基因工程生长因子变异体的制作方法
【专利摘要】本申请公开了一种重组制成的蛋白质构建体，其优先地形成多聚体。
【专利说明】基因工程生长因子变异体
[0001]相关申请的引用
[0002]本申请要求于2011年5月9日提交的美国临时申请号US61/484，052的权益，其公开内容通过引用并入本文中。
【技术领域】
[0003]本申请涉及生长因子变异体领域以及用于控制此类生长因子的多聚化的方法。
【背景技术】
[0004]在生物系统中，蛋白质通常构成复杂的信号级联，该级联指导细胞以特别的方式活动。例如，细胞被导向至开始分裂过程的普通方式为蛋白质(配体)结合至跨膜蛋白受体的胞外域(胞外结构域)，其中配体至胞外域的结合为受体赋予构象方面的变化。配体诱导的构象变化可以发生于胞外域、胞内域(胞内结构域)或该二者中并且导致变化，在该变化中蛋白质或分子能够与受体结合。这种由外至内的信号是用于发信号使细胞分裂、启动程序性细胞死亡和许多其他过程的常见机制。
[0005]调节生长因子受体活性的一种常用机制是配体诱导的受体的胞外域的二聚化，这反过来使胞内尾部并拢，从而为修饰性蛋白质(如激酶)制备了良好的停泊位点(dockingsite)，该修饰性蛋白质引发向细胞核发出信号而引起细胞分裂的信号级联。
[0006]配体诱导的生长因子的胞外域的二聚化通常是通过配体二聚体的结合来完成的；即两个配体非共价彼此结合以形成同源二聚体或异源二聚体，然后该同源二聚体或异源二聚体结合至相同的(同源)或不同的(异源的)的两个受体。
[0007]配体诱导的受体二聚化的重要实例是匪23 二聚体结合至MUC1*的胞外域并且使MUC1*的胞外域二聚化，MUCI*是肿瘤和干细胞特异的MUCl跨膜蛋白的截短型。不论配体是否为单体、二聚体或更高阶的多聚体，除了其他因素之外，其都与配体的浓度有关。对于许多生长因子受体，只有二聚体形式的配体能够活化生长因子受体。此外，在许多生物系统中，都存在反馈环路，其中更高阶的多聚体关闭由二聚体促进的功能。例如，匪23 二聚体活化多能性增长但是匪23六聚体关闭多能性增长并且引发分化。类似地，λ噬菌体的Cl蛋白当其以四聚体结合至DNA时开启一组基因的转录，但随着浓度的增加，当该Cl蛋白变成八聚体时，其关闭那些基因的转录。在许多情况下，需要组成性激活生长因子受体或增加由特异的多聚化状态的蛋白质所介导的一些活性。问题是非常难于表达和分离出特异的多聚体，并且当将其加入到生物系统中或在生物系统中表达时，更加难以维持多聚化状态。因此，能够产生仅以特异的多聚化状态存在的或偏好该多聚化状态的配体(如二聚体或偏好二聚化的配体)将是有利的。
[0008]尽管已经报道了匪23突变体偏好二聚体形成，但是相对于非活性六聚体，作为活性二聚体而存在的部分差异很大，特别是当作为重组蛋白表达时，取决于表达它的细胞、浓度以及一些难于或不可能控制的蛋白质表达条件。因此，开发出能够产生出更高百分比或更稳定数目的二聚体形式的匪23或匪23突变体的方法(包括重组体方法)将是有益的。
【发明内容】
[0009]本发明克服了上述问题并且提供产生偏好特异的多聚化状态的蛋白质的蛋白质的遗传变异体、嵌合体和单链构建体。
[0010]在一方面，本发明涉及一种重组制备的蛋白质构建体，其优先地形成特异的多聚体。该多聚化状态可以为其生物学活性状态。该多聚化状态可以是二聚体。可替代地，该多聚化状态可以为其非活性状态。该多聚化状态可以为高阶多聚体。
[0011]蛋白质可以是生长因子或转录因子。二聚体形式可以为同源二聚体或异源二聚体。蛋白质可以为哺乳动物蛋白质，如人类蛋白质或小鼠蛋白质。
[0012]蛋白质构建体可以包含两种单体或单体的片段，其中它们可以通过接头肽连接在一起，从而形成单体-接头-单体构建体。
[0013]单体蛋白质可以为匪23，例如Hl、H2或H7异构体。单体可以为匪23或其偏好形成二聚体并抑制形成高阶多聚体的突变体。突变体匪23可以为S120G或P96S或匪23和P96S。单体可以为匪23或其偏好形成二聚体的突变体，其中删除了一至十个C-末端氨基酸。可以删除一至六个C-末端氨基酸。
[0014]接头可以包括GS、GS2、GS3、IgGl铰链区、或IgG2a铰链区或它们的组合。
[0015]在一方面，蛋白质构建体可以包括:
[0016]NM23S120G GS2,
[0017]NM23P96S GS2,
[0018]NM23P96S/S120G GS2,
[0019]NM23P96SAC1GS2，
[0020]NM23P96SAC2GS2，
[0021]NM23P96SAC6GS2，
[0022]NM23P96SAC1/S120G GS2,
[0023]NM23P96SAC2/S120G GS2,
[0024]NM23P96SAC6/S120G GS2,
[0025]NM23S120G GS3,
[0026]NM23P96S GS3,
[0027]NM23P96S/S120G GS3,
[0028]NM23P96SAC1GS3,
[0029]NM23P96SAC2GS3,
[0030]NM23P96SAC6GS3,
[0031]NM23P96SAC1/S120G GS3,
[0032]NM23P96SAC2/S120G GS3,
[0033]NM23P96SAC6/S120G GS3,
[0034]NM23S120G IgGlh noC,
[0035]NM23P96S IgGlh noC,
[0036]NM23P96S/S120G IgGlh noC,
[0037]NM23P96S Λ ClIgGlh noC,[0038]NM23P96SAC2IgGlh noC,
[0039]NM23P96SAC6IgGlh noC,
[0040]NM23P96SAC1/S120G IgGlh noC,
[0041]NM23P96SAC2/S120G IgGlh noC,
[0042]NM23P96SAC6/S120G IgGlh noC,
[0043]NM23S120G IgG2ah noC,
[0044]NM23P96S IgG2ah noC,
[0045]NM23P96S/S120G IgG2ah noC,
[0046]NM23P96SAClIgG2ah noC,
[0047]NM23P96SAC2IgG2ah noC,
[0048]NM23P96SAC6IgG2ah noC,
