用于基因工程的载体、缓冲液及其使用方法

专利名称：用于基因工程的载体、缓冲液及其使用方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，更具体地，涉及用于基因工程的ー种新型载体、ー种新型缓冲液及它们的使用方法。
背景技术：
基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术,是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计，在体外构建重组DNA分子，然后导入受体细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品等。此外，基因工程还为研究基因和基因组结构与功能提供了最基本的手段，已成为 生命科学中不可缺少的基本研究方法，在许多方面都有重要应用，包括但不限于基因组组织结构研究、基因表达研究、重组蛋白生产、转基因生物、基因治疗、药物筛选、动植物的抗逆性等。在经典的基因工程实验中，通常包括以下主要步骤I.选择受体细胞和载体尽管有许多种受体细胞和载体在使用，但绝大多数实验是从E. coli实验菌株和质粒克隆载体起步的。由于其技术完备、通用性强、获取容易，E. coli和质粒载体早已成为本领域的首选。但是，如果要克隆的DNA特别大，例如数十万碱基对或更大，在需要使用细菌人工染色体或酵母菌人工染色体(hizuya H, Birren B, Kim UJ等人，Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 89(18) :8794-7)。2.准备载体和目的片段DNA在经典的基因工程研究中，为了把目的片段克隆到载体上，载体DNA和目的DNA应当用适当的限制性内切酶(下称内切酶)酶切从而产生匹配的末端以便把目的DNA连接到载体上。内切酶的选择要考虑载体和目的片段能产生互相匹配的末端。在经典基因工程实验中，这ー过程是用相同的内切酶或内切酶组合分别切割载体DNA和目的片段实现的。如果用平端内切酶、单个粘性末端酶或同尾酶处理载体，还需要用碱性磷酸酶对载体进行处理，以防止载体自连。无论是用粘性末端酶还是用平端酶切酶，处理过的载体都要经过纯化以去除对后续的连接等过程有影响的成分。两个非同尾酶(例如BamHI和EcoRI)切割DNA分子产生的片段末端不互补，因此不能自连。在经典基因工程操作中，带有两个不能自连的非同尾末端的载体是最普遍使用的。用内切酶切割上述来源的DNA使其产生可与前述准备好的带粘性末端或平末端的载体相匹配的末端。目的片段上没有与载体相匹配的位点时，可以通过添加接头(Brown, Terry(2006). Gene cloning and DNA analys is: an introduction ( 因克隆和DNA分析介绍)。剑桥，马萨诸塞州；布莱克韦尔出版社ISBN 1-4051-1121-6和Russell, David ff. ;Sambrook, Joseph(2001). Molecular cloning:a laboratory manual(分子克隆实验室手册)。冷泉港，纽约；冷泉港实验室)或通过PCR使其两端带上适当的酶切位点。3.制备重组DNA分子
用上述预处理过的载体和目的片段制备重组DNA分子是通过多个简单的分子生物学步骤完成的。其中，最主要的是连接反应。即把上述准备的合格载体和目的DNA片段按一定比例混合，加入DNA连接酶和相应的缓冲液，保温一定时间后带有匹配末端的两个DNA片段就可以连接成重组DNA分子。在基因工程研究中，DNA连接酶是ー种常用工具酶，它可以把两个具有匹配末端的DNA分子连接成重组DNA分子。基因工程实验中常用T4DNA连接酶。4.把重组DNA分子导入受体细胞把重组DNA分子导入受体细胞的方法有多种，其名称因所用实验过程而异。这些方法包括但不限于本领域技术人员熟知的转化、转导、转染和电击等(Brown, Terry (2006).Gene cloning and DNA analysis:an introduction (基因克隆和 DNA 分析介绍)。