利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，设计引物扩增扩增第九外显子及内含子部分序列(315bp)和第九外显子反义序列(155bp)，同时扩增sbe2b启动子，将含有正反外显子及内含子的整体DNA片段连同启动子同时连入pCAMBIA3301载体的多克隆位点中；然后，将ss1启动子片段及ss1基因cDNA片段替换MCS中含sbe2b?RNAi三片段的pCAMBIA3301载体的35S及GUS片段，因此该表达载体同时含有sbe2b启动子控制的反义sbe2b?cDNA片段和ss1启动子控制的ss1全长cDNA片段。本发明提供的表达载体中含有的sbe2b?RNAi片段能够降低SBEIIb酶的活性，使淀粉合成时分支数降低，从而提高直链淀粉的相对含量；同时该载体中含有的ss1基因过表达片段能够提高玉米胚乳SSI酶的活性，从而提高总淀粉含量。
【专利说明】利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及一种利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法。
【背景技术】
[0002]要进行目的基因介导的遗传改良，应首先构建相应的表达载体后进行遗传转化。Fromm等(1986)最先开展了玉米遗传转化工作，利用电击法诱导玉米原生质体吸收携带npt II (neomycin phosphotransferase II，氯霉素乙酰转移酶基因)的质粒DNA,电击处理后检测到了该基因在玉米细胞中的表达，进一步将npt II基因转入玉米原生质体，获得了稳定转化的抗性愈伤组织。Rhodes等(1988)利用电击法将npt II酶基因转入玉米原生质体，成功建立玉米原生质体转化系统，首次获得了玉米转基因植株，但转基因植株全部不育。1988年，Grimsly等将玉米条纹病毒基因构建到农杆菌Ti质粒上，利用农杆菌侵染玉米植株，导致了系统感染症状，首次证明了农杆菌可以侵染玉米细胞。1991年Gould等用根癌农杆菌与玉米茎尖共培养获得了转基因植株。后来Gordon-Kamm(1990)等利用基因枪介导法分别将bar基因、⑶S基因和LUC基因(luciferase gene，萤光素酶)等转入玉米，获得了转基因植株。Lupotto等(2004)对农杆菌侵染后玉米愈伤组织的培养及诱导条件进了研究，并成功获得转化株。Ishida等(1996年)利用农杆菌介导法转化玉米自交系A188未成熟胚，获得了大量转基因植株，建立了农杆菌介导法高效转化体系，此后这一方法在玉米的遗传转化中得到了广泛的应用。丁群星(1993)等利用微玻璃针注射授粉后10-20h的玉米子房，将苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫蛋白基因转入玉米，获得可育的转基因植株。周逢勇王国英等(1998)博士在国内率先建立了玉米的基因枪和农杆菌转化体系，将Bt杀虫蛋白基因转入玉米，获得抗虫转基因玉米植株。综上所述，虽然在玉米转化中采用的方法有电击法、基因枪介导法、超声波法、微注射法、PEG法和农杆菌介导法等，但基因枪介导法和农杆菌介导法应用的最为成功，技术已相当成熟。授粉后18天左右的幼胚是普遍采用的受体材料，再生能力强，转化效果好 。对农杆菌介导法而言，适宜转化的玉米基因型还比较有限，适宜的农杆菌菌系有C58C1和LBA4404，共培养基中加入适量的乙酰丁香酮(AS)、脯氨酸、谷氨酰胺等物质，有利于农杆菌侵染玉米幼胚和提高转化效率。
[0003]基因工程改变淀粉主要集中于淀粉含量及品质。在淀粉含量方面主要集中对ADPGPPase焦磷酸化酶基因的操作上，Stark等人(1992)利用突变的大肠杆菌菌株618来源的ADPGPPase基因glgC16 (对变构调节不敏感)加上不同的启动子，构建植物表达载体，转化到烟草的愈伤组织中，获得了大量转基因烟草愈伤组织。淀粉含量分析表明，转基因烟草淀粉平均值占干重的10.7 %。有些转基因烟草淀粉干重高达27%，而对照非转基因烟草却仅含3.4%的淀粉。用上述表达载体进一步转化马铃薯，成功地获得了转化植株，在转化植株中，淀粉含量平均提高了 35%。