[0049]NM23P96SAC1/S120G IgG2ah noC,
[0050]NM23P96SAC2/S120G IgG2ah noC,
[0051]NM23P96SAC6/S120G IgG2ah noC,
[0052]NM23S120G IgGlh/IgG2ah noC,
[0053]NM23P96S IgGlh/IgG2ah noC,
[0054]NM23P96S/S120G IgGlh/IgG2ah noC,
[0055]NM23P96SAClIgGlh/IgG2ah noC,
[0056]NM23P96SAC2IgGlh/IgG2ah noC,
[0057]NM23P96SAC6IgGlh/IgG2ah noC,
[0058]NM23P96SAC1/S120G IgGlh/IgG2ah noC,
[0059]NM23P96SAC2/S120G IgG2ah noC,或
[0060]NM23P96SAC6/S120G IgG2ah noC。
[0061 ] 在一个方面，可以通过将蛋白质单体重组地连接至第二组件(组分)而形成特异的多聚体。可以在第二组件之间形成特异的多聚体。第二组件可以为接头肽或蛋白质或蛋白质片段。
[0062] 在一个方面，第二组件之间可以通过化学键形成多聚体。或者，第二组件之间可以通过共价键形成多聚体。共价键可以是二硫键。并且特别地，多聚体可以是二聚体。
[0063]在一个方面，第二组件可以为IgGl铰链或IgG2a铰链或它们的组合。蛋白质构建体可以是 NM23-S120G-1gGlh、bNM23-S120G_IgG2ah 或 NM23S120G IgGlFc0
[0064]在另一方面，在上述的蛋白质构建体中，第二组件之间可以通过非共价键形成多聚体。第二组件可以是具有高亲和力以与另一种蛋白质结合的蛋白质。第二组件可以是抗体Fos或Jun的Fe区的整体或一部分。Fe区可以是IgGlFc。在一个方面，第二组件可以能够同源二聚化或异源二聚化。
[0065]在另一方面，可以将半胱氨酸插入到蛋白质中以通过二硫键促进多聚体形成。第二组件可以为IgM抗体的Fe结构域的片段。
[0066]在另一方面，在任何以上所讨论的蛋白质构建体中，可以包括促进进入细胞或进入细胞的细胞核的氨基酸序列。
[0067]在又另一方面，在任何以上所讨论的蛋白质构建体中，可以包括促进由其表达的宿主细胞分泌的蛋白质构建体的氨基酸序列。
[0068]本发明还涉及一种分离的核酸，其包括任何以上所讨论的蛋白质构建体。核酸可以进一步包含编码氨基酸序列的序列，该氨基酸序列促进进入细胞或进入细胞的细胞核。核酸可以进一步包含编码氨基酸序列的序列，该氨基酸序列促进蛋白质表达的宿主细胞分泌该蛋白质。核酸可以包括编码匪23或其偏好二聚体形成的匪23突变体的核酸。
[0069]在另一方面，本发明涉及一种表达载体，其包括任何以上所讨论的核酸。该载体可以是质粒或病毒。
[0070]在另一方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含以上所讨论的载体。
[0071]在又另一方面，本发明涉及一种用于增殖细胞的方法，其包括用本文所讨论的载体转染或转导细胞。该细胞可以是干细胞或祖细胞。
[0072]在又另一方面，本发明涉及一种用于在体细胞中诱导多能性的方法，其包括用本文所描述的载体转染或转导细胞。
[0073]在另一方面，本发明涉及一种治疗患有通过给予未成熟细胞的治疗能够得到缓解的病症(condition)的患者的方法,包括:
[0074](i)用本文所讨论的载体转染或转导宿主细胞以获得干细胞、祖细胞或iPS细胞；以及
[0075](ii)将该获得的干细胞、祖细胞或iPS细胞给予到患者体内。
[0076]载体中一个或多个基因的核酸序列可以是原属于该细胞的并且可以是已经被修饰的。
[0077]在另一方面，本发明涉及一种用于改变靶基因的表达的方法，其包括下列步骤:
[0078](i)制成编码转录因子变异体的核酸；以及
[0079](ii)促使该核酸进入到靶细胞中。
[0080]上述方法可以进一步包括步骤(i i i )设计该核酸以插入在靠近靶基因的启动子位点的位置。靶细胞可以是干细胞或祖细胞。该祖细胞可以是造血细胞。并且该祖细胞可以是B-细胞或B-细胞前体。
[0081 ] 在另一方面,本发明涉及以上描述的方法，其进一步包含工程改造(engineering)转录因子的多聚化状态，从而如果需要表达目标基因时促进活性状态，且如果需要抑制目标基因时促进不处于活性状态。
[0082]在又另一方面，本发明涉及一种治愈或缓解疾病的方法，该疾病可以受益于干细胞或祖细胞的增加产生，该方法包括向患有或处于产生疾病、遗传缺陷或不健康病症风险的患者给予如上所描述的细胞。细胞可以是受精卵或未受精卵。细胞可以是干细胞或祖细胞。细胞可以获自待治疗的患者。或者细胞可以是iPS细胞。细胞可以是来自待治疗患者的iPS细胞。
[0083]在另一方面，本发明涉及一种用于识别偏好二聚化且抵抗形成更高阶多聚体的生长因子的方法，其包括测定生长因子对靶受体的结合亲和力，其中高阶多聚体不能以与二聚体相同的亲和力结合到靶受体。生长因子可以是匪23并且靶受体可以是MUC1*。靶受体可以是MUC1*胞外域肽，该MUC1*胞外域肽可以是具有序列GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQ ID NO:1)的 PSMGFR 肽。
[0084]在另一方面，本发明涉及如上的蛋白质，其经基因工程改造以抵抗二聚体的形成。该蛋白质可以经基因工程改造以偏好形成高阶多聚体。该蛋白质可以经基因工程改造以偏好形成四聚体、五聚体或六聚体。高阶多聚体包含基因融合到IgM抗体的Fe部分的蛋白质。该蛋白质可以是生长因子。该蛋白质可以是NM23。该蛋白质可以是转录因子。该蛋白质可以是p53。
[0085]本发明涉及增加蛋白质的特异性多聚化状态的方法和组合物。该方法可以被应用到多聚体是活性形式的任何蛋白质上，特别是其中活性形式为二聚体。
[0086]一种用于制备多聚配体的方法是为已经连接的重组蛋白制备构建体。例如，其中将两个或多个单体直接连接或通过长度或序列可变的接头连接以获得所需的生物学活性的单链蛋白质。