剑桥，马萨诸塞州；布莱克韦尔出版社ISBN 1-4051-1121-6和Russell, Davidff. ; Sambrook, Joseph (2001). Molecular cloning: a laboratory manual (分子克隆实验室手册)。冷泉港，纽约；冷泉港实验室)。5.筛选带有载体序列的细胞无论用什么方法导入，受体细胞中只有一小部分摄取了 DNA。为了从转化或转染的受体细胞群体中筛选出频率很低的摄取了 DNA的细胞(称为转化子)，科学家巧妙地运用抗抗生素基因等方法使那些没有摄取DNA的细胞被杀死，只有可自我复制并带有选择标记基因的载体的细胞才能存活下来(Brown, Terry (2006) · Gene cloning and DNA analysis: anintroduction (基因克隆和DNA分析介绍)。剑桥，马萨诸塞州；布莱克韦尔出版社ISBN1-4051-1121-6 和 Russell, David ff. ; Sambrook,Joseph(2001). Molecular cloning:alaboratory manual (分子克隆实验室手册0。冷泉港，纽约；冷泉港实验室)。无论受体细胞是细菌、动植物细胞还是其他受体细胞,都是通过抗性基因完成筛选的。在细菌中通常使用抗抗生素基因，如抗氨苄青霉素基因bla等。6.筛选带有目的片段和生物学特性的克隆流行的载体带有ー个来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(IacZ)的启动子和前146个氨基酸的编码区。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS)。这种载体与支持α -互补的受体细胞(带有可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列)构成十分有效的筛选体系。受体细胞和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时能产生可催化X-Gal产生呈色反应使菌落成为蓝色菌斑。如果在多克隆位点插入了目的片段，则LacZ的功能被破坏，不能发生呈色反应，菌落为白色。借此，可以很容易地识别插入了目的片段的克隆。在基因工程研究中，可以插入外源DNA并能在受体细胞中复制的DNA结构称之为载体。通常，载体是质粒、噬菌体或病毒，也可以是用来自于质粒、噬菌体或病毒的某些元件人工重建的遗传单元。一个载体至少是ー个能够自我复制的最小遗传单位，因此它必须具有至少ー个复制起始序列。载体可分为克隆载体和表达载体两大类。
克隆载体是基因克隆的关键工具。一些商业公司开发出多种结构简单、可以方便地克隆包括但不限于结构基因和其他功能DNA片段的克隆载体，为基因工程研究提供了广泛使用的工具。这些载体包括但不限于pUC系列、pBlueScript系列等。表达载体是基因工程的另ー关键工具，可用于使目的基因表达为蛋白。与克隆载体一祥，它带有一个在大肠杆菌中有效的复制起始序列和一个在大肠杆菌中有效的抗抗生素基因，使其在大肠杆菌中繁殖并可用其制备质粒DNA。与克隆载体相比，表达载体还有ー个由启动子和一个终止序列组成的空载(不带有结构基因)表达框。在启动子和終止序列之间有ー个可用于插入目的基因的多克隆位点，用于插入各种来源的目的片段。为了使表达载体能在受体细胞(如酵母菌、动物细胞、植物细胞等)中稳定传代，还带有在受体细胞中有效的复制起始序列(如在哺乳动物细胞中用SV40的复制起始序列)和抗抗生素基因等抗性基因(如Neo、Hygromycin等)。目前已经有适用于包括但不限于动物细胞、植物细胞、细菌或真菌细胞表达基因产物用的表达载体，例如pET系列、pcDNA系列等商业供应的表达载体。
