专利名称：梅花ssr遗传图谱的构建方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、遗传学和基因组学领域，具体地说，涉及梅花SSR遗传图谱的构建方法。
背景技术：
梅花(Prunus mume Sieb. et Zucc.)属于蔷薇科李属，原产于我国川、滇、藏、贵等地区，已有3000多年的栽培历史，是我国重要的木本观赏花卉。但是由于缺乏大量的多态性分子标记，其遗传学和基因组学方面的研究滞后于蔷薇科其他植物。目前在木本观赏花卉的遗传学分析中，应用较多的主要是RAPD、ISSR、AFLP等分子标记，但是这些标记大多是采用无全基因组序列信息的技术开发得到，虽然具有一定的应用价值，但是随机性强、稳定性差。而简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)标记,也称为微卫星DNA(Macrosatellite)，是ー种由1_6个核苷酸为单位多次串联重复的长达几十甚至几百个核苷酸的序列。由于SSR标记具有重复性好、稳定性强、多态性高、共显性遗传和在基因组中普遍存在等优点，广泛应用于植物遗传图谱的构建、品种鉴定、遗传多样性分析、DNA指纹图谱的构建和分子标记辅助育种等研究。随着测序技术的发展和成本的降低，许多的植物均已完成全基因组测序，在此基础上便于对这些植物进行全基因组SSR标记的挖掘和分析。由于将基因组的所有SSR位点对备选材料进行逐个分析，需要耗费大量的人力和物力，所以在小麦、甘蓝、棉花和玉米等作物中采用核心引物(全基因组染色体上均匀覆盖并且多态性、稳定性、重复性等综合特征好、可作为初步研究优先选用的ー套引物)进行研究，有助于提闻SSR技术的检测效率。因此开发基于梅花全基因组序列的SSR核心引物组，有助于高效的构建梅花的遗传图谱，开展与重要观赏性状相关的QTL定位，从而推动梅花分子标记辅助育种的进程。
发明内容
本发明的目的是提供ー种梅花SSR遗传图谱的构建方法。本发明的另一目的是提供一套基于梅花全基因组序列开发的SSR引物组。本发明的再一目的是提供一套基于梅花全基因组序列开发的SSR核心引物组。为了实现本发明目的，本发明的ー种梅花SSR遗传图谱的构建方法，包括以下步骤1)提取待测梅花亲本与子代的基因组DNA ;2)利用生物学软件，在梅花全基因组序列中，挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记，并分别针对这些SSR标记设计SSR引物；3)分别利用上述SSR引物，各自以待测梅花亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；4)利用生物学软件分析PCR扩增結果，构建出梅花SSR遗传图谱。前述方法中，所述待测梅花亲本是以梅花品种‘粉瓣’为母本，以‘扣子玉蝶’为父本。前述方法中，步骤2)中挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记的标准为单核苷酸重复单元最小的重复长度为10bp，二核苷酸到四核苷酸重复单元最小的重复长度为12bp，五核苷酸重复单元最小的重复长度为15bp，六核苷酸重复单元最小的重复长度为18bp0前述方法中，步骤2)中设计的SSR引物如序列表中所示的670对引物，优选序列表中所示的144对核心引物。 前述方法中，步骤3)中进行PCR扩增反应之前，分别用FAM、HEX和TEMRA三种荧光对序列表中所示的144对核心引物的上游引物进行荧光标记。前述方法中，所述步骤4)为利用生物学软件分析PCR扩增结果，利用卡平方检验作图群体符合孟德尔期望分离比为I : 2 : 1、1 : I或I : I : I : I的标记，P <0.05，过滤掉SSR标记中偏分离的标记，构建出梅花SSR遗传图谱。具体地，本发明提供的基于梅花全基因组序列开发的SSR引物及其应用的方法，其包括如下步骤 I、构建梅花Fl代拟测交群体；2、对父母本及其190个子代进行基因组DNA的提取；3、利用MISA软件，在梅花全基因组序列中，挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记；4、从中随意挑选出670个含有SSR标记的核苷酸序列，利用Primer 3. O软件设计670对SSR引物(如序列表所示);5、利用上述引物在父母本及6个子代中进行核心引物组的筛选，综合考虑引物重复性、扩增条带清晰度等因素，最終确定144对引物为梅花核心引物组(如序列表中所示核心引物)，可用于构建梅花SSR遗传图谱；6、将所获得的144对核心引物组分别用FAM、HEX和TEMRA三种荧光对其上游引物进行荧光标记；7、利用荧光标记的SSR引物，对父母本及其190个子代进行PCR的扩增，在ABI3730DNA自动测序仪上对扩增产物进行检测，利用GENEMAPPER 3. 7进行图像的分析和数据的收集；8、利用Joinmap4. I软件对数据的统计结果进行分析，利用卡平方检验作图群体是否符合孟德尔期望分离比为I : 2 : 1、1 : I或I : I : I : I的标记，P < O. 05，过滤掉SSR分子标记中偏分离的标记，利用JoinMap4. I的软件，设置LOD值彡3，构建梅花SSR遗传图谱。利用本发明的基于梅花全基因组序列开发的670对SSR分子标记引物如序列表所示，在以梅花品种‘粉瓣’为母本，以‘扣子玉蝶’为父本进行杂交，构建F1代拟测交群体中，筛选出144对SSR引物核心组，分别对其上游引物进行FAM、HEX和TEMRA三种荧光的标记，然后在ABI3730DNA自动测序仪上对扩增产物进行检测，利用GENEMAPPER 3. 7进行图像的分析和数据的收集，最后利用Joinmap4. I软件对数据的统计结果进行分析，构建梅花SSR遗传图谱(图I)。利用本发明的梅花SSR核心引物组可以进行梅花遗传图谱的构建、遗传多祥性分析、品种鉴定、指纹图谱构建和分子标记辅助育种。本发明的优点在于，提供了 670对基于梅花全基因组序列开发的SSR引物组的序列，其中包括144对梅花的SSR引物核心组的序列，建立了梅花SSR分子标记的技术体系，井利用该144对核心引物组首次构建了梅花SSR遗传图谱，有助于开展梅花重要观赏性状的QTL定位，加快梅花分子标记辅助育种的进程。