[0087]另一种用于制备其为多聚的配体的方法是制备重组嵌合体，其中各个单体被连接至多聚的蛋白质的一部分。例如，蛋白质Fos和Jun相互作用以使这些蛋白质能够被基因地(遗传学地)连接至配体(配体可以是相同或不同的)以引起所得嵌合体的二聚化。类似地，抗体的Fe区二聚化。当制得配体-Fe区嵌合体时，它们二聚化并且能够模拟天然产生的二聚配体的活性。
[0088]又另一种用于制备配体多聚体的方法是通过两种或更多种单体配体的化学偶联。例如，可以使用双官能接头来化学偶联两种蛋白质配体以制备同源或异源二聚体。
[0089]又另一种用于制备多聚配体的方法是识别结合至靶受体的小分子，然后合成小分子的多聚体。
[0090]在优选的实施方式中，优选用于增强天然生物相互作用(例如活化生长因子受体)的多聚化状态是二聚体。在更优选的实施方式中，被制成二聚化或制成偏好二聚体形成的配体是匪23。优选的是匪23同种型Hl (NME1)、H2 (NME2)和H7 (NME7)，特别优选的是Hl0在又一更优选的实施方式中，匪23是人源的。
[0091]因为结合至受体并且活化受体(且特别是生长因子受体)的许多配体通过使它们的同源受体二聚化而活化同源受体，一种用于抑制生长的途径是使用上述方法之一来制备配体的多聚体，其中多于两个配体被连接在一起或被促使形成高阶多聚体。还常见的是结合至特定核酸序列的配体只有当它们处于二聚化状态时才这样做。再次，可以使用上述的方法来制备这些蛋白质或小分子的变异体以便它们优先地形成二聚体，特别是当结合至核酸时。为了抑制核酸结合，可以产生偏好形成高阶多聚体的变异体。
[0092]在优选的实施方式中，被设计以形成高阶多聚体的配体能够与野生型蛋白质相互作用以抑制天然蛋白质形成二聚体的能力。例如，匪23-H1结合至MUC1*生长因子受体并且诱导二聚化，这引发生长、存活和多能性。取决于其序列和浓度，天然匪23以单体、二聚体、四聚体或六聚体存在。重组匪23可以被复性(重新折叠，refolded)或纯化，以使二聚体的群体能够被分离。已经从人类癌症中分离出偏好二聚体形成且抵抗四聚体和六聚体形成的匪23-H1突变。因此，一种用于抑制癌变生长的途径可以是识别偏好形成高阶多聚体的匪23突变体，其不会诱导生长和多能性。特别优选的是如下那些突变体，这些突变体能够募集野生型匪23进入它们的多聚体中以使它们不会形成与癌症相关的二聚体。
[0093]二聚化形式的 匪23结合至干细胞和祖细胞上的MUC1*受体。结合至MUC1*有利于匪23 二聚体的胞吞作用，其后它们被易位至细胞核，在那里匪23以二聚体结合至DNA以调节涉及干细胞和祖细胞的生长和多能性(pluripotency)以及多潜能性(multipotency)的基因转录。因此，本发明的一个重要应用是使用所描述的方法以制备偏好二聚体形成的匪23变异体，以在生长、维持和诱导多能性中使用。即，偏好二聚体形成的匪23变异体可以在体外、离体和体内中使用以促进干细胞和祖细胞的生长并且维持多能性或多潜能性。
[0094]此外，本发明还包括向患者给予这些匪23变异体以治疗病症，该病症能够受益于用未成熟细胞(包括干细胞和祖细胞)的治疗。可以向患者全身性或局部地给予匪23和匪23变异体。
[0095]本发明还包括在患者体外或体内、在受精卵或未受精卵中或在干细胞中使用本发明的方法，用于研究或拟用于治疗用途以及用于诱导多能性或诱导细胞至较不成熟的状态，本发明的方法引导(influence)蛋白质至特定的多聚化状态以实现单体或一些其他多聚体不能赋予的生物功能。在这种情况下，使用编码匪23变异体的核酸，例如作为表达载体的一部分。在一个实施方式中，匪23被设计成靠近靶基因定位。例如，匪23可以被设计成插入到目标基因中或靠近目标基因。在一个病例中，患者自身的细胞(其可以是iPS细胞或部分的iPS细胞)携带校正基因或插入基因；编码一种或多种偏好二聚化的匪23变异体的核酸被插入到相同的细胞中，以促进所述细胞在体外(in vitro)、离体(ex vivo)或体内(in vivo)的增殖。
[0096]在一个实施方式中，这些方法与通过有选择地增殖特定细胞群体而纠正基因缺陷或疾病病症的方法配合使用。例如，可以使表达胎儿形式的血红蛋白或用于治疗镰状细胞性贫血的纠正基因的细胞表达二聚化NM23。在另一个实施方式中，在基因治疗设置中使用这些方法以刺激细胞的生长。在另一个实施方式中，如对于自身免疫病的治疗，使用亦或生长促进多聚体亦或生长抑制多聚体以增加或减少特定细胞型的生产。
[0097]匪23及匪23变异体还促进其他哺乳动物的干细胞和祖细胞的生长。例如，在匪23二聚体(不论是野生型蛋白质还是蛋白质的变异体，或不论是人类来源的还是小鼠来源的)的存在下，小鼠干细胞和祖细胞激增。
[0098]从本发明的以下描述、所附的参照附图以及所附的权利要求中可以更全面地理解本发明的这些和其他的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0099]从下文的详细描述以及附图中可更加全面地理解本发明，附图仅以示例的方式给出并因此不限制本发明，其中:
[0100]图1是测量的癌症细胞生长作为二价或单价抗体浓度的函数的曲线图，显示MUCI*受体的二聚化刺激生长。通过添加二价(Ab)抗-MUC1*刺激并且通过添加单价Fab抑制MUCl阳性的乳腺癌细胞ZR-75-30的生长。添加的二价抗体产生特征性的钟形生长曲线，表现出生长因子受体的二聚化。UMCl阴性HEK293细胞的生长未受到二价或单价Fab抗MUCI*的影响。当过量添加二价抗体时,每个受体上都结合有一个二价抗体,而不是一个二价抗体使每两个受体二聚化，从而抑制生长。
[0101]图2示出重叠的FPLC迹线，其表征野生型NM23 (WT)或突变体NM23-S120G的三种不同群体的不同多聚化状态。野生型匪23示出对应于六聚体的分子量的单峰和对应于高阶多聚体的肩峰。未复性(未重新折叠)的NM23-S120G (标记为“混合的”)一种制剂具有对应于二聚体的主峰和对应于四聚体的小峰。未复性的匪23-S120G (“六聚体”)的另一种制剂具有六聚体的主峰和高阶多聚体的肩峰。NM23-S120G (“二聚体”)的复性制剂主要包
含的是二聚体。