在减少淀粉含量方面，Muller-Rober等人(1992)利用含有不同启动子和反向连接的ADPGPPase大、小亚基cDNA基因构建表达载体，转化马铃薯，在35S加上反向连接的ADPGPPase大亚基cDNA的融合基因转化植株中，叶片的ADPGPPase活性仅为野生型的5% -30%，块茎中ADPGPPase活性仅为野生型的2%，分析转化植株淀粉含量，结果表明转化植株块茎淀粉含量仅为野生型的5% -3.5%，伴随着淀粉含量的下降，转化植株细胞内可溶性糖显著升高蔗糖和葡萄糖分别占块茎干重的30%和8%。Wang等(2007)把来自于大肠杆菌的glgC16基因转化到玉米中，提高了籽粒中ADPGPPase活性，增加了籽粒重量。在改变淀粉含量的研究之中，多数是针对ADPGPPase的，反映出ADPGPPase在控制淀粉合成速率方面的重要性，但值得指出的是，并非淀粉合成速率仅受AGPPase控制，在玉米中SSS(Soluble starch synthase,可溶性淀粉合成酶)或SBE的作用也相当明显(Jenner，1993)，对它们的表达进行研究，对于提高淀粉含量也具有重要意义。
[0004]目前通过分子生物学技术进行遗传改良以提高作物籽粒直链淀粉含量的方法主要是利用RNAi技术抑制淀粉分支酶基因的表达，以提高作物籽粒中的直链淀粉相对含量。国际专利W09722703A2报道了用玉米的sbe2b转化玉米的研究，把sbe2b的cDNA基因或部分片断正向或反向置于玉米zein蛋白启动子(胚乳特异性启动子)控制下，组成一系列植物表达载体转化玉米，成功地获得了转基因植株。在转化sbe2b基因3’部分序列反义结构的转基因玉米中内源sbe2b基因受到了抑制，转基因玉米淀粉粒中较长糖链增加了近2倍。在5’部分序列反义结构表达载体以及sbe2b基因全长cDNA反义结构表达载体中也获得了类似的结果。近年来研究表明=RNAi技术是更有效地抑制基因表达的方法之一，抑制效率和抑制效果均高于反义 RNA 技术(Smith et al, 2001 ；ffesley et al.2001 ；Stout jesdi jket.al，2002)。柴晓杰等(2005)克隆玉米淀粉分支酶基因，并构建高效的RNAi表达体系，通过花粉管通道法将其导入玉米自交系，抑制淀粉分支酶基因的表达，提高玉米直链淀粉的含量。Li JH等(2007)对玉米淀 粉分支酶突变体研究中发现淀粉分支酶的失活可以显著增加直链淀粉含量。
[0005]玉米籽粒淀粉合成相关酶类往往形成特定的功能复合体，以一个整体结构参与淀粉合成。利用RNA干涉或反义RNA技术降低了淀粉分支酶基因的表达，导致籽粒中直链淀粉的相对含量(直支比)升高，但由于功能复合体构象发生了改变，导致其它相关蛋白的活性下降，导致总淀粉含量降低；同时由于RNAi技术使sbe2b基因不能正常表达，减少了淀粉合成过程中葡聚糖非还原末端，也引起SSI等关键酶活性的下降，造成糖链延长末端不足，引起整个淀粉合成速度的降低，减少了总淀粉含量。
【发明内容】
[0006]针对由于RNAi技术使sbe2b基因不能正常表达，同时也引起SSI等关键酶活性的下降，本发明旨在通过构建含有sbe2b启动子控制的反义sbe2b cDNA片段和ssl启动子控制的ssl全长cDNA片段的植物表达载体，在提高直链淀粉含量的同时使总淀粉含量得到一定的提闻。
[0007]本发明实施例是这样实现的，一种利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，该构建方法包括:
[0008]sbe2b RNAi载体的构建:玉米sbe2b基因在胚乳中特异表达，因此我们选用sbe2b启动子驱动干涉片段的表达。通过对sbe2b基因进行在线同源比对，发现其第九外显子特异性较高，因此我们设计引物扩增第九外显子及内含子部分序列(315bp)和第九外显子反义序列(155bp)，同时扩增sbe2b启动子，将上述三片段同时连入pCAMBIA3301载体的多克隆位点(MCS)中。
[0009]ssl过表达载体的构建:利用ssl基因启动子驱动玉米ssl基因的表达，将ssl启动子片段及ssl基因cDNA片段替换MCS中含sbe2b RNAi三片段的pCAMBIA3301载体的35S及⑶S片段，因此该表达载体同时含有sbe2b启动子控制的反义sbe2b cDNA片段和ssl启动子控制的ssl全长cDNA片段。