图I显示了采用本发明方法构建得到的梅花遗传图谱LGl LG8连锁群。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例I梅花遗传作图群体的构建根据作图亲本选配原则，以结实率高,柱头发育良好的梅花品种‘粉瓣’为母本，散 粉量大，花粉生活力高的梅花品种‘扣子玉蝶’为父本。在父本初花期与盛花期吋，选取无病虫害及生理缺陷的枝条上大蕾与中蕾期的花蕾，将花药剥离平铺在硫酸纸上，室温(25°C)湿度(35%以下)，自然散粉20小吋，4°C保存备用。在母本初花期，选择生长健壮的中短花枝，适当修剪，用医用镊子小心地将雄蕊去除，去雄完成后，在9-17吋，柱头上具有粘液时，用毛笔蘸取花粉涂于柱头，完成授粉，计数并挂牌，马上套袋隔离，共杂交2120朵花。果实发育115天时，人工采收，共采收561粒杂交种子，将收获的果实去除果肉后，将种子取出，洗浄，晾干，置于4°C冷库中砂藏催芽；将露白342粒种子播种于花盆中，待其生长到20-30cm时将310棵杂种苗移栽到大田中，注意水肥养护及病虫害防护。实施例2基于梅花全基因组序列开发的SSR核心引物组的获得I. I基于梅花全基因组序列的670对SSR引物的开发在利用Illiumina公司的Solexa测序技术完成梅花全基因组测序的基础上,使用MISA(MIcroSAtellites identification tool, http://pgrc.ipk_gatersleben.de/misa)计算机程序，在梅花全基因组序列中搜寻1-6个核苷酸重复单元的微卫星标记，采用的标准如下单核苷酸重复单元最小的重复长度为10bp，二核苷酸到四核苷酸重复单元最小的重复长度为12bp，五核苷酸重复单元最小的重复长度为15bp，六核苷酸重复单元最小的重复长度为18bp，总之在梅花全基因组中共有184629微卫星标记，见表I。从梅花全基因组的184629个微卫星标记中，随机选取含有微卫星重复单兀的670个核苷酸序列，利用Primer
3.O进行引物设计，见表2。表ISSR重复单元在梅花基因组中的分布情况重复单元的SSR标记的相对GC含量 SSR的密度
_类型_数量_频率_百分比_(SSR/Mb)—
单核苷酸67J8336.43.8283.5
二核苦酸42,29122.934.2178.4
三核苷酸24,23713.132.6102.权利要求
1.梅花SSR遗传图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤 1)提取待测梅花亲本与子代的基因组DNA; 2)利用生物学软件，在梅花全基因组序列中，挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记，并分别针对这些SSR标记设计SSR引物； 3)分别利用上述SSR引物，各自以待测梅花亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增； 4)利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建出梅花SSR遗传图谱。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述待测梅花亲本是以梅花品种‘粉瓣’为母本，以‘扣子玉蝶’为父本。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记的标准为单核苷酸重复单元最小的重复长度为10bp，二核苷酸到四核苷酸重复单元最小的重复长度为12bp，五核苷酸重复单元最小的重复长度为15bp，六核苷酸重复单元最小的重复长度为18bp。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中设计的SSR引物如序列表中所示的670对引物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中设计的SSR引物如序列表中所示的144对核心引物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中进行PCR扩增反应之前，分别用FAM、HEX和TEMRA三种荧光对所述144对核心引物的上游引物进行荧光标记。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤4)为利用生物学软件分析PCR扩增结果，利用卡平方检验作图群体符合孟德尔期望分离比为I : 2 : 1、1 : I或1:1:1: I的标记，P < 0.05，过滤掉SSR标记中偏分离的标记，构建出梅花SSR遗传图谱。
全文摘要
本发明提供了梅花SSR遗传图谱的构建方法，其是基于梅花全基因组序列信息开发出SSR引物组的引物序列和扩增方法，所述引物组包含670对SSR引物，并从中筛选出144对核心引物组，用于构建梅花遗传图谱。本发明建立了梅花的SSR分子标记技术体系，获得的SSR核心引物组能够反映出其稳定性、共显性，在基因组中普遍存在，便于统计等优点。利用该套标记可以进行梅花遗传图谱的构建、遗传多样性分析、品种鉴定和分子标记辅助育种等研究，推动梅花遗传学和基因组学的发展。
文档编号C12N15/11GK102703586SQ20121015691
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者孙丽丹, 张启翔, 李旭东, 杨炜茹, 王佳, 禄久幸, 程堂仁 申请人:北京林业大学