[0102]图 3 (a)示出 NM23-WT、NM23-S120G-混合、NM23-S120G-六聚体和 NM23-S120G- 二聚体的非还原性凝胶的照片，其显示了野生型蛋白质以及S120G突变体的三种不同制剂的多聚化状态。(b)示出重叠的表面等离子体共振(SPR)测定，显示四种不同的匪23结合至MUC1*胞外域肽(PSMGFR)的能力，胞外域肽(PSMGFR)连接到SPR芯片表面。结果显示匪23结合至其同源受体MUC1*的量是有多少二聚体存在于样品中的函数。SPR测定芯片溶液界面上的蛋白质质量，所以如果六聚体结合至MUC1*肽表面，其将产生大于二聚体结合的3倍的SPR信号。(c)示出纳米粒子实验的照片，实验显示仅有匪23 二聚体结合至同源受体MUC1*。将MUC1*胞外域肽固定到金纳米粒子上。向每等分的纳米粒子加入匪23-WT、NM23-S120G- 二聚体或NM23-S120G-六聚体。如果NM23结合至纳米粒子固定的MUC1*肽，其将引起纳米粒子聚拢在一起，这将导致溶液从粉红色变成蓝色。该实验显示只有NM23-S120G- 二聚体结合至MUC1*肽。加入抗_MUCl*Fab竞争性抑制溶液中NM23-S120G- 二聚体对于纳米粒子上的MUC1*肽的结合。(d-g)示出测定不同匪23多聚体以检测它们支持多能干细胞生长的能力。在(d)NM23-S120G-二聚体、(e)NM23-S120G-六聚体、(f)NM23-WT、或(图3g) NM23-S120G- 二聚体加MUC1*胞外域肽(PSMGFR)(用于竞争性地抑制NM23 二聚体对于干细胞表面上的MUC1*受体结合)中培养人类ES (胚胎干)细胞。在(g)、(e)和(f)中以该顺序很容易地观察到诱导分化(集落增厚、变黑)，表明匪23- 二聚体-MUC1*相互作用的抑制诱导了分化，如同在不与MUC1*结合的匪23六聚体中培养细胞一样。只有二聚体制剂NM23-S120G Cd)能够支持未分化的干细胞的生长。
[0103]图4示出天然非变性凝胶，其显示匪23-WT的多聚化状态与重组体匪23-S120G的三种不同制剂的对比。
[0104]图5示出A) NM23野生型(WT)和B)产生60% 二聚体的NM23-S120G- “混合”的制剂的SPR测定。以五个不浓度注射蛋白质。结果显示，结合到MUC1*胞外域肽表面的NM23-S120G-混合的蛋白质比匪23-WT多8倍。由于野生型蛋白质为六聚体，所以RU数值必须除以3以与结合的二聚体的量比较。虽然野生型和S120G- 二聚体者显示出浓度依赖性结合，结合的野生型六聚体的量如此小以至于其可能仍处于该系统的噪声范围内。
[0105]图6 (a)示出在用于还原二硫键而添加的DTT (二硫苏糖醇)存在或不存在条件下装载有NM23单链变异体的非还原性凝胶的照片。用红色方块指示二聚体。在不存在DTT时，存在一些较高分子量的物质，这可能是因为以大概为用于培养细胞的浓度的1000倍将蛋白质装载至凝胶上。图6 (b)示出还原性凝胶的照片，其显示匪23单链变异体以预期的二聚体的分子量迁移通过该凝胶。
[0106]图7示出单链变异体NM23S120G IgGlh和NM23S120G IgG2ah的纯化的PAGE表征，使用非还原性凝胶以避免破坏二硫键。
[0107]图8示出融合嵌合体变异体匪23S120G IgGlFc的纯化的PAGE表征，使用非还原性凝胶以避免破坏二硫键。
[0108]图9示出复性的(重新折叠的)融合嵌合体变异体匪23S120G IgGlFc的PAGE表征，使用非还原性凝胶以避免破坏二硫键，其中变异体以二聚体的分子量运行，并且还使用还原性凝胶，这显示在不存在二硫键的结合时，融合变异体以单体的表观分子量运行。[0109]图10示出融合嵌合体变异体NM23-S120G_IgGlFc的FPLC Ca)和非还原性SDS-PAGE (b)表征。
[0110] 图11示出复性的NM23-S120G-GS2的FPLC (a)和非还原性SDS-PAGE (b)，其示出二聚体的主要群体。(c-e)示出人类ES细胞BGOlv/hOG细胞系的照片，它们是在Matrigel(c和d)上的和在涂覆有抗MUC1*抗体MN-C3的细胞培养板(e)上的最低干细胞培养基中、在8nM的未复性的或未纯化的匪23变异体匪23-S120G-GS2中培养的。这些数据显示NM23-S120G-GS2在使用前无需复性或纯化。
[0111]图12 示出复性的 NM23-S120G-1gGlh noC 的 FPLC(a)和非还原性 SDS-PAGE(b)，其显示出主要群体的二聚体。(c-e)示出人类ES细胞BGOlv/hOG系的照片，它们是在Matrigel(c和d)上的和在涂覆有抗MUC1*抗体MN-C3的细胞培养板(e)上的最低干细胞培养基中、在8nM的未复性的或未纯化的NM23变异体NM23-S120G_IgGlh noC中培养的。这些数据显示这种变异体在使用前无需复性或纯化。
[0112]图13示出复性的NM23-S120G-1gGlh/IgG2ah noC的FPLC(a)和非还原性SDS-PAGE(b)，其显示出二聚体的主要群体。(c-e)示出人类ES细胞BGOlv/hOG细胞系的照片，它们是在Matrigel (c和d)上的和在涂覆有抗MUC1*抗体MN-C3的细胞培养板(e)上的最低干细胞培养基中、在8nM的未复性的或未纯化的NM23变异体NM23-S120G_IgGlh/IgG2ah noC中培养的。这些数据显示这种变异体在使用前无需复性或纯化。
[0113]图14 (a)至14 (h)示出使用非还原性凝胶和相应的FPLC迹线对匪23单链变异体NM23-P96SΛ Cl (a、b)、NM23_P96SΛC2 (c、d)、NM23_P96SΛC6 (e、f)和 NM23-P96S (g、h)的SDS-PAGE表征，这些变异体都是未复性的或未纯化的。从这些FPLC迹线的比较可以看出，匪23-P96S Δ C2和匪23-P96S Δ C6在二聚体范围内具有它们的主峰，因此它们是优选的。这些数据显示这些变异体在使用前无需复性或纯化。
[0114]图15示出人类ES细胞BG01v/h0G细胞系的照片，它们是在Matrigel (a、b、d、e)上的和在涂覆有抗MUC1*抗体MN-C3的细胞培养板(c、f)上的最低干细胞培养基中、在8nM的NM23变异体中培养的，(&-(3)变异体是？965八02;((1-0变异体是？965八06。这些变异体是未复性的或未纯化的，显示它们在使用前无需复性或纯化。
