其中所述MoMLV是双嗜性MoMLV。
50.一种治疗患有细胞增殖失调的受试对象的方法，其包括使所述受试对象与根据权利要求1或46所述的多聚核苷酸在允许所述多聚核苷酸表达的条件下接触，和使所述受试对象与5-氟胞嘧啶接触。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述多聚核苷酸整合到所述受试对象的细胞中。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述多聚核苷酸通过逆转录病毒载体递送。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含如SEQID NO :19、20 或22所述的序列。
54.根据权利要求50所述的方法，其中所述细胞增殖失调是多形性胶质母细胞瘤。
55.根据权利要求50所述的方法，其中所述细胞增殖失调选自由肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和卵巢癌组成的组。
56.一种治疗受试对象的细胞增殖失调的方法，其包括使所述受试对象与根据权利要求1所述的逆转录病毒接触，其中所述异源核酸序列编码抑制赘生性细胞增殖的治疗性蛋白。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗性蛋白包括将非细胞毒性药物转化为细胞毒性药物的多肽。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述多肽包括如SEQID NO :4、12、14、16或18 所述的序列。
60.根据权利要求57所述的方法，其中所述非细胞毒性药物是5-氟胞嘧啶。
61.根据权利要求56所述的方法，其中所述逆转录病毒多聚核苷酸包括如SEQID NO 19、20或22所述的序列。
62.一种治疗细胞增殖失调的方法，其包括在允许包含根据权利要求46所述的多聚核苷酸的逆转录病毒感染具有细胞增殖失调的细胞的条件下，对患有所述失调的受试对象施用所述逆转录病毒，和使所述受试对象与抗癌剂或化学治疗剂接触。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗癌剂选自由贝伐单抗(bevacizumab)、 派力口他尼(pegaptanib)、兰尼单抗(ranibizumab)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼 (sunitinib)、AE-941、VEGF Trap、中白唑中白尼(pazopanib)、凡德他尼(vandetanib)、 瓦他拉尼(vatalanib)、西地尼布(cediranib)、芬维A胺(fenretinide)、角鲨胺 (squalamine)、INGN-241、口服四硫钼酸盐(oral tetrathiomolybdate)、四硫钼酸 4k (tetrathiomolybdate) > Panzem NCD>2-甲 fi ■ 二酉享(2-methoxyestradiol) > AEE-788、AG-013958、贝伐西尼钠(bevasiranib sodium)、AMG-706、阿西替尼(axitinib)、 BIBF-1120、CDP-791、CP-547632、PI-88、SU-14813、SU-6668、XL-647、XL-999、IMC-1121B、 ABT-869、BAY-57-9352、BAY-73-4506、BMS-582664、CEP-7055、CHIR-265、CT-322、CX-3542、 E-7080、ENMD-1198、0SI-930、PTC-299、Sirna-027、TKI-258、Veglin、XL-184 或 ZK-304709 组成的组。
64.一种治疗受试对象的细胞增殖失调的方法，其包括施用根据权利要求40-43中任一权利要求所述的逆转录病毒，和使所述受试对象与包含细胞毒性剂的同源物接触。
65.一种分离的多聚核苷酸，其包含编码包含HER2的胞外(E⑶)和跨膜(TM)域的多肽的序列，所述序列与SEQ ID NO 4 的经优化胞嘧啶脱氨酶的编码序列连接。
66.一种分离的多聚核苷酸，其编码包含HER2的胞外(ECDIV)和跨膜(TM)域的赫赛汀(Here印tin)结合域IV的多肽，所述多肽与包括SEQ ID NO :4的经优化胞嘧啶脱氨酶连接。
67.一种分离的多聚核苷酸，其编码包含HER2的信号肽(S)的多肽，所述信号肽与 HER2的胞外(ECDIV)和跨膜(TM)域的赫赛汀结合域IV可操作地融合，所述多肽与包括SEQ ID NO 4的经优化胞嘧啶脱氨酶连接。
68.一种重组可复制逆转录病毒，其包含与IRES和所述ENV序列的3’可操作地连接的根据权利要求65、66或67所述的多聚核苷酸。
69.根据权利要求1所述的重组逆转录病毒，其中所述异源多肽是HER2或截短 HER2(HER2 ECDTM)或 HER2 SECDIVTM。
70.根据权利要求1所述的重组逆转录病毒，其以每克脑重量10_3到10_7TU的剂量施用。
71.根据权利要求50到54中任一权利要求所述的方法，其中所述逆转录病毒以每克脑重量约10_3到IO-7TU施用。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述逆转录病毒以每克脑重量约10_4到10_6TU 施用。
73.一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含 逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白； 逆转录病毒包膜；逆转录病毒多聚核苷酸，其包含在所述逆转录病毒多聚核苷酸序列的3’端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多聚核苷酸的5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达；包含miRNA或siRNA序列的初级前体miRNA (pri-miRNA)的盒； 在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。
74.一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含 逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白； 逆转录病毒包膜；逆转录病毒多聚核苷酸，其包含在所述逆转录病毒多聚核苷酸序列的3’端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多聚核苷酸的5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达； 包含miRNA或siRNA序列的前体miRNA (pre_miRNA)的盒； 在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。
75.一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含 逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白；逆转录病毒包膜；逆转录病毒多聚核苷酸，其包含在所述逆转录病毒多聚核苷酸序列的3’端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多聚核苷酸的5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达； 包含polIII启动子和siRNA或shRNA的盒， 在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列， 其中所述载体至少90%稳定地在细胞中至少6次传代。
76.根据权利要求73、74或75中任一权利要求所述的载体，其中miR128-1和miR 128-2的从属权利要求。
77.根据权利要求73、74或75中任一权利要求所述的载体，其中所述载体进一步包含与异源多聚核苷酸可操作地连接的IRES盒。
78.根据权利要求77所述的载体，其中所述IRES盒位于所述env基因的3’紧邻位置。
79.一种重组可复制逆转录病毒(RCR)，其包含 逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白； 逆转录病毒包膜；逆转录病毒多聚核苷酸，其包含在所述逆转录病毒多聚核苷酸序列的3’端的长末端重复(LTR)序列、在所述逆转录病毒多聚核苷酸的5’端的启动子序列、gag核酸域、pol核酸域和env核酸域，所述启动子适合在哺乳动物细胞中表达； 包含天然存在的miRNA的靶序列的盒；和在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。
全文摘要
本公开书提供经修饰的胞嘧啶脱氨酶(CD)。本公开书进一步涉及表达或包含所述经修饰CD的细胞和载体，和使用所述经修饰CD治疗疾病和失调的方法。
文档编号C12N15/867GK102227503SQ200980147515
公开日2011年10月26日 申请日期2009年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者克里斯托弗·R·洛格, 哈利·E·格鲁贝尔, 奥马尔·佩雷斯, 道格拉斯·乔利 申请人:托卡根公司