正如本领域技术人员所熟知的，无论是克隆载体还是表达载体，都必须有至少ー个多克隆位点以便插入目的片段。多克隆位点是载体的基本结构，它决定了克隆目的片段所需要的实验操作。广泛使用的载体已经很多。在提供了有效研究工具的同吋，这些载体的多克隆位点的结构决定了用它们克隆目的片段时无法避免在克隆DNA片段前用适当的内切酶等エ具对载体进行预处理。因此，在经典的基因工程实验中，在连接前需要对载体和目的片段进行酶切、酶切后纯化、载体的自连率检定等繁琐的程序。这是ー个冗长且不容易控制的程序，常常导致实验失败或不够理想。这是现有克隆方法中需要改进的重要方面。同吋，由于在对载体DNA进行酶切和连接时总有ー些分子不能被切割和产生自连产物(统称为自连产物)，转化后总会长出一些带有原始载体的克隆。这种克隆也同样出现在带有插入片段的连接产物中。如果自连产生的克隆比例过高，则会给实验带来严重干扰。因此，每ー批酶切处理的载体都要经过自连率检测以评价预处理载体的质量。如果自连率过高，则不能用于后续实验。在实际工作中，自连率过高是导致准备载体失败的常发因素，有可能造成连续失败。这种情况也是现有载体需要改进的重要方面。

发明内容
本发明的ー个目的在于根据某些内切酶或内切酶组合产生的末端可出现“识别位点沉默”这ー现象提供ー种新型的载体，以使得基因工程中目的DNA片段与载体连接的过程更加简单、有效和可靠。本发明的另ー个目的在于提供ー种支持多种酶单独或共同工作的缓冲液。本发明的另ー个目的在于提供ー种将目的DNA片段与载体连接的方法。为达此目的，本发明采用以下技术方案在第一个方面，本发明提供了ー种载体，其特征在于所述载体包含ー个或多个多克隆位点，所述多克隆位点经限制性内切酶酶切后与其他DNA片段连接产生不被所述限制性内切酶识别的重组分子。在本发明提供的载体中，所述限制性内切酶可以是同尾酶、酶切位点在识别序列之外的限制性内切酶或其组合。在本发明提供的载体中，所述限制性内切酶可包括但不限XbaI、StyI, NcoI,NheI、Spel、BamHI、Bglll、Bell、Sail、HincII、Xhol、Mlul、Paul、EcoRI、Muni、PstI、NsiI、SmaI> SmiI> PmlI> StuI> EcoRV、PvuII> Alw26I、BseGI> BseMI、BseNI、Eco31I、Eaml 1041 >MnlI、BseXI、MboII、SchI、BoxI、BsaBI、BseJI、BseLI、DraIII、Eco91I、SfiI、Van91I、PpiI、AjuI、AlfI、AloI、BdaI、BplI、Hin4I、TscaAI 和 TstI0在本发明提供的载体中，所述载体的多克隆位点序列可包含SEQ ID NO: I或5。在第二个方面，本发明提供了第一方面所述的载体在基因工程中的应用。在本发明提供的所述载体的应用中，所述基因工程可以是定向克隆或非定向克 隆。在第三个方面，本发明提供了ー种支持多种工具酶单独或共同工作的缓冲液，其特征在于包含 50mM Tris-こ酸，IOOmM こ酸钾，15mM こ酸镁、ImM DTT,O. 1%BSA、0. 5mM ATP,pH为7. 5-8. 3，优选地，为7. 7,7. 9,8. 0,8. 1,8. 3，更优选地为8. 3，所述工具酶包括但不限于T4DNA连接酶、限制性内切酶、多聚核苷酸激酶和Klenow片段。在第四个方面，本发明提供了第三方面所述的缓冲液在基因工程中的应用。在第五个方面，本发明提供了ー种将目的DNA片段与载体连接的方法，其特征在于使用第一方面所述的载体在同一个步骤中完成所述目的DNA片段与所述载体的酶切和连接。本发明提供的方法，其特征在于可使用第三方面所述的缓冲液。本文中，术语“目的DNA片段”，简称“目的片段”是指所有需要研究的DNA分子。目的片段可以来自基因组DNA，也可以来自cDNA、人工合成的DNA，而当前最多的是PCR产物(包括RT-PCR产物)。术语“载体”是指在基因工程研究中，可以插入外源DNA井能在受体细胞中复制的DNA结构。术语“多克隆位点”是指DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。术语“限制性内切酶”，简称“内切酶”，是ー类在DNA分子上有特定的识别位点和切点的DNA水解酶。至2005年初，共发现3681内切酶，有221种特异性。内切酶是基因エ程的关键工具酶之一。