[0115]图16示出主要群体的NM23-S120G (复性的“RS”)，如在FPLC迹线(a冲所示出并通过非还原性PAGE (b)所证实的其以二聚体存在。汇集通过FPLC纯化的只为二聚体的级分并且以8nM在最低干细胞培养基中使用以生长人类ES细胞BGOlv/hOG细胞系。(c_e )人类干细胞的照片显示，无论是在Matrigel (C、d)上还是在涂覆有抗-MUC1*抗体MN-C3的细胞培养板(e)上，在8nM的匪23变异体中培养都产生了多能干细胞。
[0116]图17示出人类ES细胞(H9细胞系)的照片，其培养于最低干细胞培养基加亦或复性的且纯化的NM23-S120G RS (a_d)亦或加单链构建体S120G-GS2中，单链构建体S120G-GS2被表达为二聚体并不需要复性和纯化。S120G-GS2是在存在(e_h)或不存在(1-Ι)添加的DTT下加入的。图像显示在单链变异体中培养的干细胞与它们在复性的且纯化的匪23-S120G-RS的二聚体级分中生长得一样良好。由增厚且变黑的细胞团块的缺乏证明了细胞是未分化的且多能的干细胞。
[0117]图18示出培养于最低干细胞培养基中的NM23-S120G-1gGlh noC中的人类ES细胞(H9细胞系)的照片。该NM23变异体以二聚体表达且不需要进一步加工或复性以确保其处于二聚体状态。在存在(a-d)或不存在(e-h)添加的DTT下加入S120G-1gGlhnoC。该图像显示培养在单链变异体中的干细胞与它们在复性的且纯化的S120G RS的二聚体级分中生长的一样良好(与图17a至17d相比)。由增厚且变黑的细胞团块的缺乏证明了细胞是未分化的且多能的干细胞。
[0118]图19示出人类ES细胞(H9细胞系)的照片，其培养在最低干细胞培养基加上亦或复性的且纯化的NM23-S120G RS (a-d)加上亦或单链构建体(NM23) S120G_IgGlh/IgG2ahnoC中，单链构建体(NM23) S120G_IgGlh/IgG2ah noC被表达为二聚体且不需要复性和纯化。在存在(e-h)或不存在(1-Ι)添加的DTT下加入S120G-1gGlh/IgG2ah noC。该图像显示培养于单链变异体中的干细胞与它们在复性的且纯化的NM23-S120G RS的二聚体级分中生长的一样良好(与图17a至17d相比)。由增厚且变黑的细胞团块的缺乏证明了细胞是未分化的且多能的干细胞。
[0119]图20示出描绘人类干细胞的生长的图表，人类干细胞培养在亦或复性的且纯化的仅为二聚体级分的匪23-S120G中亦或培养于设计以自发地形成二聚体的匪23变异体或由两个匪23单体构成的单链构建体的匪23变异体中。在每种情况下，接种200，000细胞并且在4天后对细胞进行计数。该图表显示不需要二聚体群体的复性或进一步纯化的变异体引起干细胞的增殖，其与已经复性以形成大多数二聚体且经FPLC进一步纯化的NM23-S120G-RS —样好或者更好(与图17a至17d相比)。
[0120]图21示出描绘人类干细胞的生长的图表，人类干细胞培养于复性的且纯化的仅为二聚体级分的匪23-S120G-RS中或者培养于设计以自发地形成二聚体的匪23变异体或由两个匪23单体构成的单链构建体的匪23变异体中。该图表显示变异体引起了干细胞的增殖，其与NM23-S120G-RS —样好或者更好，并且效果持续经过几次传代。
[0121]图22示出与复性的且纯化的匪23-S120G-RS相比的匪23变异体的基因表达的RT-PCR测量结果的图表。基因表达分析显示在设计以自发地形成二聚体的匪23变异体中培养的细胞以与复性的且纯化的仅为二聚体群体的匪23相同或以比复性的且纯化的仅为二聚体群体的匪23更高的水平表达多能性基因。
[0122]图23示出NM23-S120G-RS的核定位的照片，NM23-S120G-RS为偏好二聚化但必须复性和纯化以获得主要为二聚体的群体的单点突变。(a)未添加外源性匪23-S120G-RS ；(b) 16nM 的 NM23-S120G RS ; (c) 128nM 的 NM23-S120G RS。(a_c)用荧光标记的抗-NM23抗体染色的细胞；(d-f )DAPI核染色和荧光标记的匪23的叠加。白色箭头指示在核中存在匪23。(g)为488荧光对照。(h)为显示条件a-c的核中匪23的定量的柱状图，并且表明向培养基中加入外源性匪23-S120G RS导致匪23的内在化和向细胞核的易位。需要注意的是，与以128nM添加相比，当以16nM添加时细胞核中存在更多的匪23，这与 申请人:的发现一致，即在过高的浓度下，匪23 二聚体结合至每个MUC1*受体，而不是匪23 二聚体结合至并使两个MUC1*受体二聚化。
[0123]图24示出NM23变异体NM23-S120G IgGlh/IgG2ah noC的核定位的照片。(a)未添加外源性NM23变异体；(b)16nM的NM23变异体；(c)128nM的NM23变异体。(a_c)用荧光标记的抗-NM23抗体染色的细胞；(d-f)DAPI核染色和荧光标记的匪23的叠加。白色箭头指示在核中存在匪23。(g)为488荧光对照。(h)为显示条件a-c的核中匪23的定量的柱状图，并且表明向培养基中加入外源性NM23S120GIgGlh/IgG2ah noC变异体导致NM23的内在化和向细胞核的易位。需要注意的是，与以128nM添加相比，当以16nM添加时细胞核中具有更多的匪23变异体，这与 申请人:的发现一致，即在过高的浓度下，匪23 二聚体结合至每个MUC1*受体，而不是匪23 二聚体结合至并使两个MUC1*受体二聚化。
[0124]图25示出小鼠胚胎干(ES)细胞的照片，该细胞已经在灭活的MEF饲养细胞层上在用亦或mLIF亦或NM23-S120G-RS补充的小鼠ES细胞最低培养基中培养了两天。该图像显示在仅使用NM23 二聚体作为生长因子时小鼠ES细胞的生长与它们在具有作为基本生长因子的m LIF的标准小鼠干细胞培养基中的生长一样好。
[0125]图26示出与NM23-WT和NM23-S120G (非复性的)相比，已经复性的NM23变异体 NM23-S120G-GS2、NM23-S120G-1gGlh noC 和 NM23-S120G_IgGlh/IgG2ah noC 的非还原性SDS-PAGE表征的照片。(a)显示在非还原性凝胶上，已经复性的或纯化的变异体NM23-S120G-GS2、NM23-S120G_IgGlh noC 和 NM23-S120G_IgGlh/IgG2ahnoC 作为二聚体而存在，这与单体的表观分子量运行的野生型蛋白质相反。但是，回想起在非还原性凝胶上以单体的分子量运行的NM23六聚体，因为高价NM23多聚体不依赖于二硫键，但二聚体则依赖于二硫键。