[0010]sbe2b RNAi载体的构建方法包括:
[0011]①sbe2b启动子扩增；
[0012]②sbe2b第九外显子正反片段及内含子扩增；
[0013]③质粒提取及酶切；
[0014]进一步，sbe2b启动子扩增，引物自行设计，结构为:
[0015]Psbe2b-F:aagctTGAAGAGAGAATGAAAGCGAACTG
[0016]Psbe2b-R: gaattcGGATCGAACTGATCAGCCAATG
[0017]PCR反应体系及程序如下:
[0018]将扩增片段经过电泳胶回收后连接入pMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5a细胞，挑取阳性克隆并测序验证。
[0019]进一步，sbe2b第九外显子正反片段及内含子扩增，引物自行设计，结构为:
[0020]正义第九外显子及内含子部分序列315bp:
[0021]2b315-F: gaattcTTCATGACATCTGATCACCAG
[0022]2b315-R: ggatccGAATTGCTGACACCAACAGCT
[0023]第九外显子反义序列155bp:
[0024]2bl55-F:ggatccTTATACACCCCAGGCTTTCGAC
[0025]2bl55-R:cccgggTTCATGACATCTGATCACCAG
[0026]PCR及后续T载体克隆实验见①sbe2b启动子扩增。
[0027]进一步，质粒提取及酶切，sbe2b启动子用HindIII及EcoRI双酶切；正义第九外显子及内含子部分序列315bp,用EcoRI及BamHI双酶切；反义序列用BamHI及SmaI双酶切；经改造MCS中含NOS终止子的pCAMBIA3301载体用HindIII及SmaI双酶切。
[0028]进一步，ssl过表达载体的构建方法为:
[0029]①ssl基因及启动子克隆；
[0030]②质粒提取及酶切。
[0031]进一步，ssl基因及启动子克隆，ssl启动子引物，:根据课题组首次克引物为:
[0032]Pssl-F:aagcttACGCTGCAGCGAGAGGCGGGATC
[0033]Pssl-R:ggatccTGCGGAGAGGGAGAGCAGACAG
[0034]ssl基因编码区引物:
[0035]ssl-F:ggatccATGGCGACGCCCTCGGCCGTGG
[0036]ssl-R:cacgtgTTACATGACATAGGGTCGATC。
[0037]进一步，质粒提取及酶切，ssl启动子用HindIII及BamHI双酶切，ssl基因用BamHI及PmaCI双酶切。
[0038]本发明提供的表达载体中含有的sbe2b RNAi片段能够降低SBEIIb酶的活性，使淀粉合成时分支数降低，从而提高直链淀粉的相对含量；同时该载体中含有的ssl基因过表达片段能够提高玉米胚乳SSI酶的活性，从而提高总淀粉含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1是本发明实施例提供的RNAi载体构建相关片段的酶切电泳图；
[0040]图2是本发明实施例提供的ssl过表达载体相关片段的酶切电泳图；
[0041]图3是本发明实施例提供的同时含有sbe2b启动子控制的反义sbe2b cDNA片段和ssl启动子控制的ssl全长cDNA片段的完整载体图(pSSIRNAi)。
【具体实施方式】
[0042]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0043]本发明实施例选用植物表达载体pCAMBIA3301进行目的载体的构建。具体叙述如下:
[0044](I) sbe2b RNAi 载体的构建。
[0045]①sbe2b启动子扩增
[0046]引物自行设计，由上海英骏公司合成:
[0047]Psbe2b-F:aagctTGAAGAGAGAATGAAAGCGAACTG`[0048]Psbe2b-R: gaattcGGATCGAACTGATCAGCCAATG
[0049]PCR反应体系及程序见下:
[0050]表1PCR 反应体系(20 μ L)
体系成分体积[_]KOD DNA 袭各每0.4 ML
K0D 而。3 μ?