术语“同尾酶”是指内切酶中存在一些识别序列不同但可以产生相同序列粘性末端的内切酶。有些内切酶产生平末端。由于所有平末端都可以互相连接，与上述的同尾酶关系相似，本发明中把平端内切酶也归为同尾酶术语“切点沉默”是指把两种同尾酶切割的DNA片段连接后，原来的识别序列将不存在，因而不能被原来的内切酶识别和切割。术语“沉默切点”是指切点沉默所产生的序列 术语“沉默前序列”是指能够经内切酶酶切和连接产生沉默切点的序列。术语“基因工程”是指将不同来源的基因按预先设计，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。


图I.本发明中设计的多克隆位点(A)及其序列。图2. pUC57MC多克隆位点的测序結果。标准序列见SEQ ID NO: I。图3.Buffer X支持多种内切酶的实验。图A是本发明的19种主要内切酶对PUC57MC的酶切結果，图B是图A中19种匹 配位点内切酶对带有单个匹配位点的pUC57M的酶切結果。图4.以pUC57MC为载体、用双酶双粘性末端和单酶双粘性末端获得的重组DNA转化后的篮/白斑情況。A.双酶双粘性末端，B.单酶双粘性末端图5.所构建的pCi-Neo/11-GFPq转染HEK293细胞后发射荧光的情況。
具体实施例方式实施例I.新型载体多克隆位点的设计一、同尾酶的利用在设计新的多克隆位点时，主要考虑了两个原则(1)尽量多地置入包括平端内切酶内的同尾酶使载体有更多的同尾酶可用，从而满足载体对多克隆位点的需求。(2)优先选用那些价格低廉的限制酶以降低使用成本。根据上述两个原则选定以下内切酶用于多克隆位点的设计(*为平端内切酶):表I选定的用于切割载体的内切酶及与之匹配的内切酶
小:耍位/.': XbaIBamHI KpnI HindIII MluI Apa EcoRI PstII
匹配位点 Styl/Ncol Bglll/Bcll N/A N/A Paul N/A MunI NsiI/Nhel/Spel
主要位点 SacI/EcoICRI Sall/HincII SmaI* SmiI* PmlI* StuI FcoRV PvuII
**琢氺*:
匹配位点N/A//XhoI//根据上面的选定，以主要位点组成载体的多克隆位点，匹配位点用于目的片段，从而可方便地获得匹配的粘性末端或其他结构的末端。用几个平端和其他常用内切酶位点散布于主要位点中，可在难以找到其他匹配位点时使用。为方便对克隆片段进行酶切鉴定，在多克隆位点的近末端分别置入两个PstI位点，以便用单酶对插入片段的大小进行鉴定。此外，还在该多克隆位点中插入了方向相反的两个BsaI位点，以便用单酶切获得不同的粘性末端。如果在目的片段的两段置入与之匹配的位点，即可只用ー种内切酶与连接酶一起完成定向克隆。把上述选定的内切酶的编码序列按一定顺序排列后，即可得到多克隆位点的DNA序列(图 I 和 SEQ ID NO :1)。二、特殊内切酶的利用有一些特殊内切酶，其切割位点在识别位点之外。这类酶有两类，一类是正负链各有一个切点且在识别序列的同一侧，例如Alw26I，一类是在识别序列两侧的正负链上都有一个切点，例如PpiI。以Alw26I为例说明其应用。该酶切点在载体上的序列应为
正向序列为GTCTCNI NNNN 反向序列为I NNNN-NGAGACGAGGAN-NNNN 丨NNNN 丨 NCTCTG如果载体上同时存在如下所示的两个背靠背的反向Alw26I位点，则切割时可产生如图所示的粘性末端(为叙述方便，以Al表示两个位点中的某些指定为载体序列中的特定碱基，大写字母与相应的小写字母代表互补碱基。下同。)-----I abcd-ngagac gtctcn I EFGH------------ABCD f nctctgcagagn-efgh f-----载体的上述位点被切割后，小写字母部分被从载体上移掉，两端分别留下3’ -端粘性末端ABCD和EFGH。在目的片段的两侧也各放置一个Alw26的切点，只是方向与载体上的相反。其末端的四个N指定为目的片段末端的四个碱基AB⑶/abcd或EFGH/efgh。