[0126]图27示出重组产生匪23变异体的实例。应该注意的是亲和标记物，如(组氨酸)6、Str印Tagil等是可选的元件(要素)。
[0127]图28示出在已经被复性的匪23变异体中培养的人类干细胞的照片(如图标记中以 “R” 表示)。以 8nM 使用的 NM23 变异体为 NM23-S120G-RS (a、e)、NM23-S120G-GS2 (b、f)、NM23-S120G-1gGlh noC (c、g)和 NM23-S120G_IgGlh/IgG2ahnoC (d、h)。细胞形态与多能干细胞一致，因为它们是圆的且在形状上不是成纤维细胞，并且它们是缺少指示细胞分化的增厚或变黑的单层。
【具体实施方式】
[0128]在本申请中，“一(a ) ”和“一个(an ) ”用于指代单个和多个对象。
[0129]本文所使用的，“多聚体”是指共价地连接在一起或非共价地彼此融合的多个单体。
[0130]本文所使用的，“高价多聚体”是指共价地连接在一起或非共价地彼此融合的多个单体，其大于二聚体。
[0131]序列表独立文本
[0132]关于使用的除了 a、g、c、t之外的核苷酸符号，它们都遵照了 WIPO标准ST.25附录2表1中规定的惯例，其中k表示t或g ;n表示a、c、t或g ;m表示a或c ;r表示a或g ;s表不c或g ;w表不a或t且y表不c或t0
[0133]人类NM23H1
[0134](DNA)
[0135]atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaatteatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga (SEQ ID NO:97)。
[0136](氨基酸)
[0137]MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE- (SEQ ID NO:98)。
[0138]小鼠NM23H1
[0139](DNA)
[0140]atggccaacagtgagcgcaccttcattgccatcaagcctgatggggtccagcgggggctggtgggcgagatcatcaagcggttcgagcagaaggggttccgccttgttggtctgaagtttctgcaggcttcagaggaccttctcaaggagcactacactgacctgaaggaccgccccttctttactggcctggtgaaatacatgcactcaggaccagtggttgctatggtctgggagggtctgaatgtggtgaagacaggccgcgtgatgcttggagagaccaaccccgcagactctaagcctgggaccatacgaggagacttctgcatccaagttggcaggaacatcattcatggcagcgattctgtaaagagcgcagagaaggagatcagcttgtggtttcagcctgaggagctggtggagtacaagagctgtgcgcagaactggatctatgagtga (SEQ ID NO:99)。
[0141](氨基酸)
[0142]MANSERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFLQASEDLLKEHYTDLKDRPFFTGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFQPEELVEYKSCAQNWIYE- (SEQ ID NO:100)。
[0143]人类NM23H2
[0144](DNA)
[0145]atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa (SEQ ID NO:101)。
[0146](氨基酸)
[0147]MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDffVYE- (SEQ ID NO:102)。
[0148]小鼠NM23H2
[0149](DNA)
[0150]atggccaacctcgagcgtaccttcattgccatcaagccagatggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaaacggttcgagcagaaggggttccgcctggtggccatgaagttccttcgggcctctgaagaacacctgaagcagcattacatcgacctgaaagaccgtcctttcttcccggggctggtgaagtacatgaactcggggcccgtggtggccatggtctgggaggggctcaatgtggtgaaaacgggccgagtgatgctgggggagaccaatccagctgattcaaaaccaggcaccatccgtggggatttctgcattcaagttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtg
【权利要求】
1.一种重组制成的蛋白质构建体，其优先地形成特定的多聚体。
2.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，所述多聚化状态是其生物活性状态。
3.根据权利要求2所述的蛋白质构建体，其中，所述多聚化状态是二聚体。
4.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，所述多聚化状态是其非活性状态。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其中，所述多聚化状态是高阶多聚体。
6.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，所述蛋白质是生长因子。
7.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，所述蛋白质是转录因子。