2 X KOD buffer10 μ L
Psbe2b-F Primer0.6 μ L
[0052]
Psbe2b-R Primer0.6 μ L
基因组DNA模板I μ L
CidH2O4.4 μ L
[0053]表2PCR反应程序
【权利要求】
1.一种利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，该构建方法包括: sbe2b RNAi载体的构建:玉米sbe2b基因在胚乳中特异表达，选用sbe2b启动子驱动干涉片段的表达，通过对sbe2b基因进行在线同源比对，发现其第九外显子特异性较高，因此我们设计引物扩增第九外显子及内含子部分序列315bp和第九外显子反义序列155bp，同时扩增sbe2b启动子，将上述三片段同时连入pCAMBIA3301载体的多克隆位点MCS中；ssl过表达载体的构建:利用ssl基因启动子驱动玉米ssl基因的表达，将ssl启动子片段及ssl基因cDNA片段替换MCS中含sbe2b RNAi三片段的pCAMBIA3301载体的35S及⑶S片段，因此该表达载体同时含有sbe2b启动子控制的反义sbe2b cDNA片段和ssl启动子控制的ssl全长cDNA片段。
2.如权利要求1所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，sbe2b RNAi载体的构建方法包括: ①sbe2b启动子扩增； ②sbe2b第九外显子正反片段及内含子扩增； ③质粒提取及酶切。
3.如权利要求2所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，sbe2b启动子扩增，引物自行设计，结构为:
Psbe2b-F:aagctTGAAGAGAGAATGAAAGCGAACTG
Psbe2b-R:gaattcGGATCGAACTGATCAGCCAATG
PCR反应体系及程序如下:` 将扩增片段经过电泳胶回收后连接入PMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5a细胞，挑取阳性克隆并测序验证。
4.如权利要求2所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，sbe2b第九外显子正反片段及内含子扩增，引物自行设计，结构为: 正义第九外显子及内含子部分序列315bp:
2b315-F:gaattcTTCATGACATCTGATCACCAG
2b315-R:ggatccGAATTGCTGACACCAACAGCT
第九外显子反义序列155bp:
2bl55-F:ggatccTTATACACCCCAGGCTTTCGAC
2bl55-R:cccgggTTCATGACATCTGATCACCAG PCR及后续T载体克隆实验见①sbe2b启动子扩增。
5.如权利要求2所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，质粒提取及酶切，sbe2b启动子用HindIII及EcoRI双酶切；正义第九外显子及内含子部分序列315bp,用EcoRI及BamHI双酶切；反义序列用BamHI及SmaI双酶切；经改造MCS中含NOS终止子的pCAMBIA3301载体用HindIII及SmaI双酶切。
6.如权利要求1所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，ssl过表达载体的构建方法为: ①ssl基因及启动子克隆； ②质粒提取及酶切。
7.如权利要求6所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，ssl基因及启动子克隆，ssl启动子引物，:根据课题组首次克引物为:
Pssl-F:aagcttACGCTGCAGCGAGAGGCGGGATC
Pssl-R:ggatccTGCGGAGAGGGAGAGCAGACAG
ssl基因编码区引物:
ssl-F:ggatccATGGCGACGCCCTCGGCCGTGG
ssl-R:cacgtgTTACATGACATAGGGTCGATC。
8.如权利要求6所述的利用基因 工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，质粒提取及酶切，ssl启动子用HindIII及BamHI双酶切，ssl基因用BamHI及PmaCI双酶切。
【文档编号】C12N15/82GK103484494SQ201210334553
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年9月12日 优先权日:2012年9月12日
【发明者】黄玉碧, 李炀平, 张军杰, 刘汉梅, 胡育峰, 顾勇, 刘应红 申请人:四川农业大学