GTCTCN I abcd—XXXXXXXXXXXXXXXXXXX I EFGH-NGAGACGAGGAN-ABCD 丨 xxxxxxxxxxxxxxxxxxx -efgh 丨 NCTCTG用Alw26I切割后，大写部分被移除，两侧各留下与载体上的粘性末端互补的3’ -粘性末端。这种载体和目的片段的粘性末端是互补的，可以方便地进行连接。应当注意的是，(I)这里留下的粘性末端与识别位点倒转重复的内切酶留下的粘性末端不同，它不是倒转重复的，而且(2)酶切留下的两侧粘性末端序列可以不同，(3)如同成对使用的同尾酶位点一样，因切掉的部分中该酶的识别位点已经丧失，一旦相应片段被连接到该位点，则不可再被Alw26I切割，因此单独使用即可实现定向克隆。被切掉的小片段有可能按照原来方向重新被连接到原来位置，但是可重新被切割；被切掉的小片段不可能以相反的方向被连接到另外一端。因此，这种方法也可以不对载体预处理单管完成酶切和连接。根据此类酶的特点，在本发明的多克隆位点中置入了两个方向相反的Alw26I位点。有几种切点特殊的内切酶在克隆中有重要应用价值，其名称、识别位点和切割位置列于下表。其中，Alw26I、BsaI和SchI最为适用。表2在识别位点外单侧正负链均有切点的内切酶、识别序列及切割点
权利要求
1.一种载体，其特征在于所述载体包含一个或多个多克隆位点，所述多克隆位点经限制性内切酶酶切后与其他DNA片段连接产生不被所述限制性内切酶识别的重组分子。
2.根据权利要求I所述的载体，其中所述限制性内切酶是同尾酶、酶切位点在识别序列之外的限制性内切酶或其组合。
3.根据权利要求2所述的载体，其中所述限制性内切酶包括但不限于XbaI、StyI,NcoI, NheI, SpeI, BamHI, BglII, Bell、Sail、HincII, XhoI, Mlul、Paul、EcoRI, Muni、PstI、Nsil、SmaI, Smil、Pmll、StuI、EcoRV、PvuII、Alw26I、BseGI、BseMI、BseNI、Eco31I、Eaml 1041, MnlI, BseXI, MboII, SchI, BoxI, BsaBI, BseJI、BseLI、DraIII, Eco91I、Sfil、Van91I、PpiI、AjuI、AlfI、AloI、BdaI、BplI、Hin4I、TscaAI 和 TstI0
4.根据权利要求I所述的载体,其中所述载体的多克隆位点序列包含SEQID NO: I或5。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的载体在基因工程中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述基因工程是定向克隆或非定向克隆。
7.一种支持多种工具酶单独或共同工作的缓冲液，其特征在于包含50mMTris-乙酸，IOOmM 乙酸钾，15mM 乙酸镁、ImM DTT,0. 1%BSA、0. 5mM ATP，pH 为 7. 5-8. 3，优选地，为 7. 7、7.9,8.0,8. 1,8. 3，更优选地为8. 3，所述工具酶包括但不限于T4DNA连接酶、限制性内切酶、多聚核苷酸激酶和Klenow片段。
8.根据权利要求7所述的缓冲液在基因工程中的应用。
9.一种将目的DNA片段与载体连接的方法，其特征在于使用根据权利要求I至4中任一项所述的载体在同一个步骤中完成所述目的DNA片段与所述载体的酶切和连接。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于使用根据权利要求7中所述的缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种新型的载体、一种支持多种工具酶单独或共同工作的缓冲液以及它们的使用方法。与传统方法相比，使用本发明的载体和缓冲液进行目的DNA片段与载体连接的过程更加简单、有效和可靠。
文档编号C12N15/63GK102732546SQ20121015779
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者刘庆法 申请人:无锡天演生物技术有限公司