8.根据权利要求3所述的蛋白质构建体，其中，所述二聚体是同源二聚体或异源二聚体。
9.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，所述蛋白质是哺乳动物蛋白质。
10.根据权利要求9所述的蛋白质构建体，其中，所述蛋白质是人类蛋白质。
11.根据权利要求9所述的蛋白质构建体，其中，所述蛋白质是小鼠蛋白质。
12.根据权利要求3所述的蛋白质构建体，包含两种单体或所述单体的片段。
13.根据权利要求12所述的蛋白质构建体，其中，所述两种单体或所述单体的片段是通过接头肽连接在一起的，由此形成单体-接头-单体构建体。
14.根据权利要求13所述的蛋白质构建体，其中，所述单体是生长因子或转录因子。
15.根据权利要求14所述的蛋白质构建体，其中，所述单体为匪23。
16.根据权利要求15所述的蛋白质构建体，其中，所述匪23是Hl、H2或H7。
17.根据权利要求15所述的蛋白质构建体，其中，所述单体是NM23或其突变体，所述突变体偏好形成二聚体并且抑制高阶多聚体的形成。
18.根据权利要求17所述的蛋白质构建体，其中，所述突变体匪23是S120G或P96S或NM23 和 P96S。
19.根据权利要求17所述的蛋白质构建体，其中，所述单体是匪23或其突变体，所述突变体偏好形成二聚体，其中缺失了一至十个C-末端氨基酸。
20.根据权利要求19所述的蛋白质构建体，其中，所述单体是匪23或其突变体，所述突变体偏好形成二聚体，其中缺失了一至六个C-末端氨基酸。
21.根据权利要求13所述的蛋白质构建体，其中，所述接头包括GS、GS2、GS3、IgGl铰链区、或IgG2a铰链区或它们的组合。
22.根据权利要求1 5所述的蛋白质构建体，其为 NM23S120G GS2、
NM23P96S GS2、
NM23P96S/S120G GS2、
NM23P96SAC1GS2、
NM23P96SAC2GS2、
NM23P96SAC6GS2、
NM23P96SAC1/S120G GS2、
NM23P96SAC2/S120G GS2、
NM23P96SAC6/S120G GS2、
NM23S120G GS3、NM23P96S GS3、 NM23P96S/S120G GS3、 NM23P96SAC1GS3、 NM23P96SAC2GS3、 NM23P96SAC6GS3、 NM23P96SAC1/S120G GS3、 NM23P96SAC2/S120G GS3、 NM23P96SAC6/S120G GS3、 NM23S120G IgGlh noC、 NM23P96S IgGlh noC、 NM23P96S/S120G IgGlh noC、 NM23P96SΛ ClIgGlh noC、 NM23P96SAC2IgGlh noC、 NM23P96SAC6IgGlh noC、 NM23P96SAC1/S120G IgGlh noC、 NM23P96SAC2/S120G IgGlh noC、 NM23P96SAC6/S120G IgGlh noC、 NM23S120G IgG2ah noC、 NM23P96S IgG2ah noC、 NM23P96S/S120G IgG2ah noC、 NM23P96SAClIgG2ah noC、 NM23P96SAC2IgG2ah noC、 NM23P96SAC6IgG2ah noC、 NM23P96SAC1/S120G IgG2ah noC、 NM23P96SAC2/S120G IgG2ah noC、 NM23P96SAC6/S120G IgG2ah noC、 NM23S120G IgGlh/IgG2ah noC、 NM23P96S IgGlh/IgG2ah noC、 NM23P96S/S120G IgGlh/IgG2ah noC、 NM23P96SAClIgGlh/IgG2ah noC、 NM23P96SAC2IgGlh/IgG2ah noC、 NM23P96SAC6IgGlh/IgG2ah noC、 NM23P96SAC1/S120G IgGlh/IgG2ah noC、 NM23P96SAC2/S120G IgG2ah noC、或 NM23P96SAC6/S120G IgG2ah noC。
23.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，通过将蛋白质单体重组地连接至第二组件形成所述特定的多聚体。
24.根据权利要求23所述的蛋白质构建体，其中，在所述第二组件之间形成所述特定的多聚体。
25.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件是接头肽。
26.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件是蛋白质或蛋白质片段。
27.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，通过化学键在所述第二组件之间形成所述多聚体。
28.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，通过共价键在所述第二组件之间形成所述多聚体。
29.根据权利要求28所述的蛋白质构建体，其中，所述共价键是二硫键。
30.根据权利要求23所述的蛋白质构建体，其中，所述多聚体是二聚体。
31.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件是IgGl铰链或IgG2a铰链。
32.根据权利要求31所述的蛋白质构建体，其为NM23-S120G-1gGlh、NM23-S120G-1gG2ah 或NM23S120G IgGlFc0
33.根据权利要求24所述的蛋白质构建体，其中，通过非共价键在所述第二组件之间形成所述多聚体。
34.根据权利要求33所述的蛋白质构建体，其中所述第二组件是具有结合至另一种蛋白质的闻未和力的蛋白质。
35.根据权利要求34所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件是抗体Fos或Jun的Fe区的全部或部分。
36.根据权利要求35所述的蛋白质构建体，其中，所述Fe区是IgGlFc。
37.根据权利要求34所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件能够同源二聚化。
38.根据权利要求34所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件能够异源二聚化。
39.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中，在所述蛋白质中插入半胱氨酸以通过二硫键促进多聚体形成。
40.根据权利要求26所述的蛋白质构建体，其中，所述第二组件是IgM抗体的Fe结构域的片段。
41.根据权利要求1、12、13、24、33或39所述的蛋白质构建体，其包含促进进入细胞或进入所述细胞的细胞核的氨基酸序列。
42.根据权利要求1、12、13、24、33或39所述的蛋白质构建体，其包含促进所述蛋白质构建体从其表达的宿主细胞中分泌的氨基酸序列。
43.一种分离的核酸，包含编码根据权利要求1、12、13、24、33或39所述的蛋白质的核酸序列。
44.根据权利要求43所述的核酸，其中，所述核酸进一步包含编码促进进入细胞或进入所述细胞的细胞核的氨基酸序列的序列。
45.根据权利要求43所述的核酸，其中，所述核酸进一步包含编码促进所述蛋白质从其表达的宿主细胞中分泌的氨基酸序列的序列。
46.根据权利要求43 所述的核酸，其中，所述核酸包含编码NM23或其偏好二聚体形成的突变体的核酸。
47.一种表达载体，包含根据权利要求43所述的核酸。
48.根据权利要求47所述的载体，其为质粒。
49.根据权利要求47所述的载体，其中，所述载体是病毒。
50.一种宿主细胞，包含根据权利要求47所述的载体。
51.一种用于增殖细胞的方法，包括用根据权利要求47所述的载体转染或转导所述细胞。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述细胞是干细胞或祖细胞。
53.一种用于在体细胞中诱导多能性的方法，包括使用根据权利要求47所述的载体转染或转导所述细胞。
54.一种用于治疗患者的方法，所述患者患有可以通过给予未成熟细胞的治疗而得到缓解的病症，所述方法包括: (i)用根据权利要求47所述的载体转染或转导宿主细胞以获得干细胞、祖细胞或iPS细胞；以及 (ii)将所获得的干细胞、祖细胞或iPS细胞给予到所述患者体内。
55.根据权利 求54所述的方法，其中所述载体中原属于所述细胞的一个或多个基因的核酸序列被修饰。
56.一种用于改变靶基因的表达的方法，包括下列步骤: (i)制备编码转录因子变异体的核酸；以及 (?)使所述核酸进入靶细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，进一步包括步骤(iii):设计所述核酸以插入在接近所述靶基因的启动子位点的位置处。
58.根据权利要求56所述的方法，其中，所述靶细胞是干细胞或祖细胞。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述祖细胞是造血细胞。
60.根据权利要求58所述的方法，其中，所述祖细胞是B细胞或B细胞前体。
61.根据权利要求56所述的方法，包括工程改造所述转录因子的多聚化状态以使如果需要表达所述目标基因则促进活性状态，如果需要抑制所述目标基因则促进不处于活性状态。
62.一种治愈或缓解疾病的方法，所述疾病能够受益于增加产生的干细胞或祖细胞，该方法包括向患有疾病、遗传缺陷或不健康病症或具有发展疾病、遗传缺陷或不健康病症的风险的患者给予权利要求44或45所述的细胞。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述细胞是受精卵或未受精卵。
64.根据权利要求62所述的方法，其中，所述细胞是干细胞或祖细胞。
65.根据权利要求62所述的方法，其中，所述细胞获自待治疗的所述患者。
66.根据权利要求62所述的方法，其中，所述细胞是iPS细胞。
67.根据权利要求66所述的方法，其中，所述iPS细胞来自待治疗的所述患者。
68.一种用于识别偏好二聚化并且抵抗形成高阶多聚体的生长因子突变体的方法，包括测定所述生长因子对靶受体的结合的亲和力，其中高阶多聚体不能以与所述二聚体相同的亲和力结合到所述靶受体。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，所述生长因子是匪23并且所述靶受体是MUC1*。
70.根据权利要求69所述的方法，其中，所述靶受体是MUC1*胞外域肽，其基本上由具有 GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVS VSDVPFPFSAQSGA (SEQ ID NO:1)序列的 PSMGFR肽组成。
71.根据权利要求4所述的蛋白质，所述蛋白质被基因工程改造以抵抗二聚体形成。
72.根据权利要求71所述的蛋白质，所述蛋白质被基因工程改造以偏好形成高阶多聚体。
73.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述蛋白质被基因工程改造以偏好形成四聚体、五聚体或六聚体。
74.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述高阶多聚体包含基因融合至IgM抗体的所述蛋白质Fe部分。
75.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是生长因子。
76.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是匪23。
77.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是转录因子。
78.根据权利要求72所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是p53。
【文档编号】C12N15/00GK103930439SQ201280034119
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年5月8日 优先权日:2011年5月9日
【发明者】辛西娅·巴姆达德, 贝努瓦·J·斯马格 申请人:米纳瓦生物技术公司