专利名称：用于检测莱姆病螺旋体的环介导等温扩增法的制作方法
技术领域：
本发明涉及莱姆病螺旋体的检测，具体地说，涉及用于检测莱姆病螺旋体的环介导等温扩增法。
背景技术：
莱姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋体(Bolrelia burgdorferi)弓丨起的一种慢性自然疫源性疾病。伯氏疏螺旋体是ー种单细胞的革兰氏阴性螺旋体。该病主要是通过节肢动物蜱的叮咬在宿主动物与宿主动物及人之间传播。莱姆病临床表现初期多有典型皮肤损害--慢性游走性红斑(ECM)，同时伴有头痛、发热、寒战、疲乏不适.局部淋巴结肿大等症状，后期表现为神经系统、循环系统、运动系统等呈间歇性、交替性出现的各种损害。具有分布广、病程长、病死率较高等特点。如能早期诊断、早期治疗常可痊愈，否则会出现严重并发症。因此开发莱姆病螺旋体的早期快速检测技木，对莱姆病早期诊断、早期治疗具有重要的意义。目前莱姆病的主要诊断方法包括病原学检测和特异性抗体检测。病原学检测包括直接镜检法、病原分离培养、多聚酶链反应(PCR)和荧光定量PCR(real-time PCR);常用的特异性抗体检测包括间接免疫荧光抗体法(IFA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白免疫印迹法(WB)。直接镜检法需要操作者具备丰富的检验经验，然而对于混合感染的情况，则无法检测到，而且该法容易漏检，与其他诊断方法相比，直接检查的检出率相对较低。病原分离培养法的分离率低，耗时较长，敏感性差。IFA只能检测到菌体表面的抗原，灵敏度和特异性都比较低，且IFA受实验因素影响大，易造成假阳性或假阴性。ELISA主要对莱姆病特异抗体IgG进行检测，传统ELISA检测方法，存在非特异反应，虽然灵敏度高，但缺乏特异性，易误诊。WB可以判断和验证IFA和ELISA的真假阳性，但由于莱姆病螺旋体有不同的致病基因型，而这几种基因型在世界各地的分布又有所不同，因此各国应根据实际情况，制定出针对本国流行的基因型的WB阳性诊断标准，而且WB的操作比较复杂，不利于推广。PCR技术的不足之处在于(I)靶基因易被污染；(2)易出现非特异性扩増；(3)扩增反应易受多种因素的影响；(4)需要投入比较昂贵的精密仪器(如PCR仪、凝胶电泳仪及凝胶成像系统)；耗时长，需要2 3h的反应时间和I 2h的电泳时间。这些均不利于现场的快速检测，给技术的基层推广造成了极大障碍。2000年Notomi等开发了一种新的核酸等温扩增方法，即环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),其特点是在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶基因序列。目前LAMP技术主要应用于病原微生物的快速检测，包括病毒、细菌、真菌、支原体、寄生虫等，在临床疾病诊断、食品卫生检验及环境监测方面应用广泛，另外，LAMP也应用于动物胚胎的性别鉴定、肿瘤的基因检测及原位扩增等。然而未见利用LAMP技术进行莱姆病螺旋体检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种便于基层推广使用的检测莱姆病螺旋体的环介导等温扩增法。本发明的另一目的是提供用于检测莱姆病螺旋体的LAMP引物及含有该引物的试剂盒。为了实现本发明目的，本发明的ー种用于检测莱姆病螺旋体的LAMP引物组，其包括外侧正向引物F3 :5 ’ -GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3 ’ ；外侧反向引物B3 :5’ -CACCAGCGTCACTTTCAG-3’ ；以及 内侧正向引物 FIP : 5 ’ -TGCAAATCTATTCTCTGGCGAAGGTTGAGCACCTTCTTGAACA-3 ’ ；内侧反向引物BIP :5’ -ACAGCAATCGCTTCATCTTGATTCTCAAGCTTCTTGGACC-3’。本发明还提供含有上述LAMP引物组的用于检测莱姆病螺旋体的试剂盒，其中所述试剂盒包括引物FIP、BIP、F3和B3。前述试剂盒中还包括Bst DNA聚合酶和/或反应缓冲液。更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明进一歩提供用于检测莱姆病螺旋体的环介导等温扩增法，包括步骤1)提取样品中的DNA ;2)以步骤I)中提取的DNA为模板，使用上述LAMP引物组，进行LAMP扩增反应；3)分析产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是否含有莱姆病螺旋体。其中，LAMP反应体系以25 μ I计为
模板DNA2μ1 20μΜ 引物FlP2μ20μΜ 引物BIP2μ! ΙΟμΜ引物F30.5μ1 ΙΟμΜ引物Β30·5μ1
8υ/μ1 Bst DNA 聚合酶Ιμ
2 X Reaction Mix12.5μ!ddH.O补足至 25μ1。LAMP反应条件为59-66 °C (优选63 °C ) 60分钟，冰上终止反应。用上述引物组对待测样品DNA进行恒温扩增，若电泳检测结果出现梯状DNA条带，则该样品含有莱姆病螺旋体，若没有扩增出条带，则该样品中不含莱姆病螺旋体。本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于莱姆病螺旋体的快速检测，可从疑似病人血清中准确地检测出莱姆病螺旋体。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR更高，可对不同致病基因型的莱姆病螺旋体进行检測，对莱姆病的早期诊断、早期治疗等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。
图IA和图IB为本发明LAMP引物组恒温扩增结果；其中，图IA中泳道1_5分别为莱姆病螺旋体B31、PD91、Fuji、FPU QX-S13，NC为阴性对照，图IB泳道I为TO91，泳道2-12为8种立克次体属的菌株和钩端螺旋体、 布鲁氏菌、大肠埃希菌共11种对照菌株。图2为LAMP引物组恒温扩增反应体系灵敏度检测结果，其中，A1-A7分别代表重组质粒浓度为 I. OX IO6Copies/ μ 1、1· OX IO5Copies/ μ 1、1· OX IO4Copies/ μ I、1.0Χ IO3Copies/ μ 1、1· OX IO2Copies/ μ 1、1· OX IO1Copies/ μ 1、1· OX IO0Copies/ μ I。图3为普通PCR扩增反应体系灵敏度检测结果，其中，M为IOObp Ladder, 1-7分别代表重组质粒浓度为 I. OX IO6Copies/ μ 1、1· OX IO5Copies/ μ 1、1· OX IO4Copies/ μ I、
I.O X IO3Copies/ μ I、I. O X IO2Copies/ μ I、I. OX IO1Copies/ μ I、I. OX IO0Copies/ μ I, 8为阴性对照。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，如SambiOOk等分子克隆实验手册(New York Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技术规程,或按照制造厂商所建议的实验条件。实施例I用于检测莱姆病螺旋体的LAMP弓I物组的合成使用B31、PD91、Fujji, FPU QX-S13共5种莱姆病螺旋体菌株进行用于检测莱姆病螺旋体的LAMP引物的筛选。B31、Fuji购自美国ATCC，PD91、FP1、QX-S13由中国疾控中心传染病所分离培养保存。使用日本荣研loopamp DNA扩增试剂盒(商品编号18001)，选取常用于 PCR 扩增反应的基因位点(fla、16SrDNA、rrf_rrl spacer、hbb、recA、ospA、ospC、groEL),用PrimerExplorer V4在线软件设计LAMP引物并合成參数好的引物。用培养的B31、PD91、Fuji、FPl、QX-S13莱姆病螺旋体菌株筛选引物，相同条件下能使这5种菌株尽早达到阳性且峰高的引物为最佳引物。本发明的最佳引物为根据fla基因设计的引物。从GenBank数据库中找到PBi-58125 (莱姆病螺旋体Brrelia gar ini i基因型的国外參考菌株)的全基因组序列，GenBank登录号为NC_006156，并利用fla基因的普通PCR引物(正向引物5’ -AACACACCAGCATCACTTTCAGG-3，，反向引物5’ -GATTWGCRTGCGCAATCATTGCC-3’ )在DNAstar中找出fla的基因序列，根据此序列利用PrimerExplorer V4在线软件设计LAMP引物，微调參数，GC含量从30% -65%调整为40% -65% ;5’ 末端 dG 将-3 改为-4。最終确定用于检测莱姆病螺旋体的LAMP引物组，其包括外侧正向引物 F3 :5 ’ -GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3 ’ ；外侧反向引物B3 :5 ’ -CACCAGCGTCACTTTCAG-3 ’ ；以及内侧正向引物 FIP : 5 ’ -TGCAAATCTATTCTCTGGCGAAGGTTGAGCACCTTCTTGAACA-3 ’ ；内侧反向引物BIP :5’ -ACAGCAATCGCTTCATCTTGATTCTCAAGCTTCTTGGACC-3’。弓丨物合成由上海生物工程有限公司完成。实施例2利用LAMP引物组检测莱姆病螺旋体的特异性分析
I. I试剂和设备水浴锅，LAMP试剂盒购自日本荣研公司。I. 2样本来源本实施例中采用的5种莱姆病螺旋体菌株、8种立克次体属的菌株和钩端螺旋体、布鲁氏菌、大肠埃希菌(表I)保存于中国疾控中心传染病所或中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。 表I用于LAMP检测的样本来源
编号_拉丁名_中文名_来源■
1B. burgdorferi sensu strict.。狭义伯氏螺旋体B31 ATCC 2B. garirrn伽氏疏螺旋体PD91中国
3B.garinii伽氏疏螺旋体FujiATCC
4B.afzelii阿弗西尼疏螺旋体FPI 中国
5B.valaisiana法雷斯疏螺旋体QX-S13 中国
6Rickettsia conorii斑点热立克次体中国
7Rickettsia slovaca斑点热立克次体中国, η
8Rickettsia hone斑点热立克次体中国
9Coxiella burnettii贝纳柯克斯体中国
10Orientia tsutsu^amushi东方春虫病中国
11Bartonella Quintana巴尔通体中国
12Ehrlichiachaffeemis埃立克体中国
13Anaplasma DhagocytophUum无形体—国
14Leptospira spp钩端螺旋体中国
15Brucellosis bacteria布鲁氏菌中国
16Escherichia coli大肠埃希菌中国1.3 UNA 提取热裂解法提取莱姆病螺旋体菌株DNA :将适量菌株接种BSKII培养基，33 °C培养7天，将培养好的菌株12000rpm离心30分钟收集菌体，去上清；然后用PBS重悬洗涤，12000rpml离心30分钟，PBS洗涤三遍，去上清；然后加适量ddH20重悬，100°C金属浴煮10分钟后3500rpm离心5分钟，留取上清，4°C保存备用。对照菌株DNA采用QIAGEN公司的DNA提取试剂盒(商品编号69506)提取。I. 4 LAMP 反应
反应体系(25μ I)
模板DNA2μ1
20μΜ 引物FIP2μ1
20μΜ 引物BIP2μ!
ΙΟμν{引物F30.5μ1
ΙΟμΜ引物Β30.5μ!
SU/μΙ Bst 酶ΙμΙ 2 x Reaction Mix12.5μ!
CidH2O补足至 25μ1。LAMP反应条件为63°C，60分钟，冰上终止反应。I. 5 结果对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳检测结果如图IA和图IB所示，图IA泳道1-5为莱姆病螺旋体样品，均能扩增出梯状条带；而图1B，泳道I为莱姆病螺旋体菌株PD91，能扩增出梯状条带，泳道2-12为8种立克次体属的菌株和钩端螺旋体、布鲁氏菌、大肠埃希菌，以及阴性对照(NC)均不产生条带。该结果表明本发明引物组的特异性较好。
实施例3利用LAMP弓I物组检测莱姆病螺旋体的灵敏度分析用LAMP外引物F3、B3作为引物PCR扩增TO91的fla基因，采用OMEGA公司的凝胶 提取试剂盒(商品编号D2500-01)胶回收纯化PCR产物。然后用Takara公司的PMD-18TVector试剂盒(商品编号D102A)将纯化的DNA与PMD-18T Vector连接，16°C水浴连接4小吋，然后转化到大肠杆菌感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司，简称天根公司)中。然后将大肠杆菌接种至含氨节西林(0. lmg/ml)的LB固体培养基中，37°C培养过夜，将长出的单个菌落分别扩大培养，然后采用天根公司的质粒提取试剂盒(商品批号J9110)提取质粒并进行克隆鉴定和浓度測定。将阳性克隆质粒的浓度换算成质粒拷贝数，采用的公式为
細样品中检测基因的拷贝数(οορ16φ1)=浓度(邶細)樣加德罗常数Xが然后用双蒸水将质粒稀释到I. OX IO6Copies/ μ 1-1. OX IO0Copies/ μ I,共7个浓度梯度。然后采用日本荣研公司的loopamp DNA扩增试剂盒进行LAMP反应确定该LAMP方法的最低检测下限，即敏感度。结果表明LAMP的敏感度可达到IO1c0Pies/μ I (图2)，而普通PCR (引物为LAMP外引物F3和B3)的敏感度为IO2Copies/ μ I (图3)。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作ー些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.用于检测莱姆病螺旋体的LAMP引物组，其特征在于，其包括 外侧正向引物 F3 :5’ -GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3’ ； 外侧反向引物 B3 :5’ -CACCAGCGTCACTTTCAG-3’ ；以及 内侧正向引物 FIP :5’ -TGCAAATCTAITCTCTGGCGAAGGITGAGCACCTTCTTGAACA-3’ ； 内侧反向引物 BIP :5’ -ACAGCAATCGCTTCATCTTGAITCTCAAGCTTCTTGGACC-3’。
2.含有权利要求I所述LAMP引物组的用于检测莱姆病螺旋体的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括BstDNA聚合酶和/或反应缓冲液。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.用于检测莱姆病螺旋体的环介导等温扩增法，其特征在于，包括以下步骤 1)提取样品中的DNA； 2)以步骤I)中提取的DNA为模板，使用权利要求I所述的LAMP引物组，进行LAMP反应； 3)分析LAMP产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，LAMP反应体系以25yl计为模板DNA2^1 20|iiM 引物 FlP2)iii 20_ 引物BIP2pl I OmM 引物 F30.5^1 1OpM 引物 B30.5)iii 8U/4 Bst DNA聚合酶I叫 2X Reaction Mixi2.5f.ii ddH20补足至 25pl。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，LAMP反应条件为59-66°C，90分钟，冰上终止反应。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，LAMP反应条件为63°C，60分钟，冰上终止反应。
全文摘要
本发明提供一种用于检测莱姆病螺旋体的环介导等温扩增法，其是采用引物FIP和BIP以及F3和B3(如Seq ID No.1-4所示)对待测样品DNA进行恒温扩增反应。本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于莱姆病螺旋体的快速检测，可从疑似病人血清中准确地检测出莱姆病螺旋体。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR更高，可对不同致病基因型的莱姆病螺旋体进行检测，对莱姆病的早期诊断、早期治疗等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。
文档编号C12Q1/04GK102703587SQ20121015725
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者侯学霞, 张刘丽, 耿震, 